Faculdade de Medicina de Ribeiro Preto

FMRP - USP

Ps-Graduao em Imunologia Bsica e Aplicada

Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica Contra
Tumores
M.Sc. William Roberto Schluchting
Prof. Dra Arlete A.M. CoelhoCastelo

O QUE TERAPIA GNICA?

Transferncia de genes nas clulas do
paciente:
Recuperar a funo;
Atribuir uma nova atividade gnica;
Aumentar a atividade de genes ativos.
Doenas genticas ou adquiridas.

COMO FUNCIONA A
TERAPIA GNICA?
Genes introduzidos nas clulas;
Sistema independente de expresso;
Recuperar a funo gnica;

Histrico da Terapia Gnica

- Pr-Terapia Gnica Clnica
1970 Stanfield Rogers: vrus Shope papilloma - Crianas
com arginemia;
Gene arginaseArginina

1983 1989 Inicio da era de pesquisa clnica da TG

Vetores retrovirais;
1989 W.F. Anderson, M. Blease, S. Rosenberg: 1
transferncia gnica p/ Humanos gene neoR em TIL
(Tumor Inflitrating Lymphocytes)
Morales M.M. TERAPIAS-AVANADAS: CLULAS-TRONCO, TERAPIA GNICA E NANOTECNOLOGIA APLICADA SADE. 2007

- Ps-Terapia Gnica
1990 W.F. Anderson: 1 estudo clnico de TG criana com
imunodeficincia grave combinada (SCID Severe Combined
Immunodeficiency) Introduzido gene da adenosina deaminase (ADA)
resultado publicado em 1995;
1992 James Wilson: 1 experimento de TG para rgo interno,
hepatcitos modificados com vetor retroviral com o gene do receptor
LDL;
1993 Ronald Crystal: 1 TG em Fibrose Cstica usando adenovirus ;
1996 Inicio da ASGT: American Society of Gene Therapy;
2003 China: 1 droga de TG
cancer;

Adenovirus/p53 para tratamento de

2006: + de mil protocolos clnicos aprovados , envolvendo cerca de 5000

paciente em todo o mundo.
Morales M.M. TERAPIAS-AVANADAS: CLULAS-TRONCO, TERAPIA GNICA E NANOTECNOLOGIA APLICADA SADE. 2007

Uso Material Gentico

1997 - UNESCO adopts Universal Declaration on the Human Genome and Human Rights,
prohibiting germline interventions.
http://portal.unesco.org/shs/en/ev.php-URL_ID=1881&URL_DO=DO_TOPIC&URL_SECTION
=201.html
Biotecnologia _ Cias

Regulamentao Americana
Regulamentao Europia
W.F. Anderson

Terapia Gnica x Sistema Imune

Terapia Gnica no
Brasil
- Em 2004 foi criada a Rede de
Terapia Gnica
- 27 institutos ou
Departamentos de 6
estados (Rio de Janeiro, So
Paulo e Rio Grande do
Sul), financiados pelo
Institutos do Milnio do
CNPq/MCT.
- Pesquisas: introduo de
genes com efeito teraputico

Qual o alvo do Brasil?

- terapia gnica em cncer
- doenas graves do metabolismo
- doenas degenerativas e
cardiovasculares
- vacinas de DNA profilticas para
doenas infecciosas e vacinas de
DNA teraputicas para HPV

Terapia Gnica no
Brasil
Rede composta por:
Rio de Janeiro: o Instituto de Biofsica da UFRJ, o Instituto
Oswaldo Cruz e o Instituto Nacional do Cncer (INCA);
So Paulo: os Departamentos de Microbiologia e Biologia
Celular e Desenvolvimento da USP, o CINTERGEN da
UNIFESP, o InCor e o Instituto Butant;
Rio Grande do Sul: os Departamentos de Gentica e de
Biofsica e o Hospital de Clnicas da UFRGS, bem como o
Instituto de Cardiologia do Rio Grande do Sul.

Terapia Gnica no
Brasil
1o. Estudo Clnico em pacientes cardacos (isquemia)
fases 1 e 2 (segurana e eficcia)
Coordenado pelo Dr. Renato Karan Kalil Inst.
Cardiologia do Rio Grande do Sul
Grupo de 10 pacientes tratados com injeo de DNA
(plasmdeo c/gene VEGF-165) diretamente no
corao estimula angiognese
8 pacientes apresentaram bons resultados:
-aumento na capacidade de bombear sangue
-desempenho em testes de esforo fsico

Freqncia dos Vetores Utilizados na Terapia

Gnica

1. Insero de um gene em um vetor

2. Contato Vetor / Clula
3. Entrada e transporte do gene at o ncleo da
clula
4. Transcrio do RNAm a partir do gene
5. Traduo do RNAm em protena
6. Secreo, fixao na membrana ou expresso
citoplasmtica da protena

FORMAS POTENCIAIS
DE TERAPIA GNICA
Terapia gnica
germinativa

Terapia gnica
somtica

Terapia gnica para a mutao little(lit): hormnio

do crescimento
Regulador-Promotor da Metalotionena: remover
metais pesados

VIAS DE TERAPIA GNICA

Terapia Gnica in vivo

Terapia Gnica ex vivo

TERAPIA GNICA DE
CLULAS SOMTICAS
Terapia in vivo: as clulas so
tratadas dentro do corpo
Terapia ex vivo: as clulas
do paciente so retiradas e
manipuladas fora do corpo

Terapia gnica in
vivo

http://www.smartplanet.es/articulos.php?pageNum_ctapag=6&totalRows_ctapag=11&id=9-4-3

Terapia Gnica in vivo

Isquemia
Doenas vasculares cardacas ou de membros
- Genes que promovem a angiognese
Vacinao Gnica
Genes que codificam antgenos
Induo RI
- Adenovirus, Vaccinia e plasmdeo
Injeo direta, eletroporao ou gene gun

Vacinas de DNA
Gene = vacina

Tang et al., 1992 Nature 356, 1992

Fynan et al., 1993 PNAS 90, 1993
Ulmer et al., 1993. Science 259, 1993

Plasmid DNA
Eukaryotic
Promoter

Antigen
CpG Motifs

Expresso protena heterloga in vivo

Induo RI

Anticorpos

CTL

T helper

Vantagens das Vacinas de DNA

Fcil produo escala industrial e estocagem
Baixo custo produo
RI
Ativao de CD8+
Ao adjuvante CpG

Ledwith, B et al., 2000; Manam S., et al., 2000

Pizetsky DS, 2000; Prudhomme, GJ et al., 2001

Trfego dos vetores in vivo

Mecanismos desconhecidos

Adenovrus 2 e 5

integrina
Endocitose/receptor ?
Microambiente
Endossomo-lisossomo

DNAses
pH

Ncleo

Lipossomas

Gene gun
Microesferas

TERAPIA GNICA NO VACINAL

1- REINTRODUO ex vivo gene transfectado in vitro

2- TRANSFECO CLULA ALVO in vivo

2.1 Sistmica
2.2 Local

Transferncia dos genes mediada por vetor

Terapia Gnica ex vivo

Cultura de clulas;
Transferncia Gnica;
Seleo de clulas modificadas.

Terapia gnica ex vivo

Novas alternativas Terapia Gnica

Clulas transfectadas
- Queratincitos;
- Clulas musculares;
- Clulas dendrticas e macrfagos
tumoral

alvo

- So utilizadas no mtodo ex vivo, clulas

do organismo so retiradas e tratadas com o
vetor;

Reintroduo da clula modificada

Algumas circunstncias :

Reinfuso Local

Complexidade da terapia ex vivo

Vantagem:
Procedimento nico
Desvantagens
Processo caro e trabalhoso
Manuteno in vitro das clulas

alteraes

Diferentes abordagens
Terapia Gnica

Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica

Linfcitos B, clulas classicamente envolvida RI hum

Por que usar linfcito

B?

1- Maquinaria de
altamente eficiente
produo Ig

produo proteica
promotor para

Favorecer expresso heterloga

Baixo custo X CD

Uso de Linfcitos B em Terapia G

2- Transfeco Intra-esplnica de camundongos
sucesso!
- Invasivo, direto bao

(Zanetti M, et al. Int. Rev. Immunol.

2006)

3- Clulas B capturam plasmideo in vivo, aps

Imunizao IM e Expressa protena heterloga.
(Coelho-Castelo, et al. Human gene Therapy 2003)

Uso de Linfcitos B em Terapia Gnica

Confocal

Deteco Plasmdeo em CD11b e CD19

CD11b FITC
CD19 - FITC

pcDNA-3hsp65
Alexa-fluor 594

Coelho-Castelo et al.,2003

Clulas B Capturam Plasmdeo e Expressam

Protena Recombinante
pEGF2C-GFP im

48h

DLN

GFP expresso por FACS

Coelho-Castelo et al., Human gene Therapy, 2003

OBJETIVOS
Analisar o papel de linfcitos B na produo de protenas
heterlogas aps transfeco in vitro, in vivo e ex vivo usando
plasmdio codificando para GFP e IL-12.
Determinar a cintica de produo da protena ex vivo e in vitro;
Avaliar possveis alteraes fenotpicas nos linfcitos B aps a
eletroporao;
Avaliar a eficincia do uso de linfcitos B-transfectados com IL-12,
em imunoterapia gnica usando modelo de melanoma experimental.
Terapia Gnica
Reconstituio de protenas
Transferncia de pr-drogas

Resultados
A: Padro 1Kb
B: pIRES vetor +/4,7Kb
C: pIRES-IL12 +/5,2Kb
12Kb
D: pEGFP-C2 +/- 4,7Kb

5,2 Kb
4,7 Kb

Delineamento Experimental in
vitro
Transfeco Eletroporao
Purificao
de linfcitos
B por
BEADS
Magnticas

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

Cultura

Citometria de
Fluxo

Expresso GFP In vitro

% cel.
% Positivas
F l u o r e s cCD19/GFP
c ia

3.5

GFP

3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
6h

8h

15h

Delineamento Experimental ex
vivo
Transfeco eletroporao
Purificao
de linfcitos
B por
BEADS
Magnticas

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

Transferncia
adotiva

Animais BKO

Citometria de Fluxo

Expresso de GFP in vivo

48 h

7 dias
26,13%

11,9%

M1

M1

M2

15 dias
31,91%

M2
M1

M2

Delineamento Experimental in
vitro
Transfeco Eletroporao
Purificao
de linfcitos
B por
BEADS
Magnticas

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

Cultura

ELISA

Expresso in vitro IL-12

Branco
pIRES-IL12
pIRES-Vetor
MOC

2500

IL -1 2 (p g /m l)

2000

1500
1000
500
0

24h 48h 72h

Branco

24h 48h 72h

pIRES-IL12

24h 48h 72h

pIRES-Vetor

24h 48h 72h

MOC

Delineamento Experimental in
vitro
Transfeco por contato
Purificao
de linfcitos
B por
BEADS
Magnticas

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

Cultura

ELISA

Expresso de IL-12 em
Linfcitos B in vitro
*

6000

IL -1 2 (p g /m l)

5000
4000

pIRES-Vetor
pIRES-IL-12
Branco

3000
2000
1000
0

24h 48h 72h

24h 48h 72h

24h 48h 72h

pIRES-Vetor

pIRES-IL-12

Branco

Delineamento Experimental in
vitro GFP
Transfeco por contato
IL12KO

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

Transferncia
adotiva

Citometria de

% c e l. p o s itiv a s C D 1 9 /G F P

Expresso de GFP em
Linfcitos B de IL-12KO in
vitro
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0

24h

48h

72h

Avaliao do processo de transfeco no fentipo ou

atividade de linfcitos B/GFP - Transferncia
Adotiva
Transfeco por contato
Purifica
o de
linfcitos
B por
BEADS
Magntica
s

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

Transfern
cia
Adotiva

Citometria de
Fluxo
Molculas de

Sete Dias Aps a Transferncia Adotiva

Clula
Cel. B Transfectada

% F lu o r e s c n c ia

100
75
50
25
0

CD19/CD40

CD19/CD80

CD19/CD86

CD19/MCH class II

Quinze Dias Aps a

Transferncia Adotiva
Clula
Cel. B Transfectada

% F lu o r e c n c ia

100
75
50
25
0

CD19/CD40

CD19/CD80

CD19/CD86 CD19/MCH class II

Deteco de plasmdeo em outras

subpopulaes de clulas aps a
transferncia adotiva.
Transfeco por contato
Purifica
o de
linfcitos
B por
BEADS
Magntica
s

Antigen
Promoter

B
CpG Motifs

DNA
marcad
o com
Alexa
488

Transfern
cia
Adotiva

Citometria de
Fluxo
Molculas de

Deteco de plasmdeo em outras

subpopulaes de clulas aps a
transferncia adotiva.
% F lu o r e s c n c ia

% F lu o r e s c n c ia

4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

CD19
CD11b
CD11c

CD19

CD11b

CD11c

CD19

CD19
CD11b
CD11c

CD11b

CD11c

Avaliao da eficincia dos

linfcitos B transfectados em
terapia gnica
Melanoma B16F10

Animais
IL-12KO
WT

Linfcitos B
Transfectados com
pIRES-IL12

Massa Tumoral

Sobrevida

Histologia

Sobrevida

% F lu o r e s c n c ia

Massa Tumoral
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0

WT
IL12KO
IL12KO + Cel B.Transfectada

CD4

CD8

NK

Bao

WT
IL12KO
IL12KO + Cel.B transfectada

% F lu o r e s c n c ia

15

10

CD4/CD44

CD8/CD44

NK

Histologia do Melanoma B16F10

A: WT 400x
B: WT 200x
C: IL12KO 200x
D: IL12KO Trat. 200x
E: IL12KO Trat. 400x

Concluses

Foram capazes de levar a produo in vivo e

in vitro de uma protena heterloga tanto
GFP como interleucina 12;

A transferncia adotiva de Linfcitos B para

animais WT, ou IL-12 KO diminuiu a massa
tumoral, aumentou a sobrevida e aumentou
recrutamento de linfcitos intra-tumorais do
tipo CD4, CD8 e NK.

Linfcitos B transfectados podem leva a

produo in vivo de protenas heterlogas
biologicamente ativas, podendo ser uma
nova ferramenta em Terapia Gnica.

OBRIGADO!