Polinucletidos

O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
N
N
O
N
H H
O
N
N
N
N
O
N
H
H
O
N
N
N
N
N
H
H
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
N
N
O
H
N
H
H
H
HOCH
2
OH
Polinucletido
Extremo 5
Extremo 3
Enlace
fosfodister
5- CpApTpTpGpCpGpGpApApTpGpCpCp -3
5-CATTGCGGAATGCC-3
3-GTAACGCCTTACGG-5
Formas de representacin de polinucletidos
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
CH
2
O
P
O
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
N N
N
N
N
H
O
O
N
N
O
N
H H
N N
N
N
N
H H
O
H
O
O
N
N
N
N
O
H
N
H
H
N
N
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N
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H
O
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-
CH
2
O
P
O
-
O
O
-
CH
2
O
P
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-
O
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N
N
N
N
N
H
H
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O
O
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3
C
H
O
-
O
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2
C
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-
O
O
-
O
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2
C
O
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O
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O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
N
N
N
N
O
H
N
H
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N
N
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N
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O
O
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CH
2
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O
-
H
O
-
O
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2
C
O
P
-
O
O
O
-
CH
2
O
P
O
-
O
5
3
5
3
Polinucletido
en doble hlice
Propiedades de los polinucletidos, 1
1. Absorcin de luz UV a 260 nm
% A
260,

Hipocromismo
T (C)
100
110
120
En el DNA doble hlice se da el
fenmeno de hipocromismo:

el DNA desnaturalizado por el calor
absorbe un 20-30 % ms que el
DNA nativo
Propiedades de los polinucletidos, 2
2. Reaccin positiva de los polidesoxirribonucletidos a la
difenilamina y al reactivo de Schiff

3. Reaccin positiva de los polirribonucletidos al orcinol

4. Reaccin con agentes intercalantes (acridinas)

5. Hidrlisis completa del RNA con lcali; el DNA es resistente
a lcali.
Rotura qumica de polinucletidos
- Tratando un polinucletido (DNA) con dimetil sulfato (DMS)
tiene lugar la metilacin de purinas; por calentamiento a pH neutro
se rompe el enlace glicosdico y queda un sitio apurnico; el tra-
tamiento ulterior con cido diludo rompe la cadena por el sitio
apurnico.

- Tratando un polinucletido (DNA) con hidrazina se rompe el
enlace glicosdico de las pirimidinas, quedando un sitio apirimi-
dnico; el tratamiento ulterior con piperidina rompe la cadena por
el sitio apirimidnico.
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
O
O
N
N
N
N
N
H
H
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-
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2
C
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-
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-
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2
C
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O
O
-
O
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2
C
O
P
-
O
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H H
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N
N
N
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-
O
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2
C
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-
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3
C
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O
O
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N
N
N
N
N
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-
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2
C
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-
O
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-
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2
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-
O
O
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2
C
O
P
-
O
N
N
N
H H
O
N
N
N
N
N
H
H
O
H
H
3
C
DMS
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
O
O
N
N
N
N
N
H
H
O
-
O
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2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
O
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2
C
O
P
-
O
N
N
N
H H
O
N
N
N
N
N
H
H
O
H
H
3
C
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
O
O
N
N
N
N
N
H
H
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
N
N
N
H H
O
OH
pH bajo
Sitio apurnico
Calentamiento
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
O
O
N
N
N
N
N
H
H
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
N
N
N
H H
O
OH
Sitio apurnico
O
O
-
O
O
-
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
N
N
N
H H
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
N
N
N
N
N
H
H
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
cido diludo
Rotura enzimtica de polinucletidos
Endonucleasas: atacan enlaces fosfodister situados en
el interior de una cadena polinucleotdica, y suelen ser
especficas de cada cido nucleico:

- Ribonucleasas
- Desoxirribonucleasas

Exonucleasas: atacan enlaces fosfodister situados en los
extremos (3 o 5) de una cadena polinucleotdica, y suelen
atacar indistintamente ambos tipos de cidos nucleicos:

- Exonucleasa de bazo (rotura tipo b)
- Exonucleasa de veneno de serpiente (rotura tipo a)
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
N
N
O
N
H H
O
N
N
N
N
O
N
H
H
O
N
N
N
N
N
H
H
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
H
O
N
N
N
N
O
N
H
H
H
OH
CH
2
O P
O
-
O
O
-
O
N
N
N
N
N
H
H
OH
O P
O
-
O
O
-
CH
2
O P
O
-
O
O
-
CH
2
O
N
N
H
3
C
O
H
O
OH
O P
O
-
O
O
-
CH
2
O
N
N
O
N
H H
OH
Rotura tipo a:

Da lugar a una
mezcla de
5-nucletidos
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
N
N
O
N
H H
O
N
N
N
N
O
N
H
H
O
N
N
N
N
N
H
H
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
O
O
-
O
H
2
C
O
P
-
O
H
O
N
N
N
N
O
N
H
H
H
HOCH
2
O
P O
-
O
O
-
O
N
N
N
N
N
H
H
O
P O
-
O
O
-
HOCH
2
O
N
N
O
N
H H
O
P O
-
O
O
-
HOCH
2
O
N
N
H
3
C
O
H
O
O
P O
-
O
O
-
HOCH
2
Rotura tipo b:

Da lugar a una
mezcla de
3-nucletidos
Endonucleasas:

DNAasa I: rotura completa, tipo a
DNAasa II: rotura completa, tipo b
RNAasa pancretica: rompe (b) enlaces Py-X
RNAasa T-1: rompe (b) enlaces G-X

Endonucleasas de restriccin

Exonucleasas:

Exonucleasa de bazo: libera 3-nucletidos
Exonucleasa de veneno de serpiente: libera 5-nucletidos
Endonucleasas de restriccin, 1:
1. Reconocen secuencias especficas, por lo general palindrmicas:
5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3
3- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5
La secuencia reconocida en este caso es GAATTC
Endonucleasas de restriccin, 2:
2. Suelen romper el polinucletido dejando extremos cohesivos:
5- ATCGTTGCCTACAATTGAATTCCCAATAACCCTT -3
3- TAGCAACGGATGTTAACTTAAGGGTTATTGGGAA -5
5- ATCGTTGCCTACAATTG
3- TAGCAACGGATGTTAACTTAA
AATTCCCAATAACCCTT -3
GGGTTATTGGGAA -5
Lo que permite la soldadura de fragmentos de DNA rotos por la
misma endonucleasa de restriccin
Endonucleasas de restriccin, 3:
3. Al reconocer secuencias relativamente largas, cortan el DNA
por un nmero muy limitado de sitios, lo que facilita la manipula-
cin experimental del mismo.
EcoRI GAATTC
ClaI ATCGAT
HaeIII GGCC
RsrII CGGATCCG
Algunas endonucleasas de restriccin:
Supongamos la secuencia reconocida por la endonucleasa
de restriccin EcoRI, que es
5-GAATTC-3
En un DNA que contenga 30% de A, 30 % de T, 20 % de G y
20 % de C, la probabilidad de encontrar esta secuencia al azar
sera de
0.2 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.3 x 0.2 = 0.000324
O lo que es lo mismo, aproximadamente una cada 3086 nucletidos
Separacin electrofortica
de fragmentos de restriccin
del DNA.

Una vez separados, se tratan
con bromuro de etidio (un agen-
te intercalante) y se observan
bajo luz UV.
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACG
3
3
3
5
5
5
1. Sea un DNA que se desea secuenciar:
2. Disponemos de un oligonucletido complementario a la secuencia, que se hibrida
con el DNA cuya secuencia deseamos conocer, y que vale como cebador de la nueva sntesis. Este
oligonucletido est marcado radioactivamente.
TAGGCACG
Mtodo de Sanger para secuenciacin de polinucletidos
3. La muestra se divide en cuatro partes, que contienen:
A) Los cuatro desoxinuclesido trifosfatos, dATP, dGTP, dCTP, dTTP
B) DNA polimerasa I (fragmento Klenow)
y especficamente cada una,
C) un didesoxinuclesido trifosfato, que al carecer de 3-OH interrumpe
la sntesis de DNA all donde se incorpore.
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
ddATP
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
ddGTP
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
ddCTP
dATP
dGTP
dCTP
dTTP
ddTTP
Muestra A
Muestra B Muestra C Muestra D
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG*
3
3
5
5
3
4
12
15
21
26
Sntesis en presencia de ddGTP
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGA*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCA*
3
3
5
5
1
2
6
8
13
17
Sntesis en presencia de ddATP
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCAC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATC*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATC*
3
3
5
5
5
7
11
16
20
25
Sntesis en presencia de ddCTP
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAAT*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
-*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCGAACGT*
3
3
5
5
9
10
14
19
24
31
Sntesis en presencia de ddTTP
G A T C
60
50
40
30
20
10
+
-
A continuacin, las cuatro mezclas
se someten a electroforesis en poli-
acrilamida-SDS. Este mtodo sepa-
ra polinucletidos en funcin de su
tamao, de forma que los ms cortos
se desplazan ms rpidamente. Como
el cebador est marcado radioactiva-
mente, revelamos la plancha de
electroforesis por autorradiografa.
Con esto leemos directamente la
secuencia complementaria del poli-
nucletido inicial:

5-AAGGCACATTCGATGCAAT-
CGAATCGAACGTCCCAAAAG-
GATTCCGGGAAAATG-3