Viviana Escobar

Lab. Biologa Molecular Optativa

F.Ciencias UNAM

Viviana Escobar
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Propiedades,

representaciones grficas
y manipulacin del DNA

Viviana Escobar
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Viviana Escobar
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Extremos 5 (fosfato) y 3 (hidroxilo) del DNA

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Sntesis del DNA en direccin 5 3

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Alfabeto degenerado del DNA

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Cadenas del DNA

Cadena codificante, +:

5 ATCGACCTTGACTAGTCCGTAGC 3
Secuencia complementaria, -, molde o templado: |||

3 TAGCTGGAACTGATCAGGCATCG 5
Secuencia reversa:

3 CGATGCCTGATCAGTTCCAGCTA 5
Secuencia antiparalela (reversa complementaria): |||

5 GCTACGGACTAGTCAAGGTCGAT 3

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Cadena codificante

El cdigo gentico
TTT
TTC
TTA
TTG

(AAA)
(GAA)
(TAA)
(CAA)

Phe
Phe
Leu
Leu

F
F
L
L

TCT
TCC
TCA
TCG

(AGA)
(GGA)
(TGA)
(CGA)

Ser
Ser
Ser
Ser

S
S
S
S

TAT
TAC
TAA
TAG

(ATA)
(GTA)
(TTA)
(CTA)

Tyr
Tyr
Och
Amb

Y
Y
*
*

TGT
TGC
TGA
TGG

(ACA)
(GCA)
(TCA)
(CCA)

Cys
Cys
Opa
Trp

C
C
*
W

CTT
CTC
CTA
CTG

(AAG)
(GAG)
(TAG)
(CAG)

Leu
Leu
Leu
Leu

L
L
L
L

CCT
CCC
CCA
CCG

(AGG)
(GGG)
(TGG)
(CGG)

Pro
Pro
Pro
Pro

P
P
P
P

CAT
CAC
CAA
CAG

(ATG)
(GTG)
(TTG)
(CTG)

His
His
Gln
Gln

H
H
Q
Q

CGT
CGC
CGA
CGG

(ACG)
(GCG)
(TCG)
(CCG)

Arg
Arg
Arg
Arg

R
R
R
R

ATT
ATC
ATA
ATG

(AAT)
(GAT)
(TAT)
(CAT)

Ile
Ile
Ile
Met

I
I
I
M

ACT
ACC
ACA
ACG

(AGT)
(GGT)
(TGT)
(CGT)

Thr
Thr
Thr
Thr

T
T
T
T

AAT
AAC
AAA
AAG

(ATT)
(GTT)
(TTT)
(CTT)

Asn
Asn
Lys
Lys

N
N
K
K

AGT
AGC
AGA
AGG

(ACT)
(GCT)
(TCT)
(CCT)

Ser
Ser
Arg
Arg

S
S
R
R

GTT
GTC
GTA
GTG

(AAC)
(GAC)
(TAC)
(CAC)

Val
Val
Val
Val

V
V
V
V

GCT
GCC
GCA
GCG

(AGC)
(GGC)
(TGC)
(CGC)

Ala
Ala
Ala
Ala

A
A
A
A

GAT
GAC
GAA
GAG

(ATC)
(GTC)
(TTC)
(CTC)

Asp
Asp
Glu
Glu

D
D
E
E

GGT
GGC
GGA
GGG

(ACC)
(GCC)
(TCC)
(CCC)

Gly
Gly
Gly
Gly

G
G
G
G

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Traduccin de un marco abierto de lectura (ORF):

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Marcos de lectura (5 3)

TTT
TTC
TTA
TTG

(AAA)
(GAA)
(TAA)
(CAA)

Phe
Phe
Leu
Leu

F
F
L
L

TCT
TCC
TCA
TCG

(AGA)
(GGA)
(TGA)
(CGA)

Ser
Ser
Ser
Ser

S
S
S
S

TAT
TAC
TAA
TAG

(ATA)
(GTA)
(TTA)
(CTA)

Tyr
Tyr
Och
Amb

Y
Y
*
*

TGT
TGC
TGA
TGG

(ACA)
(GCA)
(TCA)
(CCA)

Cys
Cys
Opa
Trp

C
C
*
W

CTT
CTC
CTA
CTG

(AAG)
(GAG)
(TAG)
(CAG)

Leu
Leu
Leu
Leu

L
L
L
L

CCT
CCC
CCA
CCG

(AGG)
(GGG)
(TGG)
(CGG)

Pro
Pro
Pro
Pro

P
P
P
P

CAT
CAC
CAA
CAG

(ATG)
(GTG)
(TTG)
(CTG)

His
His
Gln
Gln

H
H
Q
Q

CGT
CGC
CGA
CGG

(ACG)
(GCG)
(TCG)
(CCG)

Arg
Arg
Arg
Arg

R
R
R
R

ATT
ATC
ATA
ATG

(AAT)
(GAT)
(TAT)
(CAT)

Ile
Ile
Ile
Met

I
I
I
M

ACT
ACC
ACA
ACG

(AGT)
(GGT)
(TGT)
(CGT)

Thr
Thr
Thr
Thr

T
T
T
T

AAT
AAC
AAA
AAG

(ATT)
(GTT)
(TTT)
(CTT)

Asn
Asn
Lys
Lys

N
N
K
K

AGT
AGC
AGA
AGG

(ACT)
(GCT)
(TCT)
(CCT)

Ser
Ser
Arg
Arg

S
S
R
R

GTT
GTC
GTA
GTG

(AAC)
(GAC)
(TAC)
(CAC)

Val
Val
Val
Val

V
V
V
V

GCT
GCC
GCA
GCG

(AGC)
(GGC)
(TGC)
(CGC)

Ala
Ala
Ala
Ala

A
A
A
A

GAT
GAC
GAA
GAG

(ATC)
(GTC)
(TTC)
(CTC)

Asp
Asp
Glu
Glu

D
D
E
E

GGT
GGC
GGA
GGG

(ACC)
(GCC)
(TCC)
(CCC)

Gly
Gly
Gly
Gly

G
G
G
G

Traduccin en seis marcos de lectura (5

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3)

3
2
1
1(r)
3(r)
2(r)

TTT
TTC
TTA
TTG

(AAA)
(GAA)
(TAA)
(CAA)

Phe
Phe
Leu
Leu

F
F
L
L

TCT
TCC
TCA
TCG

(AGA)
(GGA)
(TGA)
(CGA)

Ser
Ser
Ser
Ser

S
S
S
S

TAT
TAC
TAA
TAG

(ATA)
(GTA)
(TTA)
(CTA)

Tyr
Tyr
Och
Amb

Y
Y
*
*

TGT
TGC
TGA
TGG

(ACA)
(GCA)
(TCA)
(CCA)

Cys
Cys
Opa
Trp

C
C
*
W

CTT
CTC
CTA
CTG

(AAG)
(GAG)
(TAG)
(CAG)

Leu
Leu
Leu
Leu

L
L
L
L

CCT
CCC
CCA
CCG

(AGG)
(GGG)
(TGG)
(CGG)

Pro
Pro
Pro
Pro

P
P
P
P

CAT
CAC
CAA
CAG

(ATG)
(GTG)
(TTG)
(CTG)

His
His
Gln
Gln

H
H
Q
Q

CGT
CGC
CGA
CGG

(ACG)
(GCG)
(TCG)
(CCG)

Arg
Arg
Arg
Arg

R
R
R
R

ATT
ATC
ATA
ATG

(AAT)
(GAT)
(TAT)
(CAT)

Ile
Ile
Ile
Met

I
I
I
M

ACT
ACC
ACA
ACG

(AGT)
(GGT)
(TGT)
(CGT)

Thr
Thr
Thr
Thr

T
T
T
T

AAT
AAC
AAA
AAG

(ATT)
(GTT)
(TTT)
(CTT)

Asn
Asn
Lys
Lys

N
N
K
K

AGT
AGC
AGA
AGG

(ACT)
(GCT)
(TCT)
(CCT)

Ser
Ser
Arg
Arg

S
S
R
R

GTT
GTC
GTA
GTG

(AAC)
(GAC)
(TAC)
(CAC)

Val
Val
Val
Val

V
V
V
V

GCT
GCC
GCA
GCG

(AGC)
(GGC)
(TGC)
(CGC)

Ala
Ala
Ala
Ala

A
A
A
A

GAT
GAC
GAA
GAG

(ATC)
(GTC)
(TTC)
(CTC)

Asp
Asp
Glu
Glu

D
D
E
E

GGT
GGC
GGA
GGG

(ACC)
(GCC)
(TCC)
(CCC)

Gly
Gly
Gly
Gly

G
G
G
G

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Mapa de Restriccin

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Mapa de Restriccin 2

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Enzimas comunes para modificar DNA

DNA polimerasas (sntesis 5 3)
Mesfilas
Termfilas
Transcriptasa Reversa (RNA DNA)
5

cebadores
3 dNTPs, Mg2+

Ligasas
P
P

Mg2+, ATP 5
P

P
P

3
P 5

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Enzimas comunes para modificar DNA

Fosfatasas(hidrlisis de grupos fosfato)
5P

3
P5

5 OH
3

3
OH

Cinasas(fosforilacin)
5 P
3 OH

3 Mg2+, DTT, [32]ATP 5 P

P 3

3 P

PP 5

OH
P

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Enzimas comunes para modificar DNA

Nucleasas (hidrlisis)
Exonucleasas
Cadena Doble
Cadena Sencilla
RNA
5 3 y 3 5
5

Endonucleasas
No especficas
Especficas (enzimas de restriccin)

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Enzimas de Restriccin
Sistema bacteriano de restriccin/metilacin para proteger el
material gentico propio (metilado) y destruir el extrao.
Las enzimas comerciales constan nicamente del dominio de
restriccin.
Tipo II:
En general reconocen secuencias palindrmicas de 4 a 8 pb
EcoR I 5G|AATTC 3

Algunas reconocen secuencias asimtricas pues se unen como

heterodmeros al DNA
BbvC I 5CC|TCAGC 3

pueden estar interrumpidas con 1 a 9 pb o tener ambigedad (N)

Bgl I 5GCCN|NNNNGGC 3

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Enzimas de Restriccin

Tipo IIs: reconocen secuencias ms cortas, pocas veces palindrmicas y

NO cortan en el sitio de reconocimiento.
Alw I 5 GGATC(N)4 |3
3 CCTAG(N)5 |5

Todas requieren Mg2+ como cofactor.

Generalmente generan extremos 5 fosfato y 3 hidroxilo.
Los extremos pueden ser cohesivos o romos:

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Extremos cohesivos, protuberantes o colgantes

PstI

5CTGCA|G 3
3G|ACGTC 5
SpeI

5 A|CTAGT 3
3 TGATC|A 5

genera extremos protuberantes 3

5 CTGCA 3
3 G
5

5
3

G 3
ACGTC 5

genera extremos protuberantes 5

5 A
3
3 TGATC 5

5 CTAGT 3
3
A 5

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Enzimas de Restriccin

Isosquisomeros: dos enzimas que reconocen y cortan la misma secuencia

Acc65 I
G|GTACC
Asp718 I G|GTACC

Neosquismeros: reconocen la misma secuencia pero el cortan en otra

posicin
Acc65 I G|GTAC C
KpnI
G GTAC|C

Isocaudmeros: enzimas que generan extremos compatibles

BamH I G|GATCC
Bgl II
A|GATCT

Nomenclatura: Primera letra Gnero, (en itlicas). Segunda y Tercera letras

Especie (en itlicas). Datos adicionales como cepa y nmero.
EcoR I Escherichia coli RY13
Bgl I Bacillus globigii
Bgl II Bacillus globigii

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algunas aplicaciones
de las herramientas
de la biologa molecular

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Construccin de un mapa de restriccin

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RFLPs

Restriction-fragment length polymorphisms

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Herencia de RFLPs

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Clonacin de DNA en vectores moleculares

Usos

ms frecuentes:
Caracterizacin de protenas, mRNAs, regiones reguladoras
Secuenciacin de genomas
Expresin heterloga

Tipos de vectores de clonacin:

Clonacin y transcripcin (inicio y termino de transcripcin)
Expresin y mutagnesis (seales de transcripcin y
traduccin)
De genes reporteros

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El dogma central de la biologa molecular

in vivo
in vitro

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Clonacin
en un vector
de expresin

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Plsmidos

Plsmidos: DNA circular con origen de replicacin bacteriano, marcador de

resistencia,mltiples sitios de restriccin para transformar bacterias. El tipo
de origen de replicacin determina el nmero de copias por clula.

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Clonacin en un plsmido

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Fagos y fagmidos

Bacterifagos: DNA lineal;

para transfectar bacterias,
permite la clonacin de
fragmentos ms largos que los
plsmidos (20 a 25 kb)

Fagmidos: fago circular con

orgen de replicacin
bacteriano (puede propagarse
como fago o como plsmido).

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Csmidos
Csmidos: plsmidos con

sitios cos de fagos para

empaquetamiento y origen
de replicacin de fago.

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Cromosomas artificiales

PACs:cromosomas artificiales
de fago

BACs: cromosoma artificial de

bacteria de copia nica y
permite clonar insertos grandes

YACs: cromosomas artificiales

de levadura con origen de
replicacin en levadura,
centrmero, telmeros,
maracadores de seleccin y
sitios de restriccin.

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Tamao y tipo de insertos

Tipos de inserto:
Productos de PCR
Libreras de cDNA (generadas con transcriptasa reversa)
DNA genmico (fragmentado por mtodos fsicos, qumicos o enzimticos)
DNA de muestras ambientales (metagenomas)
Productos de digestin (restriccin)

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PCR

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PCR

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Amplificacin
de DNA
genmico y de
mRNA
por PCR

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Sntesis de cDNA

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Construccin de libreras genmicas y de cDNA

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Secuenciacin
de un genoma

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Chromosome walking

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Estrategias de secuenciacin

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Secuenciacin de Sanger 1

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Sanger 2

SECUENCIA DEL TEMPLADO

ORIGINAL
5 CGAAGTCA 3
3
A
C
T
G
A
A
G
C
5

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secuenciacin con
terminadores fluorescentes
electroferograma

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Mtodos
post Sanger

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Southern/Northern blot

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Microarreglos
para perfiles
de expresin
de genes

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Bibliografa Bsica
Molecular Cloning: a Laboratory Manual
Joseph Sambrook y David W. Russell
3a ed. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, 2001

Current Protocols in Molecular Biology

John Wiley & Sons Inc.

www.neb.com

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Soluciones y diluciones

Peso molecular

PM = m/n = g/mol

Molaridad

M = (moles de soluto)/(Litro de solucin) = mol/L

Normalidad
N=(nmero de equivalentes)/(Litro de solucin) = eq/L
equivalente=(masa molecular)/(nmero de equivalencia)

Porcentaje peso en volumen

%w/v= (gramos de soluto)/(volumen de solucin)x100

Porcentaje volumen en volumen

%v/v= (volumen de soluto)/(volumen de solucin)x100

Dilucin

C1V1=C2V2

Soluciones stock (p.e. 10X, 5X, 1X se refiere a la relacin C1/C2 )

Ej: Que volumen de buffer 10X debo poner a 10 uL de una reaccin para que la concentracin final sea 1x?

V1= C2V2/C1= 1x*V2/10x = 1/10(V2) 1uL buffer a 10 uL reacc.

V de buffer 5X V1= C2V2/C1= 1x*V2/5x = 1/5(V2) 1uL buffer a 5 uL reacc.

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Tarea: Clculos soluciones

1. Tris-HCl 1M pH8 50 mL (Tris base slido, PM 121.1 g/mol)
2. EDTA 0.5M pH8 50 mL (a partir de EDTA.2Na.2H2O slido PF 372.2 g/mol)
3. SET pH8 10 mL

4.
5.
6.
7.
8.

sacarosa 25mM (slidoPM 342.3 g/mol)

EDTA 10mM*
Tris-HCl 25 mM**
NaOH 2M 10 mL (slido, PM 40 g/mol)
SDS 10% 10 mL (slido)
Acetato de potasio 5M 5 mL (slido, PM 98.14 g/mol)
Etanol 70% 10 mL (lquido, a partir de etanol absoluto)
TE 10 mL
EDTA 1 mM*
Tris-HCl 10 mM**
* diluyendo EDTA 0.5M pH8
** diluyendo Tris-HCl 1M pH8

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Material
tijeras
cinta adhesiva transparente (para tubos)
Masking tape (soluciones)
marcador indeleble punto fino (UNO por
equipo cada sesin)

1 rollo de papel absorbente

1 bolsa guantes de ltex (no estriles)
1 jeringa de insulina de 1 mL (aguja fija)

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Solicitar la suscripcin directamente al grupo:

http://mol152.wikispaces.com
o solicitar una invitacin envindome un correo a:
vv.escobar@gmail.com