Electroforesis de cidos Nucleicos en Gel de Agarosa

Electroforesis es la migracin de las molculas cargadas presentes en una

solucin acuosa como respuesta a la presencia de un campo elctrico,
dichas molculas son atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. Dos
fuerzas de accin opuesta determinan la velocidad de la partcula en
cuestin. Por un lado, la fuerza elctrica, que la atrae al electrodo, cuya
intensidad es directamente proporcional a la carga, y, de acuerdo a la
segunda ley de Newton (F=m x a, entonces a=F/m), le impone una
aceleracin directamente proporcional al cociente carga/masa (q/m). Por
otro lado, la fuerza de rozamiento, que se opone a la migracin con una
intensidad que depende del tamao y la forma de la partcula y de las
caractersticas del medio (viscosidad y estructura, por ejemplo).

La electroforesis es una tcnica habitual en el laboratorio clnico. Permite

separar especies qumicas (cidos nucleicos o protenas) a lo largo de un
campo elctrico en funcin de su tamao y de su carga elctrica. Los
cidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga negativa. Si
ponemos fragmentos del ADN extrado de una muestra biolgica sobre un
soporte poroso (gel) y aplicamos un campo elctrico, se producir la
migracin diferencial de los fragmentos a travs de los poros de la matriz.
La tincin del gel con bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente
que se intercala en la molcula de ADN, y la exposicin con luz ultravioleta,
permite observar el resultado de sta migracin. El tamao de los
fragmentos de ADN se puede estimar comparndolos con el patrn de
bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular
conocido. La electroforesis de ADN es til para comparar patrones de
bandas de diferentes muestras biolgicas. As por ejemplo se puede usar

para comparar muestras de individuo sano frente a individuo enfermo,

para la identificacin de cidos nucleicos de agentes infecciosos o para la
obtencin de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en
el gel, puede ser extrado para anlisis posteriores.

Los cidos nucleicos estn cargados de forma negativa debido a su

esqueleto de grupos fosfato. Por lo tanto, en una electroforesis, los cidos
nucleicos migrarn hacia el polo positivo, es decir, el nodo.

La agarosa puede se utilizada como soporte para la corrida electrofortica.

La agarosa es un polisacrido extrado de algas marinas que tiene la
propiedad de mantenerse en estado slido a temperatura ambiente pero
que a altas temperaturas se torna lquida. Esta caracterstica permite una
fcil preparacin de una matriz porosa para ser usada en electroforesis:
simplemente se pesa la cantidad de agarosa requerida, se disuelve en un
amortiguador adecuado, se calienta y se chorrea sobre un molde
particular.

La concentracin de agarosa tpicamente utilizada para electroforesis est

entre el 0.5 % y el 2%. La concentracin a usar se escoge segn el tamao
del cido nucleico a analizar. Esto porque la concentracin de agarosa
define el tamao de los poros de la matriz, a mayor concentracin, menor
el tamao de los poros y viceversa. Durante la electroforesis, los cidos
nucleicos lineales con un alto peso molecular migrarn al nodo ms
lentamente que cidos nucleicos lineales con un menor peso molecular. La
razn de esto es que los cidos nucleicos de alto peso tardan ms tiempo
en atravesar los poros de agarosa. En el caso de cidos nucleicos no
linealizados, como plsmidos circulares en conformacin nativa, la
migracin no solo depender del peso molecular sino tambin de otros
aspectos como el grado de superenrrollamiento que ste poseea.

Generalmente en una preparacin de plsmido se pueden observar

distintas conformaciones de la misma molcula, la forma superenrrollada,
la forma semi relajada y una relajada.

La electroforesis se utiliza en el laboratorio para separar macromolculas

en solucin, en forma analtica (es decir, slo para verlas) o preparativa
(para purificarlas). Los cidos nucleicos tienen un fosfato cargado
negativamente por nucletido. Como el peso molecular de los cuatro
nucletidos es similar, la relacin q/m es independiente de la secuencia y
el tamao de la molcula. Por lo tanto la aceleracin impuesta por la fuerza
elctrica es igual para cualquier molcula de cido nucleico. La nica
diferencia en velocidad de migracin estar dada por diferencias en la
fuerza de rozamiento, o sea de su forma y de su tamao.

En el caso del DNA doble cadena, la forma es la misma para cualquier

molcula, entonces las distintas molculas tendrn una velocidad que slo
depender de su tamao, es decir, de su longitud en pares de bases. Sin
embargo, si tratramos de separar molculas de DNA doble cadena en una
electroforesis en una solucin acuosa, nos encontraramos con que el
rozamiento impuesto por sta es tan pequeo que todas las molculas
migraran juntas. Adems, durante la electroforesis, las molculas se
separaran unas de otras por difusin, impidiendo el anlisis. Para lograr
una separacin eficiente, se utiliza un medio soporte que aumente
considerablemente la friccin recibida por las macromolculas y reduzca la
difusin a un mnimo.

Los cidos nucledos separados en geles de agarosa pueden visualizarse

mediante tincin con colorantes fluorescentes, lo cual permite evaluar su

integridad y estimar su concentracin mediante un anlisis comparativo

con patrones de concentracin conocida. Los colorantes fluorescentes
actan mediante insercin entre las pares de bases que conforman el cido
nucleco. El bromuro de etidio es ampliamente utilizado para la
visualizacin de ADN y ARN. Al gel de agarosa se le aade bromuro de
etidio, un compuesto que se une a los cidos nucleicos y que fluoresce
cuando se ilumina con luz UV. Sin embargo, ste es un reactivo altamente
txico, con propiedades mutagnicas, por lo que debe ser manejado con
extremo cuidado en el laboratorio. En la actualidad existen colorantes
fluorescentes alternativos, como SYBR Safe, SYBR Gold, SYBR Green I,
Vistra Green y Syto60, desarrollados especficamente para reducir los
riesgos potenciales de mutagnesis.

La tcnica para la cuantificacin de ADN consiste simplemente en la

utilizacin de una secuencia de concentraciones de solucin patrn de ADN
con la que se comparan muestras de ADN de concentracin desconocida. El
clculo de las concentraciones se hace bajo la luz ultravioleta segn la
fluorescencia. Debe evitarse la exposicin prolongada a la luz ultravioleta,
incluso con mscara de proteccin. La estimacin de las concentraciones
de ADN puede realizarse sobre una fotografa digital del gel tomada bajo
luz ultravioleta si se cuenta con un analizador de imgenes .

Las mezclas de DNAs de distinto tamao se hacen migrar (desplazarse) a

travs del gel durante un cierto tiempo y se obtiene una separacin en la
que la distancia migrada por una molcula dada es inversamente
proporcional al logaritmo de su peso molecular (o de su longitud en pares
de bases). El tamao de una muestra desconocida puede estimarse
corriendo en paralelo muestras de longitud conocida.

Cuando se hace un anlisis electrofortico de muestras de cidos nucleicos

que no poseen todos la misma forma, debido, por ejemplo, a la presencia
de estructuras secundarias que dependen del apareamiento interno, o sea,
de la secuencia (RNA o DNA simple cadena), es necesario, para determinar
su peso molecular, homogeneizar su estructura. Para ello se utilizan
agentes desnaturalizantes fuertes que destruyan la estructura secundaria,
por ejemplo urea, formamida, formaldehdo o pH bsico (para DNA).

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Conclusiones
1. Durante la electroforesis, los cidos nucleicos lineales con un
alto peso molecular migrarn al nodo ms lentamente que cidos
nucleicos
Lineales con un menor peso molecular. La razn de esto es que los
cidos nucleicos
de alto peso tardan ms tiempo en atravesar los poros de agarosa.

2. En electroforesis tambin se pueden utilizar geles de Poliacrilamida

sin embargo se Prefiere utilizar la Gel de Agarosa ya que una ventaja
que posee la agarosa sobre la poliacrilamida es que no es un
compuesto txico y adems permite el anlisis de cidos nucleicos
con pesos moleculares muy variados. Los poros de la Agarosa son
mas pequeos.
3. Una ves terminada la electroforesis procederemos a desechar todo el
gel sobrante en una Bolsa para Luego enterrarla ya q esta contiene
Bromuro de Etidio el cual sabemos que es un Cancergeno altamente
Toxico y con propiedades mutagnicas de esta menera(enterrndolo)
evitaremos riegos a la salud.