Extraccin de ADN

Existen diversos mtodos

Mtodo Purificacin salina (salting out).
Consiste en cuatro pasos
Pasos de la purificacin salina
1.Lisis de la clula de donde se quiere extraer el ADN,
con ayuda de detergentes anionicos y en presencia de
conservantes.
2.Eliminacin de ARN mediante ARNsas.
3.Eliminacin de protenas a travs de la precipitacin
salina.
4.Aislamiento de ADN a travs de la precipitacin y
posterior hidratacin para su conservacin

Secuenciacin de ADN

Es la determinacin del orden de las bases
nitrogenadas de una secuencia.
Mtodo de Sanger (1977) y sus respectivas mejoras y
cambios con el avance cientfico.
Frederick Sanger
Elementos del mtodo de Sanger
El ADN molde que se desea secuenciar
ADN Polimerasa
Cebador o "primer
Los cuatro nucletidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y dTTP)
didesoxinucletidos (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).


Proceso del mtodo de Sanger
En cuatro tubos, se harn 4 procesos de sntesis de cadenas
complementarias de ADN.
En cada tubo estar la polimerasa, la cadena sencilla de ADN molde, el
cebador, los nucletidos y una proporcin de un nico
didesoxinucletido.
Durante cada proceso de sntesis, el didesoxonucleotido presente en
cada tubo, competir con su homologo por incorporarse a la cadena.
Cuando esto ocurra la sntesis de esa cadena se detendr.

Esto ocasionar que se formen cadenas de ADN de diversos tamaos
que terminan en el mismo nucletido en cada tubo.
Las cadenas de diversos tamaos
obtenidas se separan por tamaos
mediante electroforesis en cuatro carriles
de gel de acrilamida muy finos.
Una vez terminada la electroforesis, el gel se
pone en contacto con una pelcula fotogrfica
de autorradiografa.

Avances que han mejorado el mtodo
de Sanger
PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa consiste en obtener
muchas copias de un fragmento de ADN.
consiste en varios ciclos de 3 fases, donde la temperatura
vara, esto se lleva a cabo en un termociclador.

Relevancia en el mtodo de Sanger
Se pueden sintetizar muchas copias de los fragmentos de
diversos tamaos con una terminacion especfica, de esta
manera se eleva la visibilidad de marcacin, lo que nos
permite obtener lecturas ms claras y precisas.

Polimerasa Taq
Soporta altas temperaturas. Con esta polimerasa fue posible
la automatizacin de la reaccin de PCR, ya que con las
polimerasas empleadas anteriormente se tena que agregar
una nueva durante cada ciclo debido a que se inactivaban por
falta de estabilidad durante el cambio de temperaturas.

Avances que han mejorado el mtodo
de Sanger