TUGAS

BIOTEKNOLOGI

DISUSUN OLEH :
Anggota

Dosen

: 1. NANDA SURYANING ROHMA

122210101032

2. YASMIN

122210101034

3. MIA RISWANI

122210101042

4. GALUH SINOARSIH

122210101050

: Evi Umayah Ulfa, S.Si., M.Si., Apt.

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2014

SOAL
1.
2.
3.
4.
5.

Sebutkan macam-macam vektor!

Gambarkan 1 macam contoh vektor dan beri penjelasannya!
Bagaimana cara memasukkan vektor dan DNA sisipan yang sudah bersatu kedalam inang?
Bagaimana cara seleksi?
Bagaimana cara deteksi?

JAWABAN
1. Vektor adalah Media untuk dan memperbanyak dan mentransformasi fragmen DNA.
Persyaratan suatu vektor yaitu :
Replikasi autonom dalam inang
Berpenanda untuk seleksi
Berposisi kloning tunggal
Berberat molekul kecil
Memiliki beberapa kopi pada setiap sel
Tidak berkonjugasi
Contoh dari vektor yaitu :
a. PLASMID
Plasmid adalah dna ekstrakromosomal berbentuk sirkular tertutup, berpita ganda.
Karakteristik plasmid yaitu :

Replikasi (autonom)
Ekstra kromosom
Stabil
Ukuran 1-300 kb

Jenis-jenis plasmid yaitu :

o F-plasmid: F adalah singkatan dari fertility, Plasmid ini mengandung perangkat gengen tra (fertilitaskonjugasi)
o R-plasmid: R adalah singkatan dari resistance (resistensiantibiotika)
o Col-plasmid, adalah plasmid yang mengandung gen yang mengkode produksi
senyawa bakteriosin (ColE1 dari E.coli)
o Degradative plasmid, plasmid yang dapat mencerna beberapa senyawa yang tidak
umum seperti toluene atau asam salisilat (TOL dari Pseudomonas putida)
o Virulence plasmid, adalah plasmid yang dapat menyebabkan (Ti plasmid :Tumour
inducing plasmide)
b. FAGE
Fage (bakteriofage) merupakan virus yang menginfeksi bakteri, tersusun atas molekul
DNA yang membawa beberapa gen dan kapsid (molekul protein yang membungkus).

Fage
Bentuk: kepala dan ekor
Siklus hidup: (1) lisis, (2) lisogeni
Ukuran genom: 49 kb, utas ganda
Kedua ujung: situs cos(1) sirkuler, (2) situs pemotongan
- Fage M13
Bentuk: batang/filamen
Ukuran genom: 6,407 kb, linier
Perbanyakan: tanpa lisis sel inang
c. COSMID
Cosmid merupakan vektor yang dikembangkan dari plasmid dilengkapi dengan sekuen
Cos. Selain memiliki gen Cos juga memiliki gen Ori yang memungkinkan untuk bisa
bereplikasi didalam E. coli. Istilah cosmid diperkenalkan pertama kali oleh Collins dan
Hohn (1978).
Karakteristik cosmid yaitu :

Sekuen cos berasal dari phage yang merupakan sekuen berpita tunggal.
Adanya sekuen cos memungkinkan cosmid untuk masuk kedalam struktur

bakteriophage sehingga dapat dimasukkan kedalam sel bakteri.

Vektor cosmid biasanya banyak dipergunakan dalam penyusunan pustaka DNA

dengan ukuran 37 sampai 57 kb

Fragmen cosmid itu sendiri hanya 4-9 kb.
d. YAC (Yeast Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari khamir
- Butuh kloning dengan kapasitas besar:
Gen faktor VIII pada manusia yang mengkode faktor defisiensi koagulasi

(pembekuan) darah pada jenis hemopilia A, memiliki ukuran 190 kb

sifat bithorax pada Drosophila yang berfungsi dalam regulasi perkembangan pola

segmentasi dada membentang sepanjang 320 kb.

- Dikembangkan oleh Burke et al (1987)
- Karakteristik penting plasmid YAC yaitu :
Dikembangkan dari plasmid pBR322
Memiliki komponen gen yeast : SUP4, 7RP1, HIS3 dan URA3.
Kloning pada sisi gen SUP4 (supressor untuk pengendali gen tRNA tyrosin)
Host (inang) yang digunakan untuk transformasi adalah spheroplast sel yeast
e. BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
- Kromosom buatan dari bakteri
- Plasmid yang dilengkapi dengan faktor F
- Mengandung:
oriS, repE F: replikasi dan pengaturan jumlah salinan plasmid di dalam sel

inang.
parA and parB: pembagian plasmid F kedalam sel anak dan menjamin stabilitas
insersi

- Kisaran kapasitas kloning vektor BAC adalah 150 sampai 350 kb (bisa capai 700 kb)
- Dapat membawa sisipan DNA berukuran besar
- Konstruksi pustaka genom
2. Vektor Pengklonan pGEM-T Easy Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3) merupakan
plasmid sirkular terbuka, memiliki dua buah origin of replication dan gen ketahanan
terhadap ampisilin (Amp). Plasmid ini mengandung multy cloning site. Karena memiliki
kelebihan timin yang menggantung di ujung terbuka plasmid ( T overhang), plasmid ini
sering dipakai sebagai vektor untuk produk PCR yang selalu memiliki kelebihan adenin
pada ujungnya tanpa memerlukan tahapan pemotongan terlebih dahulu. Plasmid pGEM-T
Easy juga termasuk plasmid high copy number yang cocok untuk menyimpan gen insert
dalam suatu inang (Kendrew & Lawrence 1994).
Selain itu, pGEM-T Easy merupakan vektor yang berukuran kecil yaitu 3015 bp. Ukuran
tersebut relatif kecil sehingga vektor dapat membawa DNA target cukup banyak dan
memudahkan preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar. Vektor berukuran kecil lebih
mudah dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih mudah dimurnikan karena cenderung
tidak rapuh dibandingkan dengan vektor berukuran besar ( Sambrook et al. 1991).

Gambar 3 Profil vektor pengklonan pGEM-T Easy.

Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303

DNA vektor adalah molekul DNA yang dapat bereplikasi secara mandiri dan dapat
digunakan sebagai pembawa molekul DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel. DNA yang sering digunakan adalah plasmid bakteri.
Plasmid adalah bahan genetik ekstrakromosom yang diwariskan secara tetap. Ciri-ciri
plasmid antara lain berukuran kecil dan hanya mengandung beberapa gen, membawa
informasi genetik, terlepas dari DNA kromosom atau kadang-kadang dapat berintegrasi
dengan DNA kromosom, dan dapat diisolasi dengan mudah dari sel bakteri. Ciri lain
plasmid adalah mempunyai situs untuk memulai replikasi yang disebut ORI (origin of
replication) (Nicholl 1994)
Plasmid pCAMBIA 1303 merupakan plasmid yang dikonstruksi sebagai vektor DNA
dalam metode transformasi langsung dan menggunakan Agrobacterium tumefaciens.
Plasmid pCAMBIA 1303 mengandung promotor CaMV 35S (cauliflower mosaic virus).
Promotor ini berhubungan dengan urutan yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid. Hal
ini memungkinkan pembuatan klon langsung ke dalam T-DNA plasmid. Tersedianya
promotor aktif yang kuat sangat diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada tanaman baik
monokotil maupun dikotil. Beberapa hasil penelitian menyatakan bahwa CaMV35S adalah
promotor konstitutif yang aktif pada sel tanaman monokotil akan tetapi kekuatannya
sedikit menurun pada sel tumbuhan dikotil dan tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira & Citovsky 2002). Selain itu, pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA. Gen
gusA (-glucuronidase) dalam plasmid pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen reporter
untuk memonitor proses transformasi dan introduksi gen yang direkayasa (Tzfira &
Citovsky 2002).

Peta restriksi pCAMBIA 1303

3. Cara memasukkan materigenetik kedalam sel inang yaitu :

Transformasi, ialah pemindahan sebagian materi genetik atau DNA atau hanya satu
gen bakteri ke bakteri lain dengan proses fisiologi yang kompleks. Proses ini pertama
ditemukan Frederick Griffith tahun 1982. Contoh : Streptococcus pnemoniaeu,
Haemophillus, Bacillus. Diguga transformasi ini merupakan cara bakteri menularkan
sifatnya ke bakteri lain. Misalnya bakteri patogen yang semula tidak kebal antibiotik

dapat berubah menjadi kebal antibiotik karena transformasi.

Transduksi, pemindahan materi genetik dengan perantara virus. Virus dapat
menyambungkan materi genetiknya ke DNA bakteri dan membentuk profag. Ketika
terbentuk virus baru, di dalam DNA virus sering terbawa sepenggal DNA bakteri yang
diinfeksinya. Virus yang terbentuk memiliki dua macam DNA yang dikenal partikel
transduksi (transducing particle). Cara ini dikemukakan oleh Norton Zinder dan

Jashua Lederberg.
Konjugasi, merupakan pemindahan sebagian materi genetika dari satu bakteri ke
bakteri lain melalui suatu kontak langsung. Artinya, terjadi transfer DNA dari sel
bakteri donor ke sel bakteri penerima melalui ujung pilus. Ujung pilus akan melekat

pada sel peneima dan DNA dipindahkan melalui pilus tersebut. Kemampuan sel donor
memindahkan DNA dikontrol oleh faktor pemindahan ( transfer faktor = faktor F )
4. Salah satu seleksi yaitu Seleksi biru putih atau blue-white screening adalah salah satu
metode

untuk mengidentifikasi

keberhasilan kloning dan transformasi. Metode

ini

merupakan salah satu metode seleksi sel hasil kloning dan termasuk metode seleksi
berdasarkan warna. Untuk proses seleksi ini, digunakan enzim -galaktosidase. galaktosidase adalah enzim yang dihasilkan dari ekspresi gen lacZ. Gen ini diatur
ekspresinya oleh operon lac. Aktivator untuk ekspresi gen ini adalah molekul laktosa yang
dalam jumlah tertentu dapat menginduksi terekspresinya gen lacZ.
Mekanisme :
Proses seleksi ini memanfaatkan sifat dari enzim -galaktosidase, yaitu
enzim yang terdiri dari 2 subunit, yaitu peptida dan peptida . Untuk
menjadi suatu enzim yang fungsional, enzim ini memerlukan kedua
peptidanya

untuk

berikatan dan membentuk

enzim yang

dapat

memecah substrat laktosa atau X-gal. Gen penyandi peptida biasanya

terdapat pada kromosom, sedangkan gen penyandi peptida terdapat
pada plasmid. Bila hanya ada peptida yang diekspresikan oleh gen
pada kromosom, maka tidak akan ada pemecahan laktosa atau Xgal. Namun

bila

terjadi

komplementasi

oleh peptida

maka laktosa atau X-gal dapat dipecah oleh enzim -galaktosidase yang
terbentuk
membantu

sempurna. Oleh
untuk

proses

karena
seleksi

itu,

komplementasi

biru-putih

sebagai

dapat

indikator

keberhasilan kloning atau transformasi. Pada MCS terdapat gen lacZ

mengkode galaktosidase. DNA sisipan akan merusak gen lacZ sehingga
galaktosidase tidak diproduksi dan X-gal tidak diuraika berwarna putih.
X- GAL biru
X GAL tidak diuraikan putih
5. Deteksi Keberadaan DNA sisipan antara lain:
Elektroforesis gel (analisis migrasi, analisis restriksi , PCR) dan penentuan urutan DNA.
Seleksi sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan dilakukan dengan
mencari fragmen tersebut menggunakan fragmen pelacak (probe), yang pembuatannya
dilakukan secara in vitro menggunakan teknik reaksi polimerisasi berantai atau polymerase

chain reactin (PCR). Pelacakan fragmen yang diinginkan antara lain dapat dilakukan
melalui cara hibridisasi koloni. Koloni-koloni sel rekombinan ditransfer ke membrane
nilon, di lisis agar isi selnya keluar, dibersihkan protein dan remukan sel lainnya hingga
tinggal tersisa DNAnya saja. Selanjutnya dilakukan fiksasi DNA dan perendaman di
dalam larutan pelacak. Posisi-posisi DNA yang terhibridisasi oleh fragmen pelacak
dikocokkan dengan posisi koloni pada kultur awal (master plate). Dengan demikian , kita
bisa menentukan koloni-koloni sel rekombinan yang membawa fragmen yang diinginkan

REFERENSI
Gupta PK. 2008. Molecular Biology and Genetic Engineering. New Delhi : Rastogi.
Nicholl DST. 1994. An Introduction to Genetic Engineering. New York : Cambridge
University Press.
Kendrew SJ, Lawrence E. 1994. The Encyclopedia of Molecular Biology. Cambridge:
Blackwell Science
Sambbrook J, Russell DW. 2001. Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed ke-3. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Tzfira T, Citovsky V 2002. Partners-ininfection: host proteins involved in the transformation
of plant cells by Agrobacterium. Trends in Cell Biology. 12: 121130.