KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Pada zaman sekarang ini orang kembali lagi menggeluti bahan
alam sebagai bahan penting dalam membuat obat. Para ahli sekarang
ini telah memulai meneliti kembali tanaman obat untuk mengetahui
khasiat yang lebih mendalam dari tanaman tersebut.
Didaerah-daerah pedalaman, banyak masyarakat yang masih
menggunakan tumbuh-tumbuhan yang mereka anggap mempunyai
khasiat untuk pengobatan untuk beberapa penyakit tertentu, tanpa
pengetahuan dasar. Ada beberapa kasus, dimana masyarakat
menggunakan suatu obat, yang ternyata setelah diketahui zat aktifnya
melalui

ekstraksi

dan

identifikasi

komponen

kimia,

ternyata

memberikan efek yang berlawanan, hal ini tentunya membahayakan

bagi jiwa manusia.
Dari alasan tersebut di atas, maka dianggap perlu pengetahuan
yang cukup untuk mengenal berbagai macam tumbuhan yang
berkhasiat obat, mulai dari morfologi, kegunaan, prinsip-prinsip
ekstraksi, isolasi dan identifikasi komponen kimia yang terdapat dalam
suatu simplisia, khususnya bagi seorang farmasis.
Awar-awar(Ficus septic Burm) merupakan contoh dari tanaman
yang digunakan oleh masyarakat sebagai obat untuk mengobati
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

disentri, hal inilah yang melatar belakangi Awar-awar(Ficus septic

Burm) diambilnya sebagai salah satu sampel.
Dengan adanya teknik ekstraksi dan identifikasi dari tumbuhan
tersebut di atas, maka diharapkan akan diperoleh senyawa kimia /
komponen kimia dari kedua senyawa tersebut di atas. Sehingga dapat
memberikan informasi yang berguna untuk mengembangkannya lagi
lebih lanjut.
Dalam uji fitokimia ini,kita akan melakukan identifikasi sampel
dengan

menggunakan

metode

kromatografi

kolom

konvensional,dimana kolom kromatografi ini di gunakan untuk

senyawa-senyawa dalam jumlah banyak. Prinsip dari kromatografi
kolom

jenis ini adalah

kecendrungan komponen

kimia

untuk

terdistribusi ke dalam fase diam atau dengan fase gerak dengan

proses elusi berdasarkan gaya gravitasi.
I.2 Maksud dan Tujuan
I.2.1 Maksud
Adapun maksud dari praktikum ini adalah untuk mengetahui
dan memahami cara mengidentifikasi komponen kimia Awarawar(Ficus septic Burm) menggunakan metode kromatografi kolom

konvensional.
I.2.2 Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini adalah untuk melakukan
identifikasi komponen kimia dari ektrak Awar-awar(Ficus septic
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Burm) secara cepat dengan menggunakan metode kromatografi

kolom konvensional.

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Istilah kromatografi mula-mula ditemukan oleh Michael Tswett

(1908), seorang ahli botani Rusia. Nama kromatografi diambil dari bahasa
Yunani (chromato = penulisan dan grafe = warna). Kromatografi berarti
penulisan dengan warna. Kromatografi adalah cara pemisahan campuran
yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran
tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fasa bergerak
(mobile). Fasa diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa
bergerak dapat berupa zat cair atau gas (Estien, 2005).
Uraian mengenai kromatografi pertama kali dijelaskan oleh Michael
Tswett, seorang ahli biotani Rusia yang bekerja di Universitas Warsawa
Pada saat itu, Michael Tswett melakukan pemisahan klorofil dari pigmenpigmen lain dari ekstrak tanaman menggunakan kromatografi kolom yang
berisi

dengan

kalsium

karbonat.

Pada

kromatografi,

komponen-

komponen yang akan dipisahkan berada diantara dua fase yaitu fase diam
( stationary ) dan fase bergerak ( mobile). Fase diam adalah fase yang
akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak adalah fase
yang akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah
tertahan pada fase diam akan tertinggal atau tidak bergerak sedangkan
komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (
Sudarmadji, 2007 ).
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Kromatografi kolom bertujuan untuk purifikasi dan isolasi komponen

dari suatu campurannya. Metode pembuatan kolom terbagi menjadi 2
yaitu untuk metode kering, kolom pertama diisi dengan kering fase diam
bubuk, diikuti dengan penambahan fase mobile. Metode basah, sebuah
bubur disiapkan dari eluent dengan fase diam bubuk dan kemudian
dengan hati-hati dituangkan ke dalam kolom. Lapisan ini biasanya ditutupi
dengan lapisan pasir kecil atau dengan kapas atau wol kaca untuk
melindungi bentuk lapisan organik dari kecepatan baru ditambahkan
eluent. Eluent perlahan-lahan melewati kolom untuk memajukan bahan
organik (Roy, 1991).

Sebagian besar prinsip pemisahan kromatografi kolom didasarkan

pada afinitas kepolaran analite dengan fase diam, sedangkan fase gerak
selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian
besar kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar
dengan fase gerak yang non-polar dengan begitu waktu retensi akan
menjadi lebih singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan
meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom.
Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluent di
dalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau
dikurangi dengan mengontrol keran. Laju aliran yang lebih baik dapat
dicapai dengan menggunakan pompa atau dengan menggunakan gas
dengan kompresi (misalnya udara,nitrogen, argon) untuk mendorong
pelarut melalui kolom. Kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

seperti alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan
pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian diisikan
kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi oleh adsorben.
Kemudian pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes
dari atas kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke
bawah (fasa mobil) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa
stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses
adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk
masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masingmasing zat terlarut (Sastrohamidjojo, 2005).

Keuntungan kromatografi kolom yaitu dapat digunakan untuk

analisis dan aplikasi preparative, digunakan unruk menentukan jumlah
komponen campuran digunakan untuk memisahkan dan purifikasi
substansi. Kerugian kromatografi kolom yaitu untuk mempersiapkan kolom
dibutuhkan

kemampuan

teknik

dan

manual,

metode

ini

sangat

membutuhkan waktu yang lama (time consuming) (Rahman, 2009).

Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari

berbagai macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam
sistem yang terdiri dari fase diam dan fase bergerak. Semua pemisahan
pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari masing-masing
komponen diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang
tertahan (terhambat) lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

cepat daripada komponen yang tertahan lebih kuat. Perbedaan gerakan

(mobilitas) antara komponen yang satu dengan lainnya disebabkan oleh
perbedaan dalam adsorbs, partisi, kelarutan atau penguapan diantara
kedua fase. Jika perbedaan-perbedaan ini cukup besar, maka akan terjadi
pemisahan secara sempurna. (Ibnu, 2005).
Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom
sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran.
Alat tersebut dapat berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran dibagian
bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Ukuran kolom
tergantung dari banyaknya zat yang akan dipindahkan. Secara umum
perbandingan panjang dan diameter kolom sekitar 8:1, sedangkan jumlah
penyerapnya adalah 25-30 kali berat bahan yang akan dipisahkan.
Meskipun tersedia berbagai macam kolom dari bahan gelas, namun
kadang-kadang buret juga dapat digunakan (Khopkar, 2010).
Metode pemisahan kromatografi kolom memerlukan bahan kimia
yang cukup banyak sebagai fasa diam dan fasa gerak, bergantung pada
ukuran kolom gelas. Untuk melakukan pemisahan campuran dengan
metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang relatif lama, bisa
berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil
pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan
pemisahan

secara

sempurna

karena

pita

komponen

yang

satu

bertumpang tindih dengan komponen lainnya. Masalah waktu yang lama

disebabkan laju alir fasa gerak hanya dipengaruhi oleh gravitasi bumi.
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Ukuran diameter partikel yang cukup besar membuat luas permukaan

fasa diam relatif kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara
komponen-komponen dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran
diameter partikel diperkecil supaya luas permukaan fasa diam bertambah
maka menyebabkan semakin lambatnya aliran fasa gerak atau fasa gerak
tidak mengalir sama sekali. Selain itu fasa diam yang sudah terpakai tidak
dapat digunakan lagi untuk pemisahan campuran yang lain karena sukar
meregenerasi fasa diam (Chadijah, 2012).
Kromatografi kolom konvensional adalah metode kromatografi
klasik yang sampai saat ini masih banyak digunakan. Kolom konvensional
digunakan untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak.
Prinsip dari kromatografi kolom jenis ini adalah kecendrungan komponen
kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam atau fase gerak dengan
proses elusi berdasarkan gaya grafitasi (Raymond et al, 2006).
Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan
diletakkan berupa pita pada bagian atas penjerat yang berada pada kolom
kaca, logam atau bahkan plastic. Eluen (fase gerak) dibiarkan mengalir
melalui fase diam dalam kolom dan hanya disebabkan oleh gaya gravitasi
(Raymond et al, 2006).
Pita senyawa linarut bergerak bergerak melalui kolom dengan laju
yang berbeda dan memisah berdasarkan sifat kepolarannya. Pita-pita
hasil isolasi dikumpulkan dalam vial berupa fraksi ketika keluar dari kolom.

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Metode ini merupakan contoh kromatografi

cair karena linarut

dielusidalam kolom menggunakan eluen (Sudjadi, 1986).

Untuk kromatografi kolom, kolom tertentu diisi dengan bahan
penjerat/sorpsi dan pelarut pengembang dengan tingkat kepolaran yang
berbed. Kolom yang diisi dengan bahan penjerat/sorpsi yang disebut
kolom pemisah. Penggunaan kolom tergantung dari masalah pemisah
yaitu kolom berfilter dengan gelas berpori, yang pada ujung bawah
menyempit (tabung Allihn) atau tabung gelas yang pada bagian bawah
menyempit dan dilengkapi dengan kran sedangkan tabung bola jarang
digunakan. Perbandingan panjang tabung terhadap diameter pada
umumnya ialah 40 : 1. Pengisian kolom dengan absorben yang juga
disebut pengemasan kolom, harus dilakukan secara hati-hati dengan
permukaan yang rata. Aluminium oksida atau silica gel dapat dikemas
dengan metod kering ke dalam kolom. Agar pengisian rata, tabung diisi
sambil diketuk-ketuk menggunakan tangan atau benda lunak lainnya pada
dinding kolom (Stahl, 1991).

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB III

PROSEDUR KERJA

III.1 Alat dan Bahan

Adapun alat dan bahan yang digunakan pada praktikum ini
adalah sebagai berikut:
1. Alat
Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah batang
pengaduk, botol coklat, chamber, corong, gelas kimia, gelas ukur,
gunting, kolom, lempeng 7 x 0,5, sendok tanduk, statif dan vial.
2. Bahan
Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah
aluminium foil, etil asetat, kertas saring, methanol, n-heksan,
tisu, dan sampel ekstrak Awar-awar (Ficus septika Burm).
III.2 Cara Kerja
Disiapkan alat dan bahan, dikalibrasi 150 vial masing-masing
dimasukkan pelarut n-heksan sebanyak 5 ml dan diberi tanda pada
vial. Disiapkan pelarut dari non polar hingga yang paling polar yaitu
n-heksan 50 ml. Dengan perbandingan masing-masing n-heksan :
etil 10:1; 9:1; 8:2 :7:3: 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; &0:10 Selanjutnya
kolom dipasang pada statif yang sebelumnya telah dibersihkan
menggunakan pelarut n-heksan. Kemudian diisi dasar kolom dengan
kapas, kemudian di masukan silica gel kasar. Selanjutnya ditutp
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

dengan kertas saring yang ukurannya berdiameter sama dengan

kolom. Kemudian di masukan silika gel halus lalu di ratakan
permukaanya dan di mampatkan.Dimasukkan eluen 1/3 bagian
kolom,

kemudian

dibuka

kran

hingga

eluen

keluar

semua.

Selanjutnya kolom diisi dengan suspensi ektrak dan absorben, dan

ditambahkan dengan eluen hingga ekstrak terendam. Dibuka
krannya dan ditampung fraksi didalam vial 1 hingga seterusnya.
Kemudian dilanjutkan denga pelarut yang lainnya hingga mencapai
vial ke 100 dan diamati.

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB IV

HASIL PRAKTIKUM

IV.1 Tabel hasil pengamatan

Pelarut/eluen

Perbandingan

Vial ke

Warna

(mL)

Perubahan
warna

n-heksan :

10:0

1-8

Bening

etil

9:1

9-17

Bening

n-heksan :

8:2

18-25

Kuning

etil

7:3

Kuning

n-heksan :

6:4

Kuning

etil

5:5

Kuning

n-heksan :

4:6

Kuning

etil

3:7

Kuning

n-heksan :

2:8

Kuning

etil

1:9

Kuning

n-heksan :

0 : 10

Kuning

etil

50 ml

Kuning

n-heksan :
etil
n-heksan :
etil
n-heksan :
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

etil
n-heksan :
etil
n-heksan :
etil
etil asetat

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB V

PEMBAHASAN

Pada percobaan ini dilakukan identifikasi sampel ektrak awar-awar

menggunakan metode kromatografi kolom konfensional. Dimana metode
ini dapat memisahkan suatu komponen kimia dari suatu sampel dalam
jumlah banyak. Prinsip kerja dari kromatografi kolom jenis ini adalah
kecendrungan komponen kimia untuk terdistribusi ke dalam fase diam
atau fase gerak denga proses elusi berdasarkan gaya grafitasi.
Pada pengerjaan pertama, alat dan bahan yang akan digunakan
siapkan agar dapat meminimalisir dan memperlancar proses pengerjaan.
selanjutnya penyiapan pelarut dari tinggkat kepolaran terendah hingga
yang paling polar yaitu dari non polar hingga yang paling polar. hal ini
dilakukan agar dapat mengetahui pada tingkat kepolaran berapa senyawa
atau komponen kimia sampel dapat membentuk fraksi yang baik atau
terelusi dengan baik.
Selanjutnya kolom dipasang pada statif yang sebelumnya telah
dibersihkan

menggunakan

pelarut

n-heksan,

agar

meminimalkan

kontaminasi kolom dari pelarut dan bahan-bahan lain yang dapat

mengganggu aktivitas dari pemisahan komponen kimia sampel. Kemudian
diisi dasar kolom dengan kapas, ditambah silika dalam keadaan
kering,dimampatkan kemudian ditambahkan lagi pelarut,dimana silica gel
berfungsi menyerap atau mengabsorbsi komponen kimia dari sampel.
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Selanjutnya ditutup dengan kertas saring yang ukurannya berdiameter

sama dengan kolom agar sampel atau ektrak tidak cepat bercampur
dengan absorben atau silica gel dan pemisahan komponen kimia/
senyawa bekerja lebih efektif. Dimasukkan eluen 1/3 bagian kolom,
kemudian dibuka kran hingga eluen keluar semua, agar dapat
memampatkan

kapas

dan

absorben

dan

untuk

memaksimalkan

penyerapannya. Selanjutnya kolom diisi dengan suspensi ektrak dan

absorben, dan ditambahkan dengan eluen hingga ekstrak terendam agar
dapat berinteraksi antara sampel dan pereaksi sehingga senyawa dapat
tertarik oleh tingkat kepolaran dari pelarut yang berbeda-beda. Dibuka
krannya dan ditampung fraksi didalam vial 1 hingga seterusnya agar dapat
diamati dengan jelas dan tepat pada vial keberapa komponen sampel
terelusi. Kemudian dilanjutkan denga pelarut yang lainnya hingga
mencapai vial ke 100 dan diamati untuk mengetahui dan membandingkan
pada tingkat kepolaran berapa komponen kimia atau senyawa aktif dapat
terelusi dengan baik.
Dengan menggunakan metode kromatografi kolom konvensional,
dimana pemisahan senyawa dilakukan dengan cepat pada sampel ekstrak
awar-awar dalam jumlah besar yaitu menggunakan 100 vial sebagai
wadah untuk menampung fraksi yang terbentuk.

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

BAB VI

KESIMPULAN

VI.1. Kesimpulan
Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa dengan
menggunakan metode kromatografi kolom konfensional didapatkan
fraksi dalam vial sebanyak 78 vial
VI.2. Saran
Saran untuk laboratorium agar alat dan alat didalam
laboratorium harus ditambah agar dapat meminimalkan dan
mengefisienkan waktu praktikum. Terutama alat yang berhubungan
dengan praktikum ini.

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2012, Penuntun dan Buku Kerja Praktikum Fitokimia 1,
Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, Makassar.
Bresnick. S. D., 2004, Inrisari Kimia Organik, Penerbit Hipokrates,
Jakarta.

Bruneton, J., "Pharmacognosy Phtochemistry Medical Plants" , Technique

& Documentation-Lavoister.
Sri Marhani Hasanuddin
150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Dirjen POM, 1979, "Farmakope Indonesia Edisi III", Departemen

Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta.

Djamil, R., Iwang S., dan Komar R., 1998, Telaah Fitokimia dan Uji Hayati
Pendahuluan Ulva Fasciata Delile, Sekolah Farmasi ITB.

Harborne. I.B., "Metode Fitokimia" , terjemahan K. Radmawinata dan I.

Soediso, penerbit ITB, Bandung, 1987.

Duke, J.A.,1985. "Handbook of Medicinal Herb" , CRC Press Inc., Boca

Raton.
Heyne, K.,1987.

"Tumbuhan Berguna Indonesia" , Jil. II, terjemahan

Badan Litbang Kehutanan Jakarta, Yayasan Santana Warna

Jaya, Jakarta.
Kasahara, S. and S. Hemmi, 1995. "Medicinal Herb Index in Indonesia",
PT. Eisai Indonesia, Jakarta.

Sabarwati, 2006."Pharmacochemical Investigation on Raw Materials of

Passiflora Edulis Forma Flavicarpa" , Planta Med.

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R

KROMATOGRAFI KOLOM KONVENSIONAL

Steenis, van Dr., 1992, Flora untuk Sekolah di Indonesia, PT.

Pradnya Paramita, Jakarta.

Sudjadi, Drs., 1986, Metode Pemisahan, UGM Press, Yogyakarta.

Markham. K.R., 1988. "Cara Mengindentifikasi Flavonoid" , terjemahan K.

Radmawinata, Penerbit ITB, Bandung.
Verheij, E.W.M and R.E. Coronel (Eds.), 1992. "Plant Resources of South
East Asia, Edible Fruits and Nuts" , Prosea Foundation, Bogor

Sri Marhani Hasanuddin

150 2011 0054

Rizki Yulianti R