ESCUELA SUPERIOR POLITCNICA DEL LITORAL

FACULTAD DE INGENIERIA MECNICA Y CIENCIAS DE LA PRODUCCIN

INGENIERA EN ALIMENTOS

TEMA:
Microscopio Electrnico


INTEGRANTES:
Silvia Dayana Moreano Guijarro
Kristhian Luis Iniguez Gomez
Daniel Alfredo Santos Palomino


PROFESORA: Msc. Mara Fernanda Morales Romo Leroux
FECHA DE ENTREGA: Lunes, 16 de Junio del 2014.


TRMINO I
2014-2015
INTRODUCCIN
Histricamente el microscopio fue el primero que permiti revelar los secretos de la estructura
celular y todava hoy contina siendo un instrumento muy valioso en biologa celular.
La microscopia es la tcnica de producir imgenes viables de estructuras o detalles demasiado
pequeos para ser percibidos a simple vista. En la microscopia se evidencian los grandes
aportes que la fsica ha hecho a la biologa y como esta ha ido dando lugar a nuevos cambios
en el desarrollo de otras ciencias.
El estudio detallado de los componentes de clulas y tejidos animales o vegetales, por el
tamao que poseen, requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar muchas veces ms
la imagen de las estructuras que los constituyen.
El instrumento que fue empleado por los primeros bilogos para estudiar la clula y los
tejidos, es el microscopio. El nombre deriva etimolgicamente de dos races griegas: mikrs,
que significa pequeo y skopoo, que significa observar. Es decir el microscopio es un
instrumento que sirve para observar objetos o estructuras pequeas.
Existen dos tipos de microscopios, el de luz (ptico) y el electrnico, segn el principio en que
se base la amplificacin. Para el examen microscpico de los microorganismos se puede
utilizar el microscopio ptico o el microscopio electrnico.
El desarrollo del microscopio electrnico es uno de los mayores logros de fsica aplicada del
siglo XX, y ha venido a revolucionar el conocimiento en diversas ramas.
Sin este instrumento no sera posible estudiar la estructura interna de microorganismos como
las bacterias o la forma y tamao de los virus. Con l se consiguen aumentos de hasta 500.000
dimetros, de manera que permite ver estructuras aun de tamao molecular, el poder de
resolucin es muchsimo mayor al del microscopio ptico.
El microscopio electrnico funciona mediante un principio similar al del microscopio ptico.
Utiliza un flujo de electrones en lugar de un haz de luz. El haz de electrones es enfocado por
lente electromagnticos y el objeto en estudio se interpone de manera que interacta con
dicho haz y se proyecta una imagen que se registra en una pantalla sensible a los electrones.
Es decir, la imagen de los objetos no se observa directamente, como en el microscopio de luz,
sino que la imagen se forma en una pantalla. De la imagen se obtienen electromicrografias las
cuales son muy tiles para llevar a cabo estudios especializados sobre los detalles estructurales
del objeto que se est analizando.
Existen varios tipos de microscopia electrnica: microscopa electrnica de transmisin,
microscopa electrnica de barrido, microscopia de fuerza atomica.
Por la naturaleza de este instrumento, solo en objetos extremadamente delgados se pueden
observar detalles estructurales internos. Por lo tanto se requiere de tcnicas especializadas
para preparar muestras por observar.
A pesar de las grandes ventajas que ofrece la microscopia electrnica, tambin tiene sus
limitaciones. Por ejemplo, las clulas no se pueden estudiar vivas. Adems, los procedimientos
de preparacin de la muestra pueden alterar algunas de las caractersticas de las clulas.
Debido a esto los resultados de la microscopia electrnica deben ser interpretados solo por los
especialistas en este campo y con ciertas preocupaciones.
Estos tipos de microscopios se utilizan para propsitos especiales o en el desarrollo de trabajos
de investigacin. Sin embargo, los estudiantes conocemos de sus aplicaciones porque cada uno
tiene propiedades convenientes para demostrar estructuras morfolgicas especficas y porque
adems es un instrumento que formar parte en el desarrollo prctico y experimental de
nuestra especializacin.
A partir de nuestra investigacin se pudo conocer sobre el funcionamiento del microscopio
electrnico, se estudiaron sus componentes mecnicos, sus sistemas pticos y de iluminacin,
su amplificacin y poder de resolucin y los tipos de microscopios tanto pticos como
electrnicos que se utilizan en la actualidad. Se pudieron establecer diferencias entre ambos
microscopios y cules son sus funciones en el desarrollo de la investigacin microbiolgica.
Se concluy que el microscopio es un instrumento utilizado no solo en las reas de biologa y
microbiologa sino en todas las ciencias experimentales que han logrado un gran avance
tecnolgico en nuestra vida diaria y que gracias a este se podrn seguir dando nuevos cambios
y descubrimientos en todas las reas cientficas.

CUERPO DE LA INVESTIGACIN
MICROSCOPIO ELECTRNICO
El microscopio electrnico tiene una capacidad mxima de mostrar detalles de la imagen de un
objeto (poder de resolucin), cuando entre ellos existe una distancia aproximada de 0.2 de
micrmetro. Este tipo de microscopio es incapaz de ofrecer un poder de resolucin mayor
porque existen dos factores limitantes: la longitud de onda de la energa luminosa utilizada y
la apertura numrica (A.N.) de la lente del objetivo.
La nica manera de aumentar el poder de resolucin de un microscopio era encontrar energa
radiante con longitudes de onda menores a las que posee el espectro radiante visible.
En 1930, el fsico De Broglie, basndose en estudios tericos predijo que los electrones,
emitidos bajo ciertas circunstancias, como en el vaco, por ejemplo, podan desplazarse y
comportarse como ondas de energa. Comprobada esta teora, entre 1932 y 1934, Knoll y
Ruska, junto con otros cientficos desarrollaron un microscopio electrnico, en el que
mediante la aplicacin de energa elctrica de alto voltaje a un electrodo metlico, se emitan
haces de electrones con longitudes de onda que en un principio no lograron sobrepasar el
poder de resolucin del microscopio electrnico pero que, en el ao de 1938, despus de una
serie de innovaciones como el fabricar y adicionarle un condensador que orientaba,
concentraba y aceleraba la marcha del haz de electrones emitidos, les permiti alcanzar
imgenes con un poder de resolucin cercano a los 10 nanmetros (100). La longitud de onda
de los electrones emitidos por el electrodo metlico (ctodo), depende del voltaje aplicado, es
decir, a mayor voltaje utilizado menor ser la longitud de onda del haz de electrones.
Los haces de electrones emitidos por el ctodo se desplazan en todas las direcciones del
espacio, por lo tanto es necesario reorientarlos y acelerar su desplazamiento. Esto se consigue
con un nodo colocado en las cercanas de la emisin que genera un alto potencial elctrico
positivo.
Funcionamiento del microscopio electrnico
El funcionamiento del microscopio electrnico se basa en dos caractersticas de los electrones:
primera, los electrones presentan propiedades ondulatorias, asocindose la longitud de onda
en forma inversamente proporcional a la velocidad de desplazamiento de estos; segunda, el
rayo de electrones puede ser enfocado pasndolo a travs de un campo magntico.
Cuando un haz de electrones en el vaco incide sobre un objeto, las partculas que lo tocan
pueden ser absorbidas, transmitidas o modificadas de distinta manera sus frecuencias.
Permite evidenciar la estructura biolgica. La imagen se basa en la dispersin de electrones,
que depende del espesor y densidad molecular del objeto y, sobre todo, del nmero atmico.
Tambin se producen electrones secundarios y fluorescencia de rayos X. La fuente de
iluminacin es un haz de electrones procedentes de un ctodo luminiscente. Las lentes son
campos magnticos.
Los tomos de las estructuras biolgicas tienen bajo nmero atmico, por lo que dan poca
imagen y, por ello, se les aaden tomos pesados (tcnica de bombardeo metlico con Osmio,
Uranio, Oro). Tambin se usa la tcnica de coloracin negativa (embebiendo el espcimen con
un material denso como el fosfotungstato).
Tiene ms poder de resolucin que el microscopio ptico. La resolucin aumenta con la
velocidad del electrn y con el voltaje, por tanto. Consigue alcanzar hasta los 200.000
aumentos, con un poder de resolucin inferior a los 10nm. Hay que tener en cuenta que
cualquier partcula puede detener el paso de electrones, con lo que la observacin ha de
realizarse colocando la muestra en un tubo vaco, lo que limita las muestras a analizar. Las
preparaciones deben ser ultrafinas y teidas con sustancias especiales que dispersen bien los
electrones.
Los microscopios electrnicos se clasifican, de acuerdo con la forma en que son expuestos los
detalles del espcimen, en:
Microscopia electrnica de transmisin (TEM)
Microscopia electrnica de barrido, o de exploracin electrnica (SEM)
En los dos primero tipos, los electrones libres son disparados a partir de una fuente y actan
sobre los ncleos atmicos del espcimen, mientras que en los de emisin, el espcimen en si
es la fuente de radiacin.
El microscopio electrnico de emisin no es de gran utilidad para estudios biolgicos; los que
ms se utilizan son el de transmisin y el de rastreo.
Un microscopio ptico ordinario consta de una fuente de luz, un condensador para concentrar
la luz sobre o cerca del objeto, un soporte para el objeto, una lente objetivo para concentrar la
imagen y un ocular para proyectar la imagen formada por el objetivo sobre el ojo, o una
pelcula fotogrfica. Todo es vlido para el microscopio electrnico, con la diferencia de que la
luz esta reemplazada por un haz de electrones, el soporte del objeto es una tela metlica que
se conoce con el nombre de rejilla y las lentes son electroimanes y no lentes de vidrio.
El microscopio electrnico presenta tres caractersticas diferentes del microscopio ptico.
o En primer lugar, como los electrones no pueden recorrer grandes distancias a travs
del aire, toda las columna del microscopio debe encontrarse en condiciones de alto
vaco; en consecuencia el objeto siempre debe estar deshidratado y, por lo tanto,
muerto.
o En segundo lugar debido a que la amplificacin que resulta de una lente
electromagntica es proporcional al campo magntico, que a su vez es proporcional a
la corriente en las bobinas, la amplificacin puede variarse de forma continua variando
la corriente que atraviesa las bobinas de las lentes. En el microscopio la amplificacin
viene fijada por la forma de la lente de vidrio; por lo tanto se necesitan muchos
objetivos para cubrir la escala de aumentos.
o En tercer lugar, ninguna de las aberraciones primarias puede ser corregida en las
lentes en las lentes electromagnticas estndar, porque las lentes magnticas son
siempre convergentes.
Para reducir la aberracin esfrica y mejorar as la calidad de la imagen, las lentes se manejan
con aperturas numricas muy pequeas.
Cmo se logra las amplificaciones en un microscopio electrnico?
La imagen se forma por lo que se denomina con frecuencia como accin sustractiva de la
muestra. Esto es, los tomos del objeto dispersan algunos electrones. La pauta de esta prdida
de electrones, produce el modelo de la imagen (de forma similar a cmo se reduce la
intensidad de la luz por la absorcin del objeto en un microscopio ptico). La lente objetivo,
ajustada de forma que la muestra se encuentre en su punto focal, vuelve a enfocar el haz para
producir una imagen. Esta imagen sufre a continuacin un proceso de amplificacin, en varias
etapas, que se realiza por medio de tres lentes electromagnticas, las lentes de difraccin,
intermedia y de proyeccin. La lente de proyeccin final forma la imagen sobre una pantalla
fluorescente o una placa fotogrfica.
El lmite de resolucin del microscopio ptico es,
aproximadamente, de unos 200nm, el cual no es
suficiente para observar orgnulos celulares, virus
y macromolculas de inters actual. Ello es posible
no obstante, mediante el empleo del microscopio
electrnico, cuyo lmite de resolucin, bajo
condiciones especiales, es menor que el dimetro
de un tomo de uranio (aproximadamente 0.5nm).
Pocos aparatos presentan tan desconcertante
cantidad de botones y contadores como el
microscopio electrnico; adems pocas tcnicas
requieren una mayor habilidad y atencin a los
detalles. Sin embargo, el uso del instrumento es
sencillo en la mayor parte de sus aplicaciones y la
preparacin de muestras no es complicada.



MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN Y DE BARRIDO







Fig. 1.- Relaciones entre los tamaos de diversas muestras y la
resolucin del ojo humano, el microscopio ptico y el microscopio
electrnico.
Fig. 2.- Microscopio electrnico de trasmisin y de
barrido.
Microscopio Electrnico de Transmisin (MET)
El microscopio electrnico ms sencillo es muy similar al microscopio ptico. Ambos tienen
lentes y condensadores para concentrar la iluminacin sobre la muestra. Los rayos de
iluminacin atraviesan la muestra y son enfocados por las lentes del objetivo y de proyeccin
para forma una imagen aumentada sobre una pantalla fluorescente. Sin embargo el
microscopio electrnico es mucho ms complejo.
El desarrollo del MET nace de la necesidad de observar los ms diminutos detalles de las
estructuras biolgicas, lo que se logra por el altsimo poder de resolucin que se obtiene con la
longitud de onda del flujo iluminado de electrones.
El microscopio electrnico de transmisin est constituido bsicamente por cuatro sistemas
que son:
1. Sistema ptico electrnico
2. Sistema de haz de electrones
3. Sistema de deteccin y amplificacin
4. Sistema de exhibicin
Este aparato, al igual que los microscopios pticos, proporciona una imagen en dos
dimensiones; la alta resolucin y magnificacin que se obtiene est en funcin de la utilizacin
de cortes ultrafinos (50-1000 A de espesor), debido a que la formacin de la imagen depende
de los electrones transmitidos.
En fitopatologa, el MET se utiliza bsicamente para conocer las interacciones entre una planta
y sus patgenos, a nivel de ultraestructura. Tambin, con tcnicas especiales, permite el
estudio de partculas de virus, bacterias, etc.
En trminos generales, la preparacin de muestras para ser observadas en el MET consta de
las siguientes fases:
Seleccin adecuada de muestras
Fijacin de las muestras
Pretincin
Infiltracin
Inclusin
Seccionamiento
Tincin
Montaje
Recubrimiento
Observacin
Tambin en este caso los tiempos y concentraciones de todos los compuestos utilizados varan
de acuerdo con la naturaleza del material que se va a observar.
El sistema central del microscopio electrnico incluyendo la pantalla fluorescente y el equipo
fotogrfico, lo constituye un tubo hueco. El equipo elctrico que suministra la corriente
necesaria se halla generalmente situado a una cierta distancia para evitas la interferencia de
los campos magnticos dispersados. La mayora de los microscopios estn equipados con
dispositivos de seguridad que no permiten conectar el filamento de alto voltaje hasta que no
se ha conseguido de vaco apropiado.
Las lentes magnticas del microscopio electrnico estn formadas por imanes en forma de
herradura. El imn puede ser permanente o de tipo electromagntico.
Componentes del microscopio electrnico de transmisin (TEM)
Can electrnico: El tipo ms [usado de can electrnico consiste de un filamento
de alambre de tungsteno doblado en forma de V. El electrodo de control se denomina
cilindro de Wehndt, y tiene una apertura circular de 1 a 3 mm de dimetro centrada en
el pice del filamento. La superficie cncava hace las funciones de nodo, y utilizando
una superficie convexa la imagen de la fuente electrnica puede reducirse en tamao
respecto al electrodo cncavo. La intensidad total de haz de ctodo a nodo puede ser
de 10 a 400 microamperios, pero solamente una pequea fraccin die ste llega hasta
la muestra.
Condensadores: Los idos condensadores son capaces de dar una amplia gama de
intensidad ajustando el can electrnico. Esto reduce el rea iluminada en la
muestra. Sin embargo, otras partes de la muestra tambin sufren los efectos del haz
electrnico. El primer condensador reduce la imagen de la fuente mientras que el
segundo condensador obtiene la adecuada intensidad de iluminacin.
Plataforma para la colocacin de la muestra: La plataforma para colocar la muestra
est situada en frente del objetivo. Se introduce la muestra en la columna del
microscopio a travs de una abertura.
Objetivo: El objetivo es la lente ms importante en el microscopio electrnico. La
distancia focal de esta lente est comprendida entre 1 y 5 milmetros, siendo 1,1 mm
la ms frecuente. Cuanto menor es la distancia focal, mayor es la resolucin. Debido a
que el haz de imagen tiene la mxima apertura angular en el primer objetivo, esta
lente controla la calidad de la imagen producida. Se puede corregir la aberracin
esfrica usando un "stigmator", que es un dispositivo que permite, introducir metal
para compensar la homogeneidad inherente de la lente, y obtener elevada resolucin.
Otro accesorio importante, permite regular la apertura del objetivo, la cual limita la
dispersin de los electrones, evitando as la degradacin de la imagen. Esta apertura
mejora el contraste siendo 20 y 40 micrmetros (pm) los ms frecuentes.
Lente intermedia: La lente intermedia puede aumentar o disminuir la imagen. Se
puede conseguir esto, aumentando o disminuyendo la potencia de la corriente a esta
lente.
Lente de proyeccin: La lente (de proyeccin corresponde al ocular del microscopio
ptico. Su funcin es la de proyectar la imagen real sobre la pantalla fluorescente, y
permite una amplia gama de aumentos. Se puede variar la ampliacin de 100 X hasta
300.000 X usando lentes intermedias y de proyeccin.
Cmara de observacin: La cmara de observacin y la pantalla fluorescente estn
situadas en el fondo de la columna. La imagen se enfoca sobre un punto marcado y el
enfoque fino se consigue con unos binoculares de 6 y 20 X. El dimetro del punto de
enfoque es de 100 ,pm, por 10 tanto la imagen debe ser mayor que [este dimetro
para ser resuelta. La cmara de observacin est protegida por un vidrio grueso de
plomo para evitar la emisin de rayos X.
Cmara fotogrfica: La cmara fotogrfica est situada debajo de la pantalla
fluorescente. La pantalla fluorescente est sujetada por m lado, y al quitar el paso del
haz electrnico la imagen se centra sobre la pelcula fotogrfica. Se pueden usar varios
tipos de pelculas y placas de vidrio.
Microscopio Electrnico de Barrido (SEM)
La observacin de un espcimen en un MER se logra porque el aparato emite una cortina
delgada de electrones que lo barren haciendo resaltar con muchas nitidez los detalles de su
superficie. Debido a lo anterior, a este tipo de microscopio electrnico se le llama tambin
barrido.
El principio del microscopio electrnico de rastreo consiste, como en el caso de la televisin,
en hacer coincidir punto por punto la superficie del objeto que se est observando con la de la
pantalla fluorescente; las imgenes dadas por los electrones secundarios, los retrodifundidos y
los absorbidos, son recogidas por
captores especiales y proyectadas en la
pantalla fluorescente del aparato.
Se llaman electrones secundarios a los
que son sacados de sus orbitas por el
bombardeo incidente; permiten formar
una imagen completa y no selectiva de
tal o cual objeto, o bien dar una curva
espectral de anlisis.
La metalizacin de la superficie de la muestra permite mejorar la emisin de electrones,
porque equilibra las tensiones de polarizacin superficial y compensa los valores dbiles de
masa atmica de algunos componentes del objeto que se est observando; por otra parte, los
componentes de la emisin secundaria hacen variar el contraste de la imagen.
Todo lo anterior da como resultado la formacin de una imagen en relieve, anloga a la que se
observa en un microscopio ptico estereoscpico; es decir, el microscopio electrnico de
rastreo proporciona una imagen en tres dimensiones, debido a que los electrones no pasan a
travs del objeto, lo que permite observar muestras ms gruesas que en el microscopio
electrnico de transmisin (MET); adems, la profundidad de campo es mayor que en el de
transmisin, donde es considerablemente afectada por el grosor de la muestra.
La preparacin del material biolgico para ser observado en el MER consiste bsicamente de
los siguientes pasos:
Fijacin
Postfijacin con tetraxido de osmio
Deshidratacin de una serie graduada de alcohol etlico a 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,
90, 95, y 100%.
Secado por punto crtico en CO2 lquido
Metalizacin con oro, oro-paladio u otros metales preciosos
Observacin al MER para seleccionar los detalles de la muestra
Fotografiar los detalles que interesan
Los tiempos y concentraciones de las diferentes soluciones que se utilizan dependen de la
naturaleza del material que se desea observar.
Fig. 3.- Esquema de funcionamiento de un microscopio electrnico de
barrido.
Cuando una muestra solo pretende estudiar las estructuras externas de un organismo no son
necesarios los cortes ultrafinos, pudindose realizar la observacin de las clulas intactas o de
los componentes celulares de modo directo por MET tras una tcnica denominada tincin
negativa. Por otra parte, se puede utilizar el microscopio electrnico de barrido (MEB). La
muestra a estudiar mediante este instrumento primero se recubre con una fina capa de metal
pesado, como el oro. El haz de electrones desviados por la capa de metal son recogidos y
proyectados sobre una pantalla para producir una imagen. En el MEB se pueden observar
muestras de cierto tamao y la profundidad de campo es excelente. Adems, permite obtener
un amplio rango de aumentos, desde 15 hasta 100.000 veces, pero solo se puede ver la
superficie de los objetos. Todos los microscopios electrnicos incorporan cmaras que
permiten fotografiar las muestras. Este tipo de fotografas se denominan micrografas
electrnicas.
Los componentes principales del microscopio de barrido SEM son los siguientes:
Puente de energa: La fuente de energa del microscopio electrnico de barrido
depende de varios factores, siendo los ms importantes el voltaje de aceleracin, la
intensidad de la corriente y al dimetro de haz. Para usos prcticos debe asegurarse
una alta estabilidad de la corriente.
Porta muestras: La muestra montada sobre un soporte puede moverse en tres
direcciones, ser calentada, enfriada, estirada, etc. dentro del instrumento. Para de
estudio de ciertos tipos de muestras tales como, metales, minerales, semiconductores,
se requiere calefaccin de la muestra. La calefaccin puede conseguirse por medio de
un hilo incandescente o calentando la muestra en un crisol aplicando directamente a la
muestra una corriente elctrica.
Caractersticas de SEM
Las caractersticas ms importantes de SEM son: poder de resolucin, profundidad del campo
y contraste.
Poder de resolucin
El poder de resolucin en el microscopio electrnico de barrido (SEM) depende de varios
factores, tales como la dimensin del haz de electrones, la difusin del mismo en la muestra
antes de la misin de los electrones secundarios, y la corriente estabilizada de la lente. La
dimensin del haz puede reducirse de muchas formas. Se pueden ampliar filamentos
apuntados o usando elevado potencial de Kv. Por ejemplo a potencia de 1 Kv, la resolucin es
140 nm., mientras que a 30 Kv, la resolucin les 20 nm (200 A).
Se puede prevenir la difusin del haz de electrones en la muestra, aumentando la potencia de
la corriente. Finalmente, la alimentacin de corriente debe ser muy estable, del orden de 1
parte en 100.000, para conseguir alta resolucin.
Sistema de amplificacin del microscopio de barrido
El sistema de amplificacin recoge seales y procesa la informacin procedente de la muestra,
al mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra.
El generador de barrido est conectado al tubo de rayos catdicos para que el haz de
electrones en este tubo sea barrido en la misma forma que el haz principal. Sin embargo la
potencia de la corriente suministrada a la columna principal para de barrido puede ser
atenuada mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre una rea constante. Como
consecuencia de ello, cualquier reduccin en el rea de muestra barrida da lugar a un aumento
de la imagen. Este aumento viene determinado por la relacin del rea de la pantalla del tubo
respecto al rea de la muestra barrida.
Aplicaciones Microscopia electrnica de barrido
Se utiliza en todas las ramas de la ciencia que tienen por estudio la morfologa de la muestra,
siempre que sean resistentes a un alto vaco.
Estudio de poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguneo. Se tipifican
nuevos patrones morfolgicos de superficie que definen distintos casos de leucemia.
Aplicacin a los procesos de biomineralizacin, tejidos duros, pues no es necesaria la
descalcificacin.
Aplicacin para el estudio microvascular de diferentes rganos y sistemas.
Puede incorporar sistemas de deteccin de energa dispersa de rayos X y electrones
retrodispersos que se combinan con tcnicas complementarias para hacer posible la
determinacin de diferentes elementos qumicos y su distribucin.
Permite visualizar estructuras artificiales teidas con elementos de elevado nmero
atmico, lo que permite localizar las actividades de las enzimas y el anlisis de
antgenos y receptores de superficie celular mediante tcnicas inmunocitoqumicas y
de oro coloidal.
TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS


Microscopio Simple
Es aquel que solo utiliza un lente de aumento al contrario del Microscopio ptico estndar,
que posee varias lentes de aumento. Es el microscopio ms bsico. El ejemplo ms clsico es la
lupa.
El microscopio ptico estndar utiliza dos sistemas de lentes alineados. El objeto por observar
se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que determina la formacin de una imagen
virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder diptrico del lente y cuanto ms alejado
est el punto prximo de la visin ntida del sujeto.
El microscopio simple aventaja al microscopio compuesto solo en la luminosidad, pues sta es
ms amplia y por ello se notan menos los inconvenientes de la esfericidad y cromaticidad de
que adolecen los microscopios compuestos cuando no estn equipados con lentes de superior
calidad.

Fig.4.- Microscopio ptico (MO) de campo claro, de campo oscuro y de contraste de fase.
El holands Anton van Leeuwenhoek construy microscopios muy eficaces basados en una
sola lente. Esos microscopios no padecan las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de
los primeros microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y producan
una ampliacin de hasta 300 veces; gracias a ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir
por primera vez las Bacterias.
Microscopio de campo oscuro
Se denomina as porque la imagen que se forma est constituida por una serie de estructuras
brillantes sobre un fondo oscuro.
El microscopio de campo oscuro se utiliza para examinar microorganimos vivos que no son
visibles con el microscopio ptico comn, que no pueden teirse con los mtodos estndares o
que resultan tan distorsionados por la tincin que sus caractersticas no pueden identificarse.
En lugar del condensador normal el microscopio de campo oscuro tiene un condensador
especial que incluye un disco opaco. El disco bloquea la luz que llegara directamente al
objetivo, en el que solo ingresa la luz reflejada por la muestra. Como no hay una luz de fondo
negro, es decir el campo oscuro.
El principio ptico de este microscopio es el de aprovechar un conjunto de rayos luminosos
oblicuos que inicialmente no entran a la lente frontal del objetivo, observndose el campo
microscopio totalmente oscuro. Para que esto ocurra se requiere en primer lugar que la
apertura numrica del condensador sea mayor que la apertura numrica del objetivo. Esta
condicin facilita que los rayos luminosos directos provenientes de la fuente luminosa sean
impedidos de entrar a la porcin central de la lente del condensador y solo penetren y emerjan
de l, los rayos perifricos que al refractarse se hacen oblicuos.
Cuando estos rayos oblicuos encuentran en su recorrido, alguna partcula, son desviados hacia
la lente frontal del objetivo y la imagen de la partcula se observa brillante en medio de un
fondo oscuro.
El microscopio de campo oscuro se emplea para ver clulas vivas (protozoarios, bacterias,
clulas descamadas, etc.) en las cuales no se han aplicado sustancias fijadoras ni colorantes.
Tambin se observan partculas de un tamao inferior a los 0.2 de micrmetro; esto se debe a
que los rayos de luz oblicuos que inciden en ellas forman un halo luminoso brillante alrededor
de las mismas. Mediante el empleo de este microscopio se distinguen con facilidad la forma y
el movimiento helicoidal que muestra la espiroqueta Treponema pallidum, una bacteria
causante de la sfilis.
Microscopia de Contraste de Fase
Los microorganismos tambin pueden observarse con un microscopio de contraste de fase,
que es especialmente til porque permite la observacin detallada de estructuras internas en
los microorganismos vivos. Adems, no es necesario fijar ni teir la muestra, procedimientos
que podran distorsionar o destruir a los microorganismos.
El principio de la microscopia de contraste de fase se basa en la naturaleza ondulatoria de los
rayos de luz y en el hecho de esos rayos pueden estar en fase o fuera de fase. Si el pico de la
onda de los rayos de luz de una fuente coincide con el pico de la onda de los rayos de luz de
otra fuente, los rayos interactan para producir un reforzamiento. En cambio, si el pico de la
onda de una fuente de luz coincide con la depresin de la onda de otra fuente de luz, los rayos
interactan para producir interferencia. En un microscopio de contraste de fase un conjunto
de rayos luminosos proviene directamente de la fuente de luz. El otro conjunto proviene de la
luz que se refleja o difracta por una estructura particular de la muestra. Cuando los dos
conjuntos de rayos de luz- rayos directos y rayos reflejados o difractados- se unen forman una
imagen de la muestra en el ocular, que contiene reas que van desde relativamente luminosas
a matices de gris hasta el negro. En la microscopia de contraste de fase las estructuras internas
de una clula se definen con mayor claridad.
Microscopio de Fluorescencia o de Radiacin Ultravioleta
El microscopio de fluorescencia aprovecha las ventajas de la fluorescencia, es decir la
capacidad de ciertas sustancias de absorber luz de longitudes de onda corta (ultravioleta) y
emitir una luz de una longitud de onda mayor (visible). Algunos organismos fluorescen
naturalmente bajo la luz ultravioleta; si la muestra que se debe examinar no fluoresce de
modo natural, se la tie con alguno de los colorantes fluorescentes denominados
fluorocromos. Cuando los microorganismos teidos con un fluorocromo se examinan
mediante un microscopio de fluorescencia con una fuente de luz ultravioleta o cercana a ella
aparecen como objetos luminiscentes y brillantes contra un fondo oscuro.
El uso principal de la microscopia de fluorescencia es una tcnica diagnstica denominada
inmunofluorescencia (IF) o tcnica con anticuerpos fluorescentes. Los anticuerpos son
molculas de defensa naturales que producen los seres humanos y varias especies de animales
en respuesta a una sustancia extraa o antgeno. Los anticuerpos fluorescentes contra un
antgeno particular se obtienen del siguiente modo: se le inyecta a un animal un antgeno
especfico, como por ejemplo una bacteria, y el animal comienza a producir anticuerpos
especficos contra ese antgeno. Despues de un tiempo suficiente se extraen los anticuerpos
del suero del animal. A continuacin se combinan qumicamente el fluorocromo con los
anticuerpos. Estos anticuerpos fluorescentes se agregan luego a un portaobjetos que contiene
una bacteria desconocida. Si esa bacteria desconocida es la misma que se le inyecto al animal,
los anticuerpos fluorescentes se unen a los antgenos presentes en la superficie de la bacteria y
determina que esta parezca fluorescente.
Requerimientos para el microscopio de fluorescencia
Fuente de luz: Se necesita una intensa fuente de luz para excitar la fluorescencia en el
espectro especfico de cada fluorocromos. Hay que tomar en cuenta que la
fluorescencia es pasajera y la iluminacin produce un efecto de fotoblanqueo en el
fluorocromo; adems, las clulas vivas pueden ser daadas por la intensa radiacin. La
luz debe ser de una longitud de onda corta. Se emplean lmparas de mercurio a alta
presin que funcionan de un modo diferente a las lmparas de filamentos
incandescentes. Tambin se utiliza luz ultravioleta y rayos laser. Muchos modelos
funcionan con epi-iluminacin.
Filtros: Son los que permiten el paso de luz de una determinada longitud de onda, la
del rango y color necesario para excitar al fluorocromo y bloquean las longitudes no
deseadas. Una vez filtrada, la luz incide sobre el espcimen por reflexin de un espejo
dicroico (epi-iluminacin) y es nuevamente filtrada para poder ser observada.
Objetivos: Deben tener gran capacidad para transmitir la luz y proveer una imagen de
alta calidad. De igual manera deben poseer una gran apertura numrica.
La microscopa de fluorescencia ha permitido avanzar de manera sorprendente en la
investigacin de procesos fisiolgicos celulares que mediante otros procedimientos no hubiera
sido posible realizar. La fluorescencia permite demostrar, por la radiacin luminosa que
emiten, partculas sumamente pequeas que con otros tipos de microscopios fotnicos no son
fciles de visualizar. En este tipo de procedimiento es indispensable obtener el registro
fotogrfico de las imgenes obtenidas.
Esta tcnica, que permite detectar bacterias u otros microorganismos patgenos, incluso
dentro de clulas, tejidos u otras muestras clnicas, posee una importancia extraordinaria
porque con ella se puede identificar un microbio en el trmino de minutos. La
inmunofluorescencia es especialmente til en el diagnstico de la sfilis y de la rabia.
Tabla 1.- Resumen de los diversos tipos de Microscopios
RESUMEN DE LOS DIVERSOS TIPOS DE MICROSCOPIOS
Tipo de
microscopio
Caractersticas
distintivas
Imagen tpica Usos principales

ptico (MO)



De campo
claro
Utiliza luz visible como
fuente de iluminacin;
no puede resolver
estructuras con un
tamao menor de
0,2um; la muestra
aparece contra un fondo
claro. Su uso es
econmico y sencillo.
Para observar
diversas muestras
teidas y contar
microbios, no
resuelve elementos
pequeos como los
virus.




De campo
oscuro

Utiliza un condensador
especial con un disco
opaco que bloquea la
luz que llega
directamente al objetivo;
solo ingresa en el
objetivo la luz reflejada
por la muestra y la
muestra aparece
iluminada contra un
fondo negro.
Para examinar
microorganismos
vivos que son
invisibles en la
microscopia de
campo claro, no se
tien con facilidad o
se distorsionan con la
tincin; se utiliza con
frecuencia para
detectar Treponema
pallidum de la sfilis.





De contraste
de fase
Utiliza un condensador
que contiene un
diafragma anular. El
diafragma permite que la
luz directa del
condensador pase, se
enfoque la luz sobre la
muestra y en una placa
de difraccin en la lente
objetivo. Los rayos de luz
directos y reflejados o
difractados se unen para
formar la imagen.




Para facilitar la
observacin de las
estructuras internas
de muestra viables.



De contraste
por
interferencia
diferencial
Como el contraste de
fase, emplea las
diferencias en los ndices
de refraccin para
producir la imagen.
Utiliza dos haces de luz
separados por prismas;
la muestra aparece
coloreada como
resultado del efecto
prisma.

Para proporcionar
imgenes
tridimensionales.



De
fluorescencia
Utiliza una fuente de luz
ultravioleta o cercana a
la ultravioleta que
determina que los
microbios que emiten luz
en una muestra
aparezcan como
fluorescentes.
En tcnicas con
anticuerpos
fluorescentes para
detectar con rapidez
e identificar
microbios en
muestras de tejidos o
clnicas.



Confocal


Utiliza luz por lser para
iluminar un plano de la
muestra por vez.

Para obtener
imgenes
bidimensionales y
tridimensionales de
clulas para
aplicaciones
biomdicas.


Acstico de
barrido
(MAB)

Utiliza una onda sonora
de frecuencia especfica
que atraviesa la muestra
con una porcin que se
refleja cuando la golpea.
Para examinar clulas
vivas adherida a otra
superficie, como
clulas cancerosas,
placa arterial y
pelculas biolgicas
dentro del material.

Electrnico



De
transmisin
(MET)
Utiliza un haz de
electrones en lugar de
luz; los electrones
atraviesan la muestra;
dada la longitud de onda
ms pequea de los
electrones, pueden
resolverse estructuras
menores de 0,2 um.


Para examinar virus o
la ultraestructura
interna en cortes
delgados de clulas.



De barrido
(MEB)
Utiliza un haz de
electrones en lugar de
luz, los electrones se
reflejan desde la
muestra; dada la
longitud de onda ms
pequea de los
electrones, pueden
resolverse estructuras
menores de 0,2 um.


Para estudiar las
caractersticas de la
superficie de clulas
y virus.

De sonda de barrido





Por efecto
tnel (MBT)
Utiliza una sonda
delgada de metal que
recorre una muestra y
produce una imagen que
revela las protuberancias
y las depresiones de los
tomos sobre la
superficie de la muestra.
El poder de resolucin es
mucho mayor que el de
un microscopio
electrnico.



Proporciona
imgenes muy
detalladas de
molculas dentro de
las clulas.



De fuerza
atmica
Utiliza una sonda de
metal y diamante que se
aplica con una fuerza
suave a lo largo de la
superficie de una
muestra. Proporciona
una imagen
tridimensional.
Proporciona
imgenes de
procesos moleculares
y molculas
biolgicas en detalle
casi atmico.

TCNICAS DE TINCIN
La investigacin de procesos fisiolgicos celulares que mediante otros procedimientos no
hubiera sido posible realizar. La fluorescencia permite demostrar, por la radiacin luminosa
que emiten, partculas sumamente pequeas que con otros tipos de microscopios fotnicos no
son fciles de visualizar
La mayora de las observaciones iniciales de los microorganismos se realizan con preparados
teidos. El trmino tincin significa simplemente colorear los microorganismos con un
colorante que destaque ciertas estructuras. Sin embargo antes de teir los microorganismos,
se los debe fijar (adherir) al portaobjetos. El proceso de fijacin produce la muerte simultnea
de los microorganismos y su adherencia al portaobjetos. Tambin preserva diversas partes de
los microbios en su estado natural con una distorsin mnima.
Cuando se debe fijar una muestra se extiende una pelcula delgada del material que contiene
los microorganismos sobre la superficie del portaobjetos. Esta pelcula, denominada
extendido, se deja secar al aire. A continuacin en la mayor parte de los procedimientos de
tincin el portaobjetos se fija pasndolo varias veces a travs de la llama de un mechero
Bunsen con el lado del extendido hacia arriba o cubrindolo con alcohol metlico durante 1
minuto. Se aplica el colorante se lo lava con agua y se lo seca con papel absorbente. Si no se
realiza la fijacin el colorante podra arrastrar los microorganismos al portaobjetos. Una vez
efectuado el procedimiento descrito, los microorganismos estn listos para la observacin
microscpica.
Los colorantes son sales compuestas por un in positivo y un in negativo, uno de los cuales
estn coloreados y se conoce como cromforo. El color de los denominados colorantes bsico
est en el in positivo; en los colorantes cidos, est en el in negativo. En un pH de 7
bacterias presentan una carga levemente negativa. Por lo tanto, el in positivo coloreado en
un colorante bsico es atrado hacia la clula bacteriana con carga negativa. Los colorantes
bsicos, entre los que se encuentran el violeta de genciana, el azul de metileno, el verde de
malaquita y la safranina, se utilizan con ms frecuencia que los colorantes cidos. Estos ltimos
no son atrados por la mayor parte de los tipos de bacterias porque la superficie bacteriana
con carga negativa repele los iones negativos del colorante, de modo que este tie el fondo en
lugar de la estructura bacteriana. Los preparados bacterianos incoloros, contra un fondo
coloreado se denominan tincin negativa, una tcnica valiosa para la observacin de las
formas generales, los tamaos y las cpsulas celulares porque las clulas resultan muy visibles
contra un fondo oscuro que contrasta.
Las distorsiones del tamao y la forma de las clulas se disminuyen al mnimo porque no se
requiere fijacin y las clulas no captan el colorante. Son ejemplos de colorantes cidos la
eosina, la fucsina cida y la nigrosina.
Para aplicar los colorantes cidos o bsicos los microbilogos emplean tres clases de tcnicas
de tincin: simple, diferencial y especial.
TINCIONES SIMPLES
Una tincin simple es una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico nico. Aunque
los diferentes colorantes se unen de forma especfica a las distintas partes de las clulas, el
propsito principal de una tincin simple es destacar el microorganismo completo para que se
vean las formas y las estructuras celulares bsicas. El colorante se aplica al extendido fijado
durante un tiempo determinado y luego se lava; a continuacin el portaobjetos se seca y se
examina. En ocasiones se agrega una sustancia qumica a la solucin para intensificar la
coloracin; este aditivo se denomina mordiente. Una de las funciones de un mordiente es
aumentar la afinidad de una muestra biolgica por un colorante; otra es cubrir una estructura
(como un flagelo) para darle mayor espesor y facilitar las observaciones despus del teido.
Algunas de las tinciones simples utilizadas con frecuencia en el laboratorio son el azul de
metileno, la carbolfucsina, el violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina.
TINCIONES DIFERENCIALES
A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de modo diferente
con las distintas clases de bacterias y por lo tanto pueden ser empleadas para establecer una
distincin entre ellas. Las tinciones diferenciales utilizadas con ms frecuencia para las
bacterias son la tincin de GRAM y la tincin de cido-alcohol resistencia.
TINCIN DE GRAM
La tincin de GRAM fue desarrollada por el bacterilogo dans Hans Christian Gram en 1884 y
es uno de los procedimientos de tincin ms tiles porque permite clasificar las bacterias en
dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativos.


1. Un extendido fijado con color se cubre con un colorante violeta bsico, por lo general
violeta de genciana. Como el colorante violeta imparte su color a todas las clulas, se
lo denomina colorante primario.
2. Despus de un breve lapso, se escurre el colorante violeta, se lava el extendido y se lo
cubre con yodo, un mordiente. Cuando se lava el yodo, tanto las bacterias
grampositivas como las gramnegativas aparecen de color violeta oscuro o prpura.
Fig. 5.- Tcnica de Tincin GRAM.
3. A continuacin se lava el portaobjetos con alcohol o con una solucin de alcohol-
acetona. Esta solucin es un agente descolorante que elimina el color violeta de las
clulas de algunas especies pero no de otras.
4. Se elimina el alcohol con agua y se tie el portaobjetos con safranina, un colorante
bsico. Luego se vuelve a lavar el extendido, se lo seca con papel absorbente y se lo
examina con el microscopio.
El colorante violeta y el yodo se combinan en el citoplasma de cada bacteria y lo colorean de
violeta oscuro o prpura. Las bacterias que conservan este color despus de haberles agregado
el alcohol para descolorarlas se clasifican como grampositivas; las bacterias que pierden el
color violeta oscuro despus de la decoloracin se clasifican como gramnegativas.
Como las bacterias gramnegativas son incoloras despus del lavado con alcohol, dejan de ser
visibles. Por ese motivo se les aplica el colorante bsico safranina, que las convierte en
rosadas. Los colorantes como la safranina que tienen un color que contrasta con el colorante
primario se denominan colorantes de contraste. Dado que las bacterias grampositivas
conservan el colorante violeta original, no son afectadas por el colorante de contraste
safranina.
Las diferentes clases de bacterias reaccionan de
modo distinto frente a la tincin de Gram porque las
diferencias estructurales en sus paredes determinan
la retencin o el escape de una combinacin de
violeta de genciana y de yodo, denominada complejo
violeta-yodo (CV-I).

Entre otras diferencias las bacterias grampositivas tienen un peptidoglucano (disacridos y
aminocidos) en su pared celular ms grueso que las bacterias gramnegativas. Adems, las
bacterias gramnegativas contienen una capa de lipopolisacrido (lpidos y polisacridos) como
parte de su pared celular. Cuando se los aplica tanto a clulas grampositivas como a clulas
gramnegativas el violeta de genciana y luego el yodo ingresa con facilidad en las clulas, en
cuyo interior se combinan para formar CV-I. Este complejo es ms grande que la molcula de
violeta de genciana que ingres en las clulas y por su tamao, no puede ser eliminado por el
agregado de alcohol de la capa de peptidoglucano intacta de las clulas grampositivas. Estas
retienen el color del colorante violeta de genciana. En cambio en las clulas gramnegativas el
alcohol altera la capa externa del lipopolisacrido y el complejo CV-I se elimina de la capa
Fig. 6.- Imagen de bacteria grampositiva.
delgada de peptidoglucano. Como consecuencia, las clulas gramnegativas son incoloras hasta
que se agrega el colorante de contraste safranina, despus de lo cual aparecen de color
rosado.
En sntesis, las clulas grampositivas retienen el colorante y permanecen de color violeta. Las
clulas gramnegativas no retienen el colorante; son incoloras hasta que se las tie con un
colorante de contraste rojo.
TINCIN DE CIDO-ALCOHOL RESISTENCIA
Otra tincin diferencial importante es la tincin de
cido alcohol resistencia, que se fija de modo firme
solo a las bacterias que poseen ceras en las paredes de
sus clulas. Los microbilogos utilizan esta tincin para
identificar todas las bacterias del gnero
Mycobacterium. Esta tincin se utiliza para identificar
las cepas del gnero Nocardia.
En este procedimiento de tincin se aplica el colorante rojo carbolfucsina a un extendido fijado
y se caliente suavemente el portaobjetos durante varios minutos. Luego se enfra el
portaobjetos y se lo lava con agua. A continuacin el extendido se trata con cido alcohol, un
decolorante que elimina el color rojo de las bacterias que no son cido alcohol resistentes. Los
microorganismos cido alcohol resistentes, retienen el color rojo porque la carbolfucsina es
ms soluble en los lpidos de la pared celular que en los cido alcohol resistentes, en las
bacterias que no son cido alcohol resistentes las paredes carecen de componentes lipdicos y
la carbolfucsina se elimina con facilidad durante la decoloracin, lo que deja a las cdulas
incoloras. Luego el extendido se colorea con azul de metileno, que acta como colorante de
contraste. Las bacterias que no son cido alcohol resistente aparecen azules despus de la
aplicacin del colorante de contraste.
TINCIONES ESPECIALES
Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes especficas de microorganismos
como endosporas y flagelos, y para detectar la presencia de cpsulas.
Fig. 7.- Bacterias cido-alcohol
resistentes.


TINCIN PARA ENDOSPORAS (ESPORAS)
Una endospora es una estructura especial, resistente
y latente que se forma dentro de una clula y que
protege a una bacteria de las condiciones
ambientales adversas. Aunque las endosporas son
relativamente inusuales en las clulas bacterianas,
pueden ser formadas por algunas bacterias.
Las endosporas no se tien con los mtodos comunes como la tincin simple y la tincin de
Gram, porque estos colorantes no atraviesan sus paredes. La ms utilizada para este fin es la
tincin de Schaeffer-Fulton para endosporas. Se aplica el colorante primario verde de
malaquita a un extendido fijado con calor y se lo calienta hasta la emisin de vapores durante
alrededor de 5 minutos. El calor ayuda a que el colorante atraviese la pared de la endospora.
Luego se lava el preparado con agua durante cerca de 30 segundos para eliminar el verde de
malaquita de todas las parte de la clula excepto las endosporas. A continuacin se aplica el
extendido safranina, un colorante de contraste, para teir las porciones de las clulas distintas
de las endosporas. En un extendido preparado de modo adecuado aparecen verdes dentro de
clulas rojas o rosadas.
TINCIN PARA FLAGELOS
Los flagelos bacterianos son estructuras de locomocin
demasiadas pequeas para ser vistas con un
microscopio ptico sin tincin. Hay un procedimiento
tedioso y delicado que se basa en el empleo de un
mordiente y el colorante carbolfucsina para aumentar
el dimetro de los flagelos hasta que se tornen visibles
con el microscopio ptico.
Fig.8.- Tincin Negativa.
Fig. 10.- Tincin de flagelos.
Fig. 9.- Tincin de endosporas.
Tabla 2.- Resumen de diversas tinciones y usos
RESUMEN DE DIVERSAS TINCIONES Y SUS USOS
Tincin Usos principales
Simple (azul de metileno,
carbolfucsina, violeta de
genciana, safranina)
Utilizado para destacar microorganismos a fin de determinar
las formas y las disposiciones celulares. Las clulas se tien
con una solucin acuosa o alcohlica de un colorante bsico
solo.
Diferencial
Gram Utilizada para distinguir entre clases diferentes de bacterias.
Clasifica las bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y
gramnegativas. Las bacterias grampositivas retienen el color
del colorante violeta de genciana aparecen violceas. Las
bacterias gramnegativas no retienen el colorante violeta y
permanecen incoloras hasta que se aplica la safranina como
colorante de contraste y entonces se tornan rosceas.
Coloracin de cido-alcohol
resistencia
Utilizada para distinguir especies de Mycobacterium y algunas
especies de Norcadia, las bacetrias acido-alcohol resistentes,
una vez teidas con carbolfucsina y tratadas con cido-
alcohol, retienen el colorante y aparecen de color rojo. Las
bacterias que no son acido-alcohol resistentes, cuando se las
tie y se las trata de la misma manera y despus se las tie
con azul de metileno, aparecen de color azul porque pierden
el colorante carbolfucsina y entonces puede aceptar el
colorante azul de metileno.
Especial Utilizada para colorear y aislar varias estructuras, como
capsulas, endosporas y flagelos; a veces se la utiliza como
herramienta diagnostica.
Negativa Utilizada para demostrar la presencia de capsulas. Como estas
no aceptan la mayora de los colorantes aparecen como halos
no teidos alrededor de las clulas bacterianas y se destacan
contra un fondo que contrasta.
Endosporas Utilizada para detectar la presencia de endosporas en las
bacterias. Cuando se aplica verde de malaquita sobre un
extendido de clulas bacterianas fijadas con color, el
colorante penetra en el interior de las endosporas y las tie
de verde. Cuando a continuacin se aplica safranina, tie el
resto de las clulas de rojo o rosado.
Flagelos Utilizada para demostrar la presencia de flagelos. Se usa un
mordiente para aumentar los dimetros de los flagelos hasta
que puedan visualizarse por microscopia cuando se tian con
carbolfucsina.



Conclusiones
El microscopio fue el primer instrumento que permiti revelar los secretos de la
estructura celular y aun en nuestros das contina siendo un instrumento muy valioso
en biologa celular y en muchas ramas de estudio cientfico que han dado paso a un
exitoso avance en la tecnologa y al descubrimiento de muchas experiencias nuevas
para el ser humano.
El microscopio se ha convertido en una base fundamental para las ciencias
experimentales debido a que estas necesitan el uso de instrumentos que permitan
ampliar muchas veces ms la imagen de las estructuras que los constituyen, por
ejemplo en biologa se lo utiliza para el estudio detallado de los componentes de
clulas y tejidos animales o vegetales y por el tamao que poseen, el microscopio es el
instrumento capaz de llevar a cabo esta tarea debido a su poder de amplificacin y
resolucin.
Tiene ms poder de resolucin que el microscopio ptico. La resolucin aumenta con
la velocidad del electrn y con el voltaje, por tanto. Consigue alcanzar hasta los
200.000 aumentos, con un poder de resolucin inferior a los 10nm.
El funcionamiento del microscopio electrnico se basa en dos caractersticas de los
electrones: primera, los electrones presentan propiedades ondulatorias, asocindose
la longitud de onda en forma inversamente proporcional a la velocidad de
desplazamiento de estos; segunda, el rayo de electrones puede ser enfocado
pasndolo a travs de un campo magntico.
La imagen en el microscopio electrnico se basa en la dispersin de electrones, que
depende del espesor y densidad molecular del objeto y, sobre todo, del nmero
atmico.
Los microscopios electrnicos se clasifican, de acuerdo con la forma en que son
expuestos los detalles del espcimen, en: Microscopia electrnica de transmisin
(MET) y Microscopia electrnica de barrido, o de exploracin electrnica (SEM).
El microscopio electrnico presenta tres caractersticas diferentes del microscopio
ptico.
o En primer lugar, como los electrones no pueden recorrer grandes distancias a
travs del aire, toda las columna del microscopio debe encontrarse en
condiciones de alto vaco; en consecuencia el objeto siempre debe estar
deshidratado y, por lo tanto, muerto.
o En segundo lugar debido a que la amplificacin que resulta de una lente
electromagntica es proporcional al campo magntico, que a su vez es
proporcional a la corriente en las bobinas, la amplificacin puede variarse de
forma continua variando la corriente que atraviesa las bobinas de las lentes.
En el microscopio la amplificacin viene fijada por la forma de la lente de
vidrio; por lo tanto se necesitan muchos objetivos para cubrir la escala de
aumentos.
o En tercer lugar, ninguna de las aberraciones primarias puede ser corregida en
las lentes en las lentes electromagnticas estndar, porque las lentes
magnticas son siempre convergentes.
El microscopio electrnico de transmisin est constituido bsicamente por cuatro
sistemas que son: sistema ptico electrnico, sistema de haz de electrones, sistema de
deteccin y amplificacin y el sistema de exhibicin.
El microscopio electrnico de barrido (MEB) est compuesto por: un can
electrnico, condensadores, plataforma para la colocacin de la muestra, objetivo,
lente intermedia, lente de proyeccin, cmara de observacin y una cmara
fotogrfica.
El microscopio electrnico de barrido (MEB) consiste, como en el caso de la televisin,
en hacer coincidir punto por punto la superficie del objeto que se est observando con
la de la pantalla fluorescente; las imgenes dadas por los electrones secundarios, los
retrodifundidos y los absorbidos, son recogidas por captores especiales y proyectadas
en la pantalla fluorescente del aparato.
En el MEB se pueden observar muestras de cierto tamao y la profundidad de campo
es excelente. Adems, permite obtener un amplio rango de aumentos, desde 15 hasta
100.000 veces, pero solo se puede ver la superficie de los objetos.
El poder de resolucin en el microscopio electrnico de barrido (SEM) depende de
varios factores, tales como la dimensin del haz de electrones, la difusin del mismo
en la muestra antes de la misin de los electrones secundarios, y la corriente
estabilizada de la lente.
El sistema de amplificacin recoge seales y procesa la informacin procedente de la
muestra, al mismo tiempo que el haz de electrones barre la muestra.
El generador de barrido est conectado al tubo de rayos catdicos para que el haz de
electrones en este tubo sea barrido en la misma forma que el haz principal. Sin
embargo la potencia de la corriente suministrada a la columna principal de barrido
puede ser atenuada mientras que el tubo de la pantalla es barrido sobre una rea
constante. Como consecuencia de ello, cualquier reduccin en el rea de muestra
barrida da lugar a un aumento de la imagen. Este aumento viene determinado por la
relacin del rea de la pantalla del tubo respecto al rea de la muestra barrida.
El microscopio simple es aquel que solo utiliza un lente de aumento al contrario del
microscopio ptico estndar, que posee varias lentes de aumento, es el microscopio
ms bsico.
El microscopio de campo oscuro se utiliza para examinar microorganimos vivos que no
son visibles con el microscopio ptico comn, que no pueden teirse con los mtodos
estndares o que resultan tan distorsionados por la tincin que sus caractersticas no
pueden identificarse.
En lugar del condensador normal el microscopio de campo oscuro tiene un
condensador especial que incluye un disco opaco. El disco bloquea la luz que llegara
directamente al objetivo, en el que solo ingresa la luz reflejada por la muestra, la
imagen de la partcula se observa brillante en medio de un fondo oscuro.
El principio de la microscopia de contraste de fase se basa en la naturaleza ondulatoria
de los rayos de luz y en el hecho de esos rayos pueden estar en fase o fuera de fase. En
este microscopio un conjunto de rayos luminosos proviene directamente de la fuente
de luz. El otro conjunto proviene de la luz que se refleja o difracta por una estructura
particular de la muestra.
Los microorganismos tambin pueden observarse con un microscopio de contraste de
fase, que es especialmente til porque permite la observacin detallada de estructuras
internas en los microorganismos vivos. Adems, no es necesario fijar ni teir la
muestra, procedimientos que podran distorsionar o destruir a los microorganismos.
El microscopio de fluorescencia aprovecha las ventajas de la fluorescencia, es decir la
capacidad de ciertas sustancias de absorber luz de longitudes de onda corta
(ultravioleta) y emitir una luz de una longitud de onda mayor (visible).
El microscopio de fluorescencia permite detectar bacterias u otros microorganismos
patgenos, incluso dentro de clulas, tejidos u otras muestras clnicas, posee una
importancia extraordinaria porque con ella se puede identificar un microbio en el
trmino de minutos.
Para aplicar los colorantes cidos o bsicos los microbilogos emplean tres clases de
tcnicas de tincin: simple, diferencial y especial.
La tincin simple es utilizada para destacar microorganismos a fin de determinar las
formas y las disposiciones celulares. Las clulas se tien con una solucin acuosa o
alcohlica de un colorante bsico solo.
Las tinciones diferenciales utilizadas con ms frecuencia para las bacterias son la
tincin de GRAM y la tincin de cido-alcohol resistencia.
La tincin GRAM es utilizada para distinguir entre clases diferentes de bacterias.
Clasifica las bacterias en dos grandes grupos: grampositivas y gramnegativas. Las
bacterias grampositivas retienen el color del colorante violeta de genciana aparecen
violceas. Las bacterias gramnegativas no retienen el colorante violeta y permanecen
incoloras hasta que se aplica la safranina como colorante de contraste y entonces se
tornan rosceas.
La tincin de cido-alcohol resistencia es utilizada para distinguir especies de
Mycobacterium y algunas especies de Norcadia, las bacetrias cido-alcohol resistentes,
una vez teidas con carbolfucsina y tratadas con cido-alcohol, retienen el colorante y
aparecen de color rojo. Las bacterias que no son acido-alcohol resistentes, cuando se
las tie y se las trata de la misma manera y despus se las tie con azul de metileno,
aparecen de color azul porque pierden el colorante carbolfucsina y entonces puede
aceptar el colorante azul de metileno.
Las tinciones especiales se utilizan para colorear y aislar partes especficas de
microorganismos como endosporas y flagelos, y para detectar la presencia de
cpsulas.
La tincin de endosporas es utilizada para detectar la presencia de endosporas en las
bacterias. Cuando se aplica verde de malaquita sobre un extendido de clulas
bacterianas fijadas con color, el colorante penetra en el interior de las endosporas y las
tie de verde. Cuando a continuacin se aplica safranina, tie el resto de las clulas de
rojo o rosado.
La tincin de flagelos es utilizada para demostrar la presencia de flagelos. Se usa un
mordiente para aumentar los dimetros de los flagelos hasta que puedan visualizarse
por microscopia cuando se tian con carbolfucsina.




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