Departamento de Microbiologia

Instituto de Cincias Biolgicas

Universidade Federal de Minas Gerais
http://www.icb.ufmg.br/mic/diaadia

Hemaglutinao e Inibio da Hemaglutinao

Introduo

As reaes de Hemaglutinao (HA) e de Inibio da Hemaglutinao (IHA) so mtodos

indiretos de, respectivamente, deteco e quantificao de vrus e de anticorpos especficos
contra o vrus. Estes mtodos se baseiam em um processo no qual as hemcias se agregam
(aglutinao) devido a interao com determinados vrus.
Os vrus capazes de causar a aglutinao de hemcias so chamados hemaglutinantes e o
que confere a eles essa caracterstica a presena da glicoprotena Hemaglutinina na
superfcie da partcula viral. A hemaglutinina tem como receptor celular uma mucoprotena que
contm radicais de cido nacetlineuramnico (NANA), abundantes em hemcias e tambm em
clulas do trato respiratrio. Esta interao observada no ensaio de reao de
hemaglutinao pela formao de uma malha de hemcias devido sedimentao difusa,
enquanto que as hemcias que no sofreram aglutinao se depositam no fundo do poo na
forma de um boto compacto.
Para a realizao da reao de Hemaglutinao (HA) as hemcias em suspenso so
colocadas em contato com uma suspenso de vrus. Se a concentrao de vrus for
suficientemente alta, haver formao de mltiplas pontes entre eles e as hemcias, que se
depositaro de forma difusa. Como resultado temos o indicativo da presena do vrus e o ttulo
deste vrus em unidades hemaglutinantes.
J para a reao de Inibio da Hemaglutinao (IHA) partese do princpio que a infeco
causada por um vrus hemaglutinante induz a produo de anticorpos especficos capazes de
se ligar hemaglutinina deste vrus, inibindo ento a reao de hemaglutinao. Ensaios com
diferentes objetivos podem ser realizados, como por exemplo a identificao de um agente
viral a partir da reao com anticorpos conhecidos ou o diagnstico de uma infeco a partir da
reao com agentes virais conhecidos.
Objetivos

Aps a realizao desta prtica, o aluno estar apto a fazer a qualificar e quantificar a
capacidade de um vrus em causar hemaglutinao, alm de determinar se h em um soro
anticorpos capazes de inibir tal processo.

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Reao de HA
Materiais

Soluo de vrus
Placas de plstico de 96 poos de fundo abaulado
Soro fisiolgico
Pipetador automtico e ponteira
Suspenso de hemcias a 1%.

Execuo

Fazer uma diluio seriada na razao de dois da soluo de vrus em soluo, conforme a
Figura 1, desprezando 0,1 mL da ltima. A cmara controle no deve receber a soluo
contendo o vrus.
a

soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

Controle

1:32

1:64

Controle

soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:4

1:8

1:16

Figura 1: Diluio seriada do vrus. Em (a) e (b) o esquema da diluio seriada. Em (c) uma foto do
procedimento. Inicialmente preencha todos os poos a serem utilizados com 100L de soluo salina (a). Depois
coloque 100L da soluo de vrus no primeiro poo, homogeneze e ento transfira para o poo seguinte.
Repita o procedimento at o ltimo poo e depois de homogeneizar, descarte 100L (b). O procedimento deve
ser realizado em placa de fundo redondo (c).

Agitar suavemente o frasco que contm a suspenso de hemcias a 1% e colocar 0,1 mL em

todas as cmaras, a partir da cmara Controle (C).

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b
soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:8

1:4

1:16

1:32

1:64

Controle

Figura 2: da soluo de hemcia. Em (a) a representao e em (b) uma foto do procedimento. Coloque 100L
da soluo de hemcias em cada poo (a).

Agitar suavemente a placa para propiciar o contacto das partculas vricas com as hemcias
Incubar as placas a 40C por 3060 minutos para que as hemcias se depositem

b
Figura 3 :Padro de depsito das hemcias. Em (a) a
deposio em boto, quando no ocorre a hemaglutinao.
Em (b) o lenol, formado devido a ocorrncia da
hemaglutinao.

Leitura e Interpretao

A formao de lenol ou membrana indica uma interao das clulas por pontes estabelecidas
pelas partculas de vrus e a reao de hemaglutinao positiva. A formao de um anel ou
boto indica reao negativa. O ttulo hemaglutinante do vrus expresso pela maior diluio em
que houve a aglutinao de maneira ntida e evidente.

Resultados

Anote o padro de depsito e o ttulo hemaglutinante do vrus

Tabela 1: Ttulo hemaglutinante do vrus.

Diluies
Padro de
depsito

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

Controle

Ttulo
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b
Figura 4: Resultado da reao de hemaglutinao.
Em (a) a foto e em (b) a representao
esquemtica. Reao positiva (formao de lenol)
nos seis primeiros poos, que correspondem s
diluies 1:2 , 1:4 , 1:8 , 1:16, 1:32 e 1:64. O
ltimo poo o controle e apresenta reao
negativa (formao de boto). O ttulo
hemaglutinante do vrus, neste teste, no pode ser
determinado. Para que se possa encontrar o ttulo
devemos fazer outras diluies alm da 1:64.

Inibio da Reao de HA
Materiais

Soro pareado
Vrus parainfluenza 1 (diluio contendo 4 UHA)
Soluo salina
Hemcias a 1%
Pipetador, ponteiras e placas de plstico de 10 cmaras.
Execuo

Fazer uma diluio seriada na razo de dois do soro coletado durante a fase aguda em
soluo salina, conforme a Figura 5, desprezando 0,1 mL da ltima. Preencher mais dois
poos com 0,1mL de soluo salina pra serem usados como controle de vrus e de hemcia.
a

soro
soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:4

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

Controle Controle
Vrus Hemcia

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soro
soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:4

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

Controle Controle
Vrus Hemcia

Figura 5: Diluio seriada do soro. Coloque 100L de soluo salina nos

poos a serem utilizados (a). Coloque 100L de soro no primeiro poo,
homogeneze e transfira 100L para o prximo poo. Repita o processo at o
poo 1:256, quando ento devese desprezar 100uL. Aos dois poos
reservados para o controle coloque apenas soluo salina (b).

Repetir o processo com o soro coletado na fase convalescente

Adicionar a soluo de vrus s diluies dos soros e a um dos poos contendo apenas a
soluo salina, que ser o controle de vrus (Figura 6). Incubar a temperatura ambiente por 10
minutos.
soro
soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:4

1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

Controle Controle
Vrus Hemcia

Figura 6: Adio da soluo de vrus. Coloque 100L da soluo de vrus em

cada poo contendo a diluio do soro e no poo do controle de vrus (CV).

Adicionar soluo de hemcias aos poos contendo o soro, ao CV e ao poo contendo

apenas soluo salina, que ser o controle de hemcias (Figura 7).

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soro
soluo salina
soluo de vrus
soluo de hemcias

1:2

1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

Controle Controle
Vrus Hemcia

Figura 7: Adio de hemcias. Coloque 100L da soluo de hemcia em todos

os poos, incluindo o controle de vrus e o controle de hemcias.

Agitar suavemente e manter a temperatura ambiente at haver a sedimentao/depsito das

hemcias (30 min. a 60 min.). Fazer a leitura.

Leitura e Interpretao

Observar o padro de depsito das hemcias no fundo das cmaras. No poo do controle
de hemcias deve ser observada a formao do boto de hemcias, devido sedimentao
das clulas. J no poo do controle de vrus deve ser observada a formao do lenol, devido
sedimentao difusa das clulas, caracterstico da reao de hemaglutinao. A observao
dessas caractersticas nos respectivos controles um indicativo de que o teste est
funcionando conforme o esperado e que os resultados so confiveis.

Resultados

Anote o padro de depsito e o ttulo dos soros da fase aguda e da fase convalescente.
Tabela 2: Titulao do soro da fase aguda.

Diluies
Padro de
depsito

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128

Controle

Ttulo
Tabela 3: Titulao do soro da fase convalescente.

Diluies

1/2

1/4

1/8

1/16

1/32

1/64

1/128 Controle de Controle de

vrus
hemcia

Padro de
depsito
Ttulo

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Na fase aguda (Figura8.a e b), apenas os dois primeiros poos, correspondentes s diluies
1:2 e 1:4, apresentaram a deposio de padro boto resultante da inibio da
hemaglutinao. Nos demais poos no houve a inibio da hemaglutinao, observado pela
formao do lenol de hemcias. O ttulo do anticorpo na fase aguda ento foi de 4 unidades
hemaglutinantes. Na fase convalescente (Figura8.c e d), os poos com as diluies de 1:2 a
1:64 apresentaram padro de depsito da forma de boto, representando a inibio da
hemaglutinao. Nos poos das diluies 1:128 e 1:256 o padro de depsito foi o lenol,
formado em decorrncia da hemaglutinao. O ttulo do anticorpo esta representado ento
pela ltima diluio na qual foi possvel observar a inibio da hemaglutinao, 1:64.
a

Figura 8: Resultado da reao de inibio da hemaglutinao do soro da

fase aguda (a e b) e da fase convalescente (c e d). Em a e c a foto e em b
e d a representao esquemtica do resultado
.

Referncias Bibliogrficas

MADIGAN, Michael T. MARTNKO, John M. PARKER, Jack. Microbiologia de Brock. 12 ed.

Editora: Artmed. So Paulo 2010.
TORTORA, G. J. FUNKE, B. R. CASE, C. L. Microbiologia. 8a ed.,
Porto Alegre. Ed. Artmed, 2005.
MURRAY, Patrick R ROSENTHAL, Ken S PFALLER, Michael A. Microbiologia mdica.
Rio de Janeiro Elsevier, 2010.
ERICHSEN, Elza Santiago VIANA, Luciana de Gouva FARIA, Rosa Malena Delbone de
SANTOS, Silvana Maria Eli. Medicina laboratorial para o clnico.
Belo Horizonte.COOPMED, 2009.

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