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Rev 23/09/2003
El hecho de que las proteínas se pliegen solas de una manera tan fidedigna es
una paradoja aún no resuelta, y formulada por primera vez por Levinthal. Esta paradoja
se formula de la siguiente manera. Una cadena polipeptídica pequeña tiene 100
residuos, solo contando los ángulos φ y ψ y contando que cada 30 grados se tiene una
conformación diferente tenemos para cada residuo tendremos 144 confórmeros y para la
proteína en su conjunto un total de 12200 confórmeros distintos. Si suponemos (y es una
suposición muy favorable) que cada 10 fs podemos cambiar de uno a otro confórmero
tendremos que para explorar todo el espacio conformacional la proteína necesitaría unos
10173 millones de años para plegarse. Un tiempo infinitamente superior a la edad del
universo. En realidad el tiempo de plegamiento de una proteína oscila entre el
microsegundo al minuto.
Como toda paradoja ésta no tiene una solución obvia, y durante muchos años ha
existido un fuerte debate al respecto. A lo largo de este capítulo veremos algunas ideas
de cómo pensamos hoy que que la proteína consigue resolverla.
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E. Macromoléculas. Rev 23/09/2003
Interacciones de enlace
La forma nativa de las proteínas presenta todas las distancias y casi todos los
ángulos próximos a los valores de equilibrio. La gran mayoría de las torsiones están
también en sus zonas estéricamente más favorecidas (e.j. mínimos mapa de
Ramachandran). Respecto a los enlaces amida en general se encuentran en la
conformación trans, con la excepción de las prolinas que a veces se encuentran en la
conformación cis. Es de destacar que el cambio de prolinas de conformación cis a trans
es muy importante in vivo y que incluso existen enzimas dedicado a catalizar este
proceso (las peptidyl-proline-isomerases o rotamases).
Unos enlaces covalentes que merecen especial atención son los puentes
disulfuro. Estos puentes se forman entre 2 cisteinas cuyas cadenas laterales se
encuentran próximas en el espacio. Los puentes disulfuros estabilizan en general la
estructura de la proteína como lo demuestra que las proteínas de vida extracelular
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tengan una gran riqueza de los mismos. No obstante, en general los puentes disulfuro no
mejoran la cinética del plegamiento, ya que a lo largo del mismo se forman (y han de
romperse) puentes disulfuro no nativos y esto puede hacer muy lento el proceso de
plegamiento. De hecho, proteínas que se pliegan en microsegundos pueden tardar
minutos si existen posibilidades de formar puentes disulfuro no nativos en el
plegamiento. La naturaleza ha diseñado las Protein Disulfide Isomerases como un
mecanismo para facilitar la formación de los puentes disulfuro nativos y desestabilizar
los no nativos.
Interacciones no enlazantes
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Durante muchos años se pensó que como en otros sistemas químicos, los
términos de enlace eran los que determinaban la estructura tridimensional de las
proteínas. Esto fue refutado por Alfinsen a principios de los sesenta (PNAS, 47, 1309
(1961)) cuando realizó un experimento clave que demostró que son las interacciones
no-enlazantes y no las enlazantes (puentes disulfuro) las que guían el plegamiento. Para
este experimento Anfinsen cogió ribonucleasa, una proteína pequeña (14000 Daltons) y
que tiene 4 puentes disulfuro. Desnaturalizó el enzima con urea y b-mercaptoetanol la
solución resultante la dividió en dos alícuotas P1 y P2. A la alícuotas P1 le eliminó
primero el β-mercaptoetanol, dejo reposar y le eliminó luego la urea (alícuota resultante
P1bis). A la alícuotas P2 le eliminó primero la urea, y luego el β-mercaptoetanol
(alícuota resultante P2b). Una vez hecho esto miro la actividad enzimática de P1bis y
P2bis. Encontró que la alícuota P2b había mucha actividad enzimática, mientras que en
P1b prácticamente no había nada. Esto demostraba que eran las interacciones no-
enlazantes y no las interacciones enlazantes las que guiaban el plegamiento de las
proteínas.
−β-Mercapto
-urea
-urea
β-Mercapto
−β-Mercapto
-urea
Figura 1. Esquema del experimento de Anfinsen. Rojo significa alícuota no activa, azul
activa
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En un principio se pensó que eran los puentes salinos dada su alta estabilidad los
responsables del plegamiento. Esta hipótesis está actualmente descartada por diversos
hechos: i) no todas las proteínas tienen puentes salinos, ii) el número de puentes salinos
que se forma en una proteína nativa es solo una porción de los que se podrían formar,
iii) los grupos cargados se encuentran mayoritariamente hacia el exterior de la proteína,
no hacia el interior que es donde prediciría la hipótesis de que son claves. Además,
cálculos teóricos han demostrado que la formación de puentes salinos en agua está
desfavorecida por el alto coste que supone desolvatar los iones que forman el par.
Recientemente, la mutagénesis dirigida ha demostrado que los puentes salinos no son
vitales para la estructura, ni aún en casos en los que están en el interior de la proteína.
En el experimento (Nature Structural Biology, 2, 122 (1995)) los autores cogieron una
proteína represor Arc que posee un puente salino interno doble (Arg31, Glu36, Arg40) y
mutaron los tres residuos por tres residuos apolares, en concreto por Met, Tyr y Leu
(respectivamente). La proteína resultante que ganaba contactos hidropóbicos, pero que
perdia el puente salino resultó ser mas de 4 kcal/mol más estable que la proteína nativa!.
En resumen, los puentes salinos pueden ser importantes para mantener zonas
concretas de proteínas, claves en el reconocimiento, y pueden ser importantes en la guía
del plegamiento, pero parece que no son los determinantes del mismo.
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Así pues, no existe una fuerza única responsable del plegamiento de la proteína,
sino que dicho plegamiento depende de un conjunto de interacciones muchas de ellas de
escasa intensidad. Más importante aún para entender el plegamiento de una proteína es
pensar que la proteína es una cadena polipeptídica sumergida en agua, y que la
estructura de la misma cambia drásticamente a lo largo del procesos de plegamiento.
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Cuando una cadena polipeptídica esta desordenada en agua sus grupos polares y
apolares se encuentran rodeados de moléculas de agua. El agua cuando está cercana a
los grupos apolares expuestos (lo que pasa en la forma desnaturalizada) no puede
interaccionar intensamente con ellas y reacciona formando estructuras poliédrica
altamente ordenadas alrededor del soluto. Estas estructuras tienen por objeto maximizar
la estabilidad intrínseca del agua entorno al soluto, pero tiene como inconveniente su
gran orden que hace que cuando estas estructuras se forman aumente el orden del agua.
Cuando 2 grupos hidrofóbicos se encuentran en solución cada uno de ellos forma uno
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de estos poliedros de alta ordenación, con lo que la situación entrópica será peor. La
respuesta del sistema es la de comprimir los 2 grupos apolares (igual que 2 gotas de
aceite en agua) para que al juntarse el area accesible al solvente del conjunto se reduzca.
De esta manera los poliedros de alto orden se hacen más pequeños (que la suma de los 2
poliedros que existen antes de la fusión) liberándose en el proceso moléculas de agua
que aumentan el desorden del solvente. El efecto descrito se conoce como “efecto
hidrofóbico” y es el que hoy se asume que guía el plegamiento de la proteína hasta un
estado de colapso hidrofóbico (el molten globule), una forma compacta donde los
residuos apolares ya están hacia el interior. La evolución de este estado compacto a la
forma nativa es entonces mucho más sencilla, ya que implica solo movimientos locales.
Así pues, el mecanismo cinético del plegamiento de una proteína dista de estar
claro. Durante mucho tiempo se asumió como cierto que existian solo 2 estados: el
nativo y el desnaturalizado. El paso de uno a otro sería vía un estado de transición y no
existirían intermedios de ningún tipo. Los datos en los que este modelo se apoya son
sólidos, derivados fundamentalmente de datos de calorimetría, y a la fuerte
cooperatividad del plegamiento. Alternativamente se han desarrollado otros modelos
que dice que el plegamiento se da por núcleos. Es decir que no es un proceso de “todo o
nada” sino que el plegamiento se organizaría por una serie de puntos (centros de
nucleación) que se compactarían para dar una estructura que evolucionaría hacia la
terciaria. Este último modelo predice la existencia de formas intermediarias del
plegamiento. Alguna de ellas parece asumida como es el “molten globule” sugerido
teóricamente y encontrado experimentalmente en algunas proteínas. Este “molten
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globule” vendria a ser como una estructura nativa desordenada, con los elementos
fundamentales del empaquetamiento ya definidos, pero carente de la definición fina de
la estructura.
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