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Rev Iberoam Micol 2002; 19: 84-88

Original

Efecto de extractos alcohlicos de


plantas silvestres sobre la inhibicin
de crecimiento de Aspergillus flavus,
Aspergillus niger, Penicillium
chrysogenum, Penicillium expansum,
Fusarium moniliforme y Fusarium
poae
Martn Tequida-Meneses, Mario Cortez-Rocha, Ema Carina RosasBurgos, Susana Lpez-Sandoval y Consuelo Corrales-Maldonado
Departamento de Investigacin y Posgrado en Alimentos (DIPA),, Universidad de Sonora, Unidad Centro,
Hermosillo, Sonora, Mexico

Resumen

Palabras clave

Se evalo la actividad fungicida de las plantas silvestres Larrea tridentata,


Karwinskia humboldtiana, Ricinus communis, Eucalyptus globulus, Ambrosia
ambrosioides, Nicotiana glauca, Ambrosia confertiflora, Datura discolor,
Baccharis glutinosa, Proboscidea parviflora, Solanum rostratum, Jatropha cinerea, Salpianthus macrodonthus y Sarcostemma cynanchoides sobre las especies de hongos Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum,
Penicillium expansum, Fusarium poae y Fusarium moniliforme. Se prepararon
extractos alcohlicos al 6% con polvo vegetal seco (tallos y hojas), donde los
solventes utilizados fueron metanol y etanol al 70%. Se prepar una suspensin
de esporas (1x106 ufc/ml) de cada hongo, con solucin salina al 0,85% y 0,1%
de tween 80. Los extractos fueron mezclados con agar Czapeck extracto de
levadura (CYA) a 45-50 C en una relacin 1:10 en placas petri y posteriormente
se realiz la inoculacin de cada hongo, y como tratamiento control placas petri
con CYA y el solvente utilizado. Estas fueron incubadas por un perodo de ocho
das a 25 2 C. Se midi el dimetro (crecimiento radial) de las colonias cada
48 h. L. tridentata, B. glutinosa, D. discolor y P. parviflora controlaron al menos
el crecimiento de dos especies de hongos. Por ejemplo, L. tridentata, inhibi el
crecimiento de las seis especies de hongos en un rango de 41,5% hasta el
100% tomando en cuenta tanto a los extractos metanlicos como a los extractos
etanlicos.
Actividad fungicida, Plantas silvestres, L. tridentata, Suspensin de esporas,
Crecimiento radial

Effect of alcoholic extracts of wild plants on the


inhibition of growth of Aspergillus flavus, Aspergillus
niger, Penicillium chrysogenum, Penicillium
expansum, Fusarium moniliforme and Fusarium poae
moulds
Summary

Direccin para correspondencia:


Dr. Martn Tequida-Meneses
Departamento de Investigacin y Posgrado
en Alimentos (DIPA),
Universidad de Sonora, Unidad Centro
Apartado postal 1658
C.P. 83000, Hermosillo,
Sonora, Mexico
Tel./Fax: +52 01 (6) 12 54 88
E-mail: mtequida@guayacan.uson.mx
Aceptado para publicacin el 15 de Marzo de 2002
2002 Revista Iberoamericana de Micologa
Apdo. 699, E-48080 Bilbao (Spain)
1130-1406/01/10.00 Euros

Fungicidal activity of wild plants Larrea tridentata, Karwinskia humboldtiana,


Ricinus communis, Eucalyptus globulus, Ambrosia ambrosioides, Nicotiana glauca, Ambrosia confertiflora, Datura discolor, Baccharis glutinosa, Proboscidea
parviflora, Solanum rostratum, Jatropha cinerea, Salpianthus macrodonthus y
Sarcostemma cynanchoides was evaluated against the moulds species
Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Penicillium
expansum, Fusarium poae y Fusarium moniliforme moulds species. Alcoholic
extracts 6% (w/v) were prepared using six grams of dried plant powders (leaves

Extractos de plantas y crecimiento fngico


Tequida-Meneses M, et al.

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and stems) and alcohol (70% ethanol or 70% methanol). A spore suspension
(1x106 ufc/ml) of each mould was prepared by adding saline solution (0.85%)
and 0.1% tween 80. The Extracts were mixed with Czapeck yeast agar (CYA) at
45-50 C in 1:10 relation on Petri dishes. Triplicate Petri dishes of each treatment and for each mould were centrally inoculated and three Petri dishes were
used without treatment as controls. The inoculated dishes and controls were
incubated at 25 2 C for eight days. The incubated dishes were examinated
each 48 h and after the colony diameter (radial growth) was measured. Two
mould species were controlled by L. tridentata, B. glutinosa and P. parviflora.
Extracts of L. tridentata in methanol or ethanol at 41.5-100% inhibited all six species of moulds.
Key words

Fungicidal activity, Wild plants, L. tridentata, Spores suspension, Radial growth

Mxico es un pas muy poblado que tiene que producir grandes cantidades de granos que forman parte
importante en la dieta de los mexicanos. Todos los productos agrcolas son invadidos por diversos insectos y
hongos. El trigo y el maz son los cereales ms susceptibles al ataque de estos organismos, que degradan su calidad en diversas formas [1].
En particular los granos y las semillas son infectados por diversos hongos en el campo entre ellos Fusarium
sp., Alternaria sp. y Helminthosporium sp. Por otra parte,
los granos tambin pueden ser invadidos por hongos de
almacn, siendo Aspergillus sp. y Penicillium sp. los principales gneros de hongos que se presentan [2]. Durante
su desarrollo en los granos, los hongos causan diferentes
clases de daos, siendo los ms importantes la prdida de
capacidad de germinacin, decoloracin, calentamiento y
produccin de micotoxinas [3,4]. Existen varios mtodos
de control de plagas, pero desgraciadamente las sustancias
qumicas empleadas en el control de insectos han provocado el desarrollo de resistencia, contaminacin ambiental
y riesgos de salud pblica [5,6]. As mismo, actualmente
no existe ningn mtodo de control de hongos, slo medidas preventivas como monitorizar la temperatura y la
humedad del grano. Por esta razn, el objetivo de este
estudio fue evaluar el efecto fungicida de extractos alcohlicos de plantas silvestres de tres regiones de Sonora,
Mxico sobre diversas especies de hongos como
Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum, Penicillium expansum, Fusarium poae y Fusarium
moniliforme. La seleccin de plantas se realiz con base a
estudios previos realizados con el insecto Rhyzopertha
dominica, entre las cuales Nicotiana glauca fue la planta
que mejor efecto present [7]. Adems, en otro estudio se
observ que el extracto de Larrea tridentata en diclorometano inhibi el 92% del crecimiento radial de A. flavus [8].
MATERIALES Y MTODOS
Las plantas estudiadas fueron L. tridentata,
Karwinskia humboldtiana, Ricinus communis, Eucalyptus
globulus, Ambrosia ambrosioides, N. glauca, Ambrosia
confertiflora, Datura discolor, Baccharis glutinosa,
Proboscidea parviflora, Solanum rostratum, Jatropha
cinerea, Salpianthus macrodonthus y Sarcostemma
cynanchoides. Su recoleccin se llev a cabo en las poblaciones de Soyopa, Ures, Bavicora y Costa de Hermosillo,
todas ellas en el estado de Sonora, Mxico.
Se emplearon nicamente tallos y hojas, que fueron secados al sol por dos das y posteriormente a la sombra hasta secado completo (25 das totales
aproximadamente). Una vez secas, fueron molidas en un

molino Willey (Laboratory Mill modelo 4, EE.UU.) hasta


obtener un tamao de partcula de 0,5-1 mm [9].
Se prepararon extractos de cada planta al 6% por
triplicado. Se mezclaron 6 g de polvo de planta y 94 ml de
alcohol, utilizando como solventes metanol y etanol
ambos al 70% [10]. La extraccin se hizo mediante remojo por 15 min con agitacin mecnica en una placa de
calentamiento-agitacin (Barnstead-Thermolyne, EE.UU.)
y un reposo de 48 h a 25 2 C. Los extractos obtenidos
se filtraron en dos etapas: primero a travs de tela de lino
para eliminar las partculas vegetales de mayor tamao,
seguida de centrifugacin-decantacin a 7000 rpm por 10
min y finalmente una segunda filtracin bajo vaco en
papel Whatman # 4 (Whatman , EE.UU.). Los extractos
obtenidos se guardaron en frascos de plstico color mbar
que se guardaron en refrigeracin.
Las especies de hongos utilizadas fueron A. flavus,
A. niger, P. chrysogenum, P. expansum, F. poae y
F. moniliforme, aisladas de grano de trigo y maz.
Preparacin del inculo. Cada especie de hongo
fue cultivada en forma inclinada en agar papa dextrosa
(PDA) a 25 2 C por 10 das en tubos de ensayo
(18x150). Posteriormente, se prepar una suspensin de
esporas, agregando a cada tubo 10 ml de solucin salina
(0,85%) con 0,1% de Tween 80 (Polisorbato 80, Sigma,
EE.UU.), este ltimo para prevenir la aglomeracin y la
rpida precipitacin de las esporas [11,12]. Las esporas
fueron desprendidas del micelio con una varilla de vidrio
estril. La suspensin obtenida se transfiri a otro tubo de
ensayo estril y se determin su concentracin, la cual se
ajust a 1x106 UFC/ml con solucin salina [12-14].
Crecimiento radial e inhibicin de crecimiento de
hongos. Cada uno de los extractos preparados fue mezclado con agar Czapeck extracto de levadura (CYA) a 4550 C en una relacin 1:10. La mezcla fue vertida sobre
placas Petri. Una vez solidificado el agar, las placas se
incubaron por 24 h para la evaporacin del alcohol utilizado como solvente. Despus se inocularon con la suspensin
de esporas correspondiente por puncin central de 1 mm de
dimetro. Se cont con un tratamiento control de placas
Petri que consisti de CYA y el solvente utilizado [14]. Las
placas fueron incubadas por ocho das a 25 2 C.
Las placas se examinaron cada 48 h con un estereomicroscopio biocular (Carl Zeiss, Alemania). Se midi el
dimetro de las colonias de los hongos desarrollados, que
se represent grficamente en funcin del crecimiento
radial expresado en centmetros y el tiempo de incubacin
en horas [14]. El porcentaje de inhibicin de crecimiento
fue calculado tomando en cuenta que la inhibicin es el
inverso del crecimiento.
Se utiliz un diseo completamente al azar con tres

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repeticiones y se realiz el anlisis de varianza (ANOVA)


con un nivel de significancia de a = 0,05 (p < 0,05).
Adems, se realiz una comparacin de medias con la
prueba de Tukey utilizando el paquete estadstico SAS [15].
RESULTADOS Y DISCUSION
Crecimiento radial de hongos
Aspergillus niger. Los valores obtenidos con los
extractos alcohlicos aplicados a A. niger fueron estadsticamente significativos ( p < 0,05) entre solvente y entre
las plantas. En la figura 1 se presentan los resultados de
crecimiento radial de A. niger con los tratamientos metanlicos. Se observ que los tratamientos de K. humboldtiana y A. ambrosioides tuvieron mayor efecto en el
crecimiento de ste hongo, con 0,7 y 0,8 cm, respectivamente, comparados con el testigo que tuvo un crecimiento
de 1,4 cm. Esto represent una inhibicin en el crecimiento del 52 y 50 % respectivamente (Tabla 1) Los extractos
de R. communis y J. cinerea no presentaron inhibicin, ya
que su crecimiento fue similar al testigo.
El crecimiento radial de A. niger con los extractos
etanlicos fue variado. Estadsticamente hubo diferencia
entre las plantas (p < 0,05). L. tridentata present el mejor
efecto, ya que con ella el hongo creci 1,6 cm, de igual
forma con B. glutinosa creci slo 3,1 cm, comparados
con el crecimiento de dicho hongo en el testigo que fue de
7,2 cm. Estos valores representaron una inhibicin de 77,3
y 56,9%, respectivamente (Tabla 2). El anlisis estadstico
indic que entre estos tratamientos si hubo diferencia significativa (p < 0,05).

Aspergillus flavus. Se encontr diferencia significativa entre solvente y plantas (p < 0,05). Al comparar el
crecimiento del testigo (2,7 cm) con los extractos metanlicos, se observ que las plantas de L. tridentata y A. confertiflora causaron el menor crecimiento radial con 0,8 y
1,3 cm, respectivamente. Esto represent una inhibicin
de 71,2 y 52% respectivamente para dichos tratamientos.
Por otro lado, los extractos etanlicos de L. tridentata y D. discolor causaron reduccin en el crecimiento
radial de A. flavus con 1,6 y 2,3 cm, respectivamente. El
crecimiento en el testigo fue de 6,8 cm (Figura 2). Estos
valores indican una inhibicin de 76 y 66,2% para L. tridentata y D. discolor, respectivamente (Tabla 2).
Un estudio del extracto acuoso de Andrographis
peniculata sobre el crecimiento de A. flavus, indic una
inhibicin de 75,1% a concentraciones de 3, 5, 8 y 10
mg/ml [16]. Estos resultados son comparables con los
obtenidos en este estudio, ya que el crecimiento de A. flavus fue inhibido con los extractos etanlicos y metanlicos de L. tridentata en un 76 y 71,2%, respectivamente.
Penicillum chrysogenum. El anlisis estadstico
indic diferencia significativa entre los solventes y las
plantas (p < 0,05). El crecimiento radial de P. chrysogenum con los extractos metanlicos de S. macrodonthus,
J. cinerea, E. globulus y P. parviflora fue reducido hasta
1 cm. Estos extractos causaron una inhibicin del crecimiento del hongo hasta 59,3% (Tabla 1).
Con los extractos etanlicos de L. tridentata, seguida por D. discolor el hongo creci 0,8 y 1,3 cm, respectivamente, mientras que el testigo creci 2 cm. Este
crecimiento con L. tridentata equivale a una inhibicin

Tabla 1. Inhibicin de crecimiento (%) de hongos por extractos metanlicos de plantas.


Planta
Testigo
E. globulus
B. glutinosa
S. cynanchoides
D. discolor
P. parviflora
N. glauca
A. confertiflora
R. communis
S. rostratum
L. tridentata
S. macrodonthus
A. ambrosioides
K. humboldtiana
J. cinerea

An
0,0d
2,1d
39,5ab
33,0b
28,9bc
16,6c
22,9bc
25,1bc
0,0d

41,5ab
12,5cd
50,0a
52,0a
0,0d

Af
0,0e
44,0bc
37,4c
42,5bc
49,0b
34,0c
16,2d
52,0b
48,1bc

71,2a
46,8bc
34,0c
34,0c
42,5bc

Pch
0,0d
56,9ab
37,7bc
25,5c
44,5b
53,8ab
21,5c
6,7d
5,4d

50,0ab
59,3a
21,7c
48,4ab
54,2ab

Pexp
0,0d
15,4cd
38,5b
58,3
58,3
10,3cd
20,5c
41,1b
28,2bc

58,3
50,0ab
35,9b
38,5b
25,7bc

Fp
0,0f
58,2c
66,6bc
25,9e
70,1b
67,8bc
32,6de
58,1c
39,9d

100a
37,8de
56,6c

25,1e

Fm
0,0e
45,8bc
53,7b
23,6d
46,3bc
42,6bc
18,7d
47,8bc
36,7c

87,7a
28,9c
44,3bc
18,7d
28,7c

a,b, c: Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes entre si (p > 0,05).
An = A. niger; Af = A. flavus; Pch = P. chrysogenum; Pexp = P. expansum; Fp = F. poae y Fm = F. moniliforme.
Elaborados al 6% (p/v).

Tabla 2. Inhibicin de crecimiento (%) de de hongos por extractos etanlicos de plantas.


Planta
Testigo
E. globulus
B. glutinosa
S. cynanchoides
D. discolor
P. parviflora
N. glauca
A. confertiflora
R. communis
S. rostratum
L. tridentata
S. macrodonthus
A. ambrosioides
K. humboldtiana
J. cinerea

An
0,0e
14,8de
56,9b
0,0e
37,5c
20,8d
0,0e
39,3c
3,7e
17,1d
77,3a
9,7de
40,7c
0,0e
1,8e

Af
0,0d
0,0d
27,6b
0,0d
66,0a
36,0b
0,0d
12,3c
5,9cd
0,5d
76,0a
0,0d
26,1b
0,0d
0,0d

Pch
0,0d
19,7c
36,0b
13,1cd
37,7b
14,7cd
8,1cd
26,1bc
11,5cd

63,0a
14,7cd
29,5bc
4,9cd
8,2cd

a, b, c: Tratamientos con diferente letra son significativamente diferentes entre si (p > 0,05).
An = A. niger; Af = A. flavus; Pch = P. chrysogenum; Pexp = P. expansum; Fp = F. poae y Fm = F. moniliforme.
Elaborados al 6% (p/v).

Pexp
0,0f
23,4d
85,8a
46,8cd
58,0bc
8,1def
0,0f
6,5ef
6,5ef
4,8ef
71,4b
0,0f
16,2def
0,0f
0,0f

Fp
0,0f
36,9de
79,6b
25,5e
100a
86,6ab
24,3e
49,7cd
38,8cd
26,1e
100a
33,7de
51,6c
29,9de
42,0cd

Fm
0,0d
42,6bc
30,9c
29,6c
39,6bc
22,6c
2,6d
41,7bc
9,1c
20,9cd
100a
0,0d
50,4b
8,7d
5,2d

Extractos de plantas y crecimiento fngico


Tequida-Meneses M, et al.

2,5
Crecimiento radial (cm)

87

5
Crecimiento radial (cm)

2
1,5
1
0,5
0

48

96

144

192

4
3
2
1
0

Tiempo de incubacin (h)

48

96

144

192

Tiempo de incubacin (h)

Figura 1. Efecto de extractos metanlicos de plantas sobre el crecimiento


radial de A. niger.
4,5
Crecimiento radial (cm)

4
9

Crecimiento radial (cm)

8
7
6
5

3,5
3
2,5
2
1,5
1

0,5

48

96

144

192

Tiempo de incubacin (h)

1
0
48

96

144

192

Tiempo de incubacin (h)

Figura 3. Efecto de extractos etanlicos de plantas sobre el crecimiento


radial de F. poae.

Figura 2. Efecto de extractos etanlicos de plantas sobre el crecimiento


radial de A. flavus.
8

superior al 60%, todos los dems extractos presentaron


bajos porcentajes de inhibicin (Tabla 2).
Penicillium expansum. El crecimiento de P. expansum se vio afectado con los extractos metanlicos de
L. tridentata, D. discolor, S. cynanchoides y S. macrodonthus, ya que el hongo present un desarrollo de 0,5,
0,5, 0,5 y 0,6 cm, respectivamente, mientras que en el testigo tuvo un crecimiento de 1,2 cm. Originando esto una
inhibicin del hongo con dichos extractos entre el 58,3%
y 50% con respecto al testigo, respectivamente (Tabla 1).
En el anlisis estadstico se encontr diferencia significativa entre solventes y plantas (p<0,05).
Para los extractos etanlicos se observ que B. glutinosa fue el ms efectivo para inhibirlo, seguido por
L. tridentata con 0,3 y 0,6 cm de crecimiento radial respectivamente. Este crecimiento comparado con el del testigo, el cual tuvo un crecimiento radial de 2,1 cm,
represent una inhibicin de 85,7 y 71,4, respectivamente
(Tabla 2).
Fusarium poae. El anlisis estadstico mostr diferencia significativa entre solventes y plantas (p<0,05). Se
encontr que este hongo present un crecimiento muy
variado con los extractos metanlicos; donde L. tridentata
evit el crecimiento de este hongo en un 100%. Los
extractos de D. discolor, P. parviflora y B. glutinosa tampoco permitieron el libre crecimiento del hongo, ya que
este present un crecimiento de 2,5, 2,7 y 2,8 cm, respectivamente. El testigo que alcanz un crecimiento de
8,4 cm. Esto represent una inhibicin de 70,1, 67,8 y
66,6% (Tabla 1).

Crecimiento radial (cm)

7
6
5
4
3
2
1
0
48

96

144

192

Tiempo de incubacin (h)

Figura 4. Efecto de extractos metanlicos de plantas sobre el crecimiento


radial de F. moniliforme.

En la figura 3 se presentan los resultados de crecimiento radial de F. poae con los extractos etanlicos. En
dicha figura se observa que los extractos de L. tridentata y
D. discolor evitaron el 100% del crecimiento radial del
hongo. En cambio, el tratamiento testigo present un crecimiento de 5,2 cm. As mismo, los extractos de P. parviflora y B. glutinosa tambin presentaron buen efecto sobre
ste hongo, ya que solo permitieron un crecimiento de 0,7
y 1,1 cm, respectivamente. Se observ claramente que
hubo una mayor inhibicin en su crecimiento por al
menos cinco plantas (Tabla 2), siendo los extractos de
L. tridentata y D. discolor los que mayor inhibicin provocaron con 100%, P. parviflora, B. glutinosa y
A. ambrosioides con 86,6, 79,6 y 51,6%, respectivamente.
Fusarium moniliforme. El crecimiento de F. moniliforme se vio afectado por el extracto metanlico de

88

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L. tridentata, ya que solo alcanz un crecimiento de


0,8 cm, comparado con el testigo que fue de 6,7 cm
(Figura 4). Adems, los extractos de B. glutinosa y
A. confertiflora solo permitieron un crecimiento de 3,1 y
3,5 cm, respectivamente. Se encontr diferencia significativa entre solventes y plantas (p < 0,05) segn el anlisis
estadstico realizado. La inhibicin del crecimiento con el
extracto de L. tridentata fue de 87,7 %, seguido por
B. glutinosa con 53,7% (Tabla 1).
Por otra parte, los extractos etanlicos que afectaron ms el crecimiento de este hongo fueron L. tridentata
y A. ambrosioides con 0 y 1,9 cm de crecimiento radial,
respectivamente. En el tratamiento testigo el hongo present un crecimiento de 3,8 cm. Esto implica que F. moniliforme fue inhibido completamente en su crecimiento con
el extracto de L. tridentata, seguido por el de A. ambrosioides con 50,4%.
CONCLUSIONES
Se encontr mucha variacin en el grado de inhibicin de crecimiento en los hongos en estudio. Destacaron
los extractos de las plantas L. tridentata, B. glutinosa,
D. discolor y P. parviflora, las cuales controlaron al
menos el crecimiento de dos especies de hongos.
Larrea tridentata, inhibi el crecimiento de las seis
especies de hongos en un rango de 41,5% hasta el 100%
tomando en cuenta tanto a los extractos metanlicos como
a los etanlicos.
En el caso de B. glutinosa las especies de hongos
que presentaron una mayor sensibilidad al extracto etanlico fueron Penicillium expansum con 85,7% de inhibicin y Fusarium poae con 79,6%. As mismo, su extracto
metanlico tambin afect a F. poae y F. moniliforme con
66,6 y 53,7% de inhibicin, respectivamente.
Fusarium poae y Aspergillus flavus fueron las
especies de hongos que se inhibieron en mayor proporcin

con el extracto etanlico de D. discolor con 100 y 66%,


respectivamente. En cambio, su extracto metanlico, solo
caus una reduccin del crecimiento de 70,1 y 58,3%, respectivamente, en F. poae y Penicillium expansum.
Los extractos etanlico y metanlico de P. parviflora, solamente inhibieron a F. poae con 86,6% y 67,8%,
respectivamente.
Los hongos del gnero Fusarium fueron los ms
sensibles a los extractos de L. tridentata, B. glutinosa y
D. discolor, ya que con ellos se logr la total inhibicin
del crecimiento (100%).
En general, se puede decir que los extractos de la
planta L. tridentata causaron el mejor efecto fungicida, ya
que a la mayora de los hongos en este estudio, con excepcin de A. niger, les afect su crecimiento en ms del
50%. No todos los hongos fueron inhibidos por los mismos extractos, ni en el mismo grado, ya que A. niger,
A. flavus y F. moniliforme solamente fueron afectados por
dos extractos vegetales, por lo que se podra decir que son
los hongos ms resistentes. En cambio, F. poae fue el ms
sensible a los extractos, ya que fue inhibido hasta en un
100%, y adems, la mayora de los extractos presentaron
un buen efecto sobre dicho hongo.
Se recomienda seguir esta lnea de investigacin,
ya que es de suma importancia encontrar nuevas fuentes
de control de hongos que atacan a los granos, las cuales
sean inofensivas tanto para el hombre como para el
ambiente. Adems, se recomienda que en prximas investigaciones se realicen mezclas en iguales proporciones de
los extractos etanlicos de L. tridentata, D. discolor y
B. glutinosa, ya que stas fueron las plantas con mejor
efecto en la mayora de los hongos usados en la presente
investigacin.

Los autores manifiestan su agradecimiento al Consejo


Nacional de Ciencia y Tecnologa (CONACyT) por el apoyo
financiero otorgado para el desarrollo del proyecto 28293-B.

Bibliografa
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