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INSTITUTO DE QUMICA
BIOQUMICA QBQ220N
Biologia Noturno
Professores
Alexander Henning Ulrich
Hugo Aguirre Armelin
2006
NDICE
APRESENTAO................................................................................................................................5
INTRODUO E NORMAS GERAIS ..................................................................................................5
NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO ........................................................................6
GUIA PARA RELATRIO DE LABORATRIO ..................................................................................6
AVALIAO.........................................................................................................................................7
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA ......................................................................................................7
CALENDRIO DE MDULOS E ATIVIDADES 2006 .........................................................................8
MDULO 1: REAO CIDO-BASE, PH E SISTEMA TAMPO....................................................10
Grupos de discusso 1 ....................................................................................................................11
MDULO 2: AMINOCIDOS.............................................................................................................12
Grupo de discusso 2 ......................................................................................................................12
MDULO 3: ESTRUTURA PRIMRIA DE PROTENAS ..................................................................15
Grupo de discusso 3 ......................................................................................................................16
MDULO 4: ESTRUTURA SECUNDRIA E TERCIRIA DE PROTENAS....................................17
Grupo de discusso 4 ......................................................................................................................20
MDULO 5: CINTICA E TERMODINMICA ..................................................................................21
Grupo de discusso 5 ......................................................................................................................25
MDULO 6: CINTICA ENZIMTICA...............................................................................................26
Grupo de discusso 6 ......................................................................................................................30
MDULO 7: MECANISMOS DE CATLISE ENZIMTICA ..............................................................32
Grupo de discusso 7 ......................................................................................................................34
MDULO 8: ACARES: ESTRUTURA E FUNO ......................................................................35
Grupo de discusso 8 ......................................................................................................................39
I.
FUNDAMENTOS ....................................................................................................................78
II.
OBJETIVOS............................................................................................................................80
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................80
IV.
FUNDAMENTOS ....................................................................................................................84
II.
OBJETIVOS............................................................................................................................87
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................87
IV.
FUNDAMENTOS ....................................................................................................................90
II.
OBJETIVOS............................................................................................................................93
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................93
IV.
FUNDAMENTOS ....................................................................................................................97
II.
OBJETIVOS............................................................................................................................99
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL......................................................................................99
IV.
V.
APNDICE...........................................................................................................................104
FUNDAMENTOS ..................................................................................................................107
II.
OBJETIVOS..........................................................................................................................109
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL....................................................................................109
IV.
APRESENTAO
PROFESSORES:
Prof. Dr. Hugo Aguirre Armelin (coordenador)
MONITORES:
Doutorando Cleber Augusto Trujillo
Procure utilizar reagentes, vidraria e equipamentos disponveis com cuidado, para evitar
desperdcio e quebra.
Mantenha sua rea de trabalho organizada. Ao terminar a experincia passe gua na vidraria
utilizada e a coloque no local indicado.
AVALIAO
Provas em grupo (PG1 a PG6), que consistiro num trabalho em grupo para
resoluo de questes objetivas por um perodo de 4 h;
b)
c)
Provas escritas individuais (P1, P2 e P3). A ltima prova escrita da matria ser
sobre os temas abordados em laboratrio.
PGs + Rs
11
MdiaFinal =
10
Haver uma nica prova substitutiva para substituir uma das provas individuais de avaliao.
Reposies de PG ou relatrio de laboratrio esto vetados. A presena em todas as
atividades obrigatria. Uma lista de presena ser passada em todas as aula. Alunos que
alcanarem a mdia final 5,0 e mostrarem freqncia 70% estaro aprovados. Aqueles cuja
mdia for no mnimo igual a 3,0 e apresentarem freqncia 70% podero fazer a prova de
recuperao.
BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA
A bibliografia recomendada envolve 2 livros textos em portugus:
TORRES, B. B. & MARZZOCCO, A. Bioqumica Bsica.
VOET, D. ; VOET, J. & PRATT, C. W. Fundamentos de Bioqumica.
Contudo, outros excelentes textos de Bioqumica, em geral em ingls, podero ser usados com igual
proveito:
VOET, D. & VOET, J. Biochemistry.
STRYER, L.; BERG, J. M. AND TYMOCZKO, J. L. Biochemistry.
LEHNINGER, A. L. Principles of Biochemistry.
MDULO/
ATIVIDADE
DATA
TTULO
JULHO
31
AGOSTO
10
PG-1.
11
14
CINTICA ENZIMTICA.
17
18
PG-2.
21
AVALIAO 1.
24
25
GLICLISE.
28
10
31
11
12
GLICONEOGNESE
4-8
SEMANA DA PTRIA.
11
.PG-3.
14
AVALIAO 2
15
13
18
14
21
22
15
25-29
16
FOTOSSNTESE 1.
17
FOTOSSNTESE 2.
18
12
FERIADO
13
RECESSO
16
19
SETEMBRO
OUTUBRO
PG-4.
CICLO DAS PENTOSES.
SEMANA TEMTICA DA BIOLOGIA.
PG-5
METABOLISMO DO GLICOGNIO.
LABORATRIO*
19
20
METABOLISMO DE AMINOCIDOS.
20
21
CICLO DO NITROGNIO.
23
PG-6.
26
AVALIAO 3.
27
30
NOVEMBRO
L1-A
B
AULA.
L1-B
R1-A
RELATRIO.
FERIADO
.RECESSO
10
13
16
17
20
23
24
L2-A
R1-B
RELATRIO
L2-B
R2-A
RELATRIO.
L3-A
R2-B
RELATRIO.
L3-B
R3-A
RELATRIO.
L4-A
FRACIONAMENTO DE PROTENAS.
R3-B
RELATRIO.
L4-B
FRACIONAMENTO DE PROTENAS.
R4-A
RELATRIO.
L5-A
R4-B
RELATRIO.
L5-B
R5-A
RELATRIO.
A
R7-B
27
DEZEMBRO
AULA.
RELATRIO.
AVALIAO INDIVIDUAL DO LABORATRIO.
SUBSTITUTIVA.
18
RECUPERAO.
1. A molcula de gua, H2O, apresenta um ngulo de 104,5 graus entre as duas ligaes O-H,
dando-lhe um carter altamente polar. Alm disso, o tomo de O possui 2 pares de eltrons
livres, permitindo a formao de ligaes (ou pontes) de H entre molculas vizinhas. Esta
estrutura d gua propriedades fsicas e qumicas de enorme importncia biolgica.
2. A gua se ioniza atravs de uma reao cido-base:
H2O + H2O
H3O++ OH-
A reao cido-base se caracteriza pela troca de prtons entre pares conjugados de cidos e
bases. A gua pode se comportar como cido e como base:
H3O+ + A-
AH + H2O
BH + OH-
B + H2O
pode-se obter
por analogia
- log K = pK
pH = pK + log [A-]/[AH]
10
Grupos de discusso 1
1) Defina cidos e bases no conceito de Brnsted, mostrando exemplos.
2) a) Qual o pH das solues 0,1 M dos cidos fortes HCl e HNO3? b) Usar a equao HendersonHasselbach para calcular o grau de dissociao dos cidos fracos i) H2S (Ka=1x10-7) e ii) cido
actico (Ka=2x10-5) em solues 0,1 M. Qual o respectivo pH dessas solues?
3) Esquematize a curva de titulao de 1 L de uma soluo de 0,1 M H3PO4 com uma soluo de 10
M NaOH, colocando pH (eixo y) em funo de volume de base adicional (eixo x). Indicar os
pontos na titulao (volumes de NaOH) em que o pH equivale cada um dos pKas do cido.
4) Indique como se pode preparar 1 L de um tampo a pH=7,0, capaz de manter o pH estvel com
adio de 10 mL de HCl 0,1M, dispondo-se das solues:
a) 1M H3PO4
b) 1M cido actico
c) 1M NaOH
5) Desenhe a estrutura do gelo, mostrando pontes de hidrognio entre molculas de gua. O que
acontece quando o gelo derrete? Porque a gua lquida 4oC mais densa do que o gelo 0oC?
6) Desenhe a estrutura do NaCl no estado slido e tambm no estado aquoso, neste ltimo,
destaque suas interaes com gua.
11
MDULO 2: AMINOCIDOS
H3N
COO-
H
2. Aminocidos podem ser agrupados em classes com base nas propriedades dos seus grupos
radicais (R), em particular sua polaridade ou tendncia de interagir com gua em pH
biolgico ( 7,0).
3. Todos os aminocidos livres comportam como cidos poliprticos. Quando um aminocido
cristalino dissolvido em gua, ele pode agir como um cido ou como uma base. O grupo
carboxlico mostra um pK em torno de 2,0, enquanto o grupo amino tem um pK entre 9,0 e
10,0. Portanto, no pH fisiolgico (pH 7,0), a maioria das molculas de todos os aminocidos
est na forma de ons dipolares (zwitterions). Chama-se pI de um aminocido o pH da
soluo na qual suas molculas possuem carga lquida nula. Na cadeia lateral (-R) os
aminocidos apresentam grupos funcionais, entre os quais existem grupos cido-base.
4. O carbono dos aminocidos, excetuando-se a glicina, assimtrico, fazendo com que
estas substncias tenham atividade ptica e, portanto, apresentem pares de ismeros
pticos.
Grupo de discusso 2
1) Quais dos aminocidos tm dois carbonos quirais e qual deles no possui isomeria ptica?
2) Mostre porque a seguinte forma no-inica de um aminocido no pode ser encontrada em
soluo aquosa.
R
H2N
COOH
12
3) O etanol no tem carter cido em gua, enquanto fenol e cido actico se dissociam em soluo
aquosa, sendo o cido actico (pK=4,8) mais forte que o fenol (pK=10). Como se pode explicar o
comportamento destes trs compostos em gua a partir de suas estruturas moleculares?
4) Esquematize a curva de titulao da glicina com NaOH a partir de pH=1 e do cido asprtico com
HCl a partir de pH=11. Coloque o pH na ordenada e, na abscissa, a quantidade de equivalentes
de cido ou base forte.
5) a) Quais os pontos isoeltricos de: glicina (pKs=2,5 e 9,5), cido asprtico (pKs=2,5; 4,0 e 9,5),
lisina (pKs=2,5; 9,5 e 10) e histidina (pKs=2,5; 6,0 e 9,5)? b) Calcular as cargas lquidas
(aproximadas) do cido asprtico, lisina ou histidina nos seguintes pHs: pH 1, pH 8, pH 11.
6) Tentar classificar os aminocidos em termos da natureza qumica dos seus grupos radicais: a)
ionizveis ou no ionizveis, b) cidos ou bsicos, c) polares ou no polares, d) hidroflicos ou
hidrofbicos, e) alifticos ou aromticos, f) lineares ou ramificados e g) pequenos e grandes.
7) Na Tabela 1 indicar: a) O cdigo de letra nica para cada aminocido e b) os pKR dos
aminocidos com grupos radicais ionizveis.
13
14
Esta reao, como esta escrita, jamais ocorre nos seres vivos. A unio dos aminocidos por
ligao peptdica no feita por reao direta entre eles, mas atravs de um complexo
aparato de sntese protica, que inclui ribossomos, cidos ribonuclicos, vrias protenas e
enzimas num processo chamado traduo. A equao mostra apenas o resultado liquido do
processo.
3. As propriedades da ligao peptdica impem restries ao dobramento do polmero formado.
A ligao peptdica apesar de ser representada por um nico trao de ligao, tem
caractersticas intermediarias entre uma ligao simples e uma dupla ligao, devido as
interaes entre duas formas de ressonncia.
15
O polmero formado pode, portanto, ser visualizado como uma cadeia constituda por
unidades planares (unidades peptdicas), unidas entre si com uma articulao flexvel: o
carbono . Esta cadeia chama-se cadeia polipeptdica. As protenas podem ser formadas por
uma ou mais cadeias polipeptdicas.
4.
5.
A cadeia polipeptdica pode ser dividida entre a cadeia principal e as cadeias laterais
(grupos R) ligados aos carbonos alfa.
Grupo de discusso 3
1) Defina estrutura primria, secundria, terciria e quaternria de uma protena, dando exemplos.
2) Esquematize a estrutura de uma ligao peptdica.
16
3) a) Desenhar o tripeptdeo Ala-Asp-His. b) Calcular o seu pI. c) Calcular sua carga lquida em pH
1, pH 6 e pH 12.
4) Com os dados abaixo, defina a seqncia do peptdeo analisado: a) hidrlise cida total resultou
em: Arg, Tyr, Leu, Ala, Glu Lys, Ser e Pro; b) dansilao e hidrlise produziram: dansil-Leu; c) dois
ciclos consecutivos de degradao de Edman liberaram, respectivamente Leu e Tyr; d) tripsina
liberou 2 peptdeos cujas composies, aps hidrlise cida total, foram, respectivamente (Tyr, Leu,
Arg) e (Ser, Glu, Pro, Ala Lys); e) carboxipeptidase A no liberou nada, mas carboxipeptidase C
liberou Ser; f) endopeptidase V8 liberou o tripeptdeo Lys-Pro-Ser e um pentapeptdeo que, tratado
com carboxipeptidase C, liberou Glu.
5) Mostre a reao de xido-reduo da cistena que importante na estrutura de peptdeos.
17
Figura 2: -hlice.
2. H duas estruturas secundrias principais: -hlice (Figura 2) e folha pregueada (Figura 3),
que so estruturas organizacionais regulares e repetitivas. Estas duas estruturas podem ser
caracterizadas por combinaes de angulos phi e psi (Figura 1) adotadas pela cadeia principal.
Alm de -hlice e folha , as protenas globulares mostram tambm alas de formas definidas,
mas irregulares e no repetitivas.
3. A estrutura terciria descreve o arranjo tridimensional da cadeia principal da protena, incluindo a
disposio espacial das cadeias laterais dos aminocidos. H muitas possibilidades de arranjos
tridimensionais para a estrutura terciria das protenas.
a. As propriedades bioqumicas e biolgicas de uma protena so determinadas pelo arranjo
tridimensional de sua cadeia, isto , pela sua estrutura terciria. Logo, nas condies
fisiolgicas a protena adquire uma estrutura terciria bem definida e necessria sua
funo, que conhecida como estrutura nativa. O desarranjo da estrutura terciria leva
perda de funo da protena, processo que genericamente chamado de desnaturao.
b. Em protenas pequenas da estrutura primria define a estrutura terciria nativa da protena.
Nestes casos os processos de desnaturao e renaturao da estrutura da protena so
reversveis. A estrutura nativa a conformao da protena de menor nvel de energia livre
(G) e alcanada espontaneamente (processo exergnico). O exemplo clssico desse
comportamento dado pela protena Rnase A, uma enzima que no seu estado nativo
catalisa a hidrlise de RNA. Para protenas grandes o processo de desnaturao
irreversvel e o fenmeno de alcance da conformao nativa complexo e ainda mal
entendido.
18
c. A estrutura tridimensional das protenas mantida por ligaes fracas como pontes de H,
ligaes inicas e interaes hidrofbicas. A exceo a ponte de dissulfeto (-S-S-) que,
apesar de covalente, importante na manuteno da conformao nativa de protenas.
d. Protenas possuem muitos grupos ionizveis atravs de reao cido-base, cujos pKs variam
enormemente. O pI de uma protena definido como pH da soluo na qual a carga lquida
da molcula de protena nula.
4. Existem muitas maneiras diferentes para apresentar estruturas tridimensionais de protenas.
Topografia
de superfcie
Fita (azul = H)
modelo space-filling
19
Grupo de discusso 4
20
exergnica.
Se,
ao
contrrio,
for
positivo,
reao
no
ocorre
B/A = K
G = - 2,3 RT logK
5. Em condies padro, 25C (298K), com concentraes de reagentes e produtos iguais a 1M,
pH = 0, a variao de energia livre considerada padro, ou G. Entretanto, a maioria das
reaes bioqumicas ocorrem em pH 7,0, para as quais utiliza-se G.
6. A Figura 4 mostra esquematicamente como varia G com o desenvolvimento da reao, indicado
no eixo das abcissas como coordenada de reao
21
Energia
Livre
(G)
Estado de Transio
G*
G'
Coordenada de Reao
Figura 4. Variao de energia livre (G) no decorrer de uma reao genrica.
Para que a reao ocorra, necessariamente tem-se Gfinal < Ginicial, isto , G negativo. Um ponto
importante a ser destacado que o valor de G permite prever se a reao pode ocorrer, mas
no a velocidade com que a reao atinge o equilbrio. A velocidade de reao depende da
energia livre do Estado de Transio que maior que do que o dos reagentes no Estado Inicial,
isto , G* positivo. Quanto maior o valor de G*, menor ser a velocidade de reao.
7. Na reao genrica A B a velocidade (v) proporcional a [A], isto , v1=k1[A]. A velocidade da
reao inversa ser, consequentemente, v-1=k-1[B]. k1 e k-1 so constantes de velocidade e
reaes como AB e BA so ditas de primeira ordem, porque as suas respectivas
velocidades dependem de concentrao molar de um nico reagente elevado potncia 1. As
constantes de velocidade k1 e k-1 so diferentes da constante de equilbrio da reao, K=[B]/[A].
No estado de equilbrio, por definio, v1=v-1 e, portanto, formalmente, K=k1/k-1. As reaes
representadas pelas equaes seguintes: 2AB e A+BC so de segunda ordem, cujas
velocidades so, respectivamente, v=kA[A]2 e v=kAB[A][B]. Notar que a ordem da reao no
coincide necessariamente com a estequiometria da equao qumica.
8. As quinases formam uma classe muito importante e abundante de enzimas, que se caracterizam
por catalisar a transferncia de um grupo fosfato de alta energia para uma outra substncia
receptora.
9. So chamados compostos de alta energia substncias orgnicas com o grupo fosfato em
ligaes anidrido ou fosfoenol, cuja hidrlise libera fostato inorgnico (Pi) com um G0 negativo
e em valor absoluto superior a 8kcal/mol. Outros compostos fosforilados com o fosfato em
ligaes ester ou tioester tambm mostram um G0 de hidrlise negativo, mas de valor absoluto
22
NH2
C
N
HC
N
O-
O-
Ad e n i n a
C H
C
N
O-
- O- P - O- P - O- P - O- C H
2
O
O
H
HO
Ri b o s e
OH
A MP
ADP
AT P
FIGURA 2
Figura 5. Frmula estrutural do ATP.
23
R
P
H2O
CH2
CH3
Fosfoenol
cetona
Pi
cido
R
C
C OH
H2O
H2O
CoA
R OH
H2O
H2O
ADP
H2O
AMP
H2O
A OH +
lcool
(Adenosina)
Adenosina monofosfato
Pi
cido
cido
+
tiolcool
cido
Adenosina difosfato
AMP
cido
O
cido
Pi
R C OH + HS-CoA
Adenosina trifosfato
ADP
lcool
O
Tioster
ATP
cido
cido
ster fosfrico
R C S
Pi
O
Anidrido fosfrico
R O
Pi
cido
Pi
cido
Na clula:
[ATP] + [ADP] + [AMP] = constante
24
11. Alm das quinases que catalisam a transferncia de grupo fosfato do ATP para metablitos,
existem as quinases que tem como substratos protenas, genericamente referidas como
quinases de protena ou, simplesmente, protena-quinases.
H alguns milhares de protena-quinases diferentes em um organismo, que catalisam a
transferncia de fosfato de ATP para o grupo OH da cadeia lateral de resduos especficos de
serina e treonina formando um ster de fosfato. As reaes deste tipo so genericamente
chamadas de fosforilaes e so modificaes covalentes que causam mudana de
conformao das protenas, alterando sua atividade biolgica. Por exemplo, um grande nmero
de enzimas so fosforiladas para sofrer uma transio do estado inativo ao ativo ou vice-versa.
Mais raramente as protenas so fosforiladas no grupo enlico de resduos de tirosina.
Grupo de discusso 5
1) Defina reaes exotrmicas e endotrmicas. Qual a relao entre estes conceitos e a funo
termodinmica entalpia?
2) Defina reaes exergnicas e endergnicas. Qual a relao destes conceitos com G0.
3) G0 caracterstico de cada reao (desde que a temperatura seja constante) e no varia
com as concentraes de reagentes e produtos no equilbrio. G, por outro lado, no
caracterstico da reao, podendo assumir qualquer valor em funo das concentraes iniciais
de reagentes e produtos (quociente Q na expresso de G). Mostre por que estas afirmaes
so verdadeiras discutindo a expresso que relaciona G0 e G.
4) Na reao genrica AB Keq=103. Qual o valor de G0? No ponto de equilbrio as
concentraes molares de A e B podem variar? Como varia G com as concentraes molares
iniciais de A e B?
5) Ainda para a reao AB (questo 4) proponha uma condio na qual a reao inversa seja
espontnea. Mostre que a sua proposta possvel calculando o respectivo G. Esta questo
possui mltiplas respostas ou apenas uma resposta nica?
6) Para a reao AB (questo 4), se a constante de velocidade de primeira ordem, k1 for igual a
10, qual deve ser o valor da constante k-1 para a reao inversa? Para um mesmo K, constante
de equilbrio, pode haver mltiplos valores de k1 e k-1 ? Qual a interpretao termodinmica para
a sua resposta?
25
1.
Enzimas so catalisadores biolgicos cuja natureza qumica proteica. A natureza proteica das
enzimas lhes proporciona alto grau de especificidade.
2.
A grande maioria das reaes biolgicas no ocorre, ou ocorrem a velocidades baixssimas nas
condies fisiolgicas de pH e temperatura. Logo, as reaes biolgicas, em geral, necessitam
de catlise para ocorrer, isto , necessitam de enzimas. Para cada reao h uma enzima
especfica.
3.
Energia
Livre (G)
*
G10#
Estado de transio da
reao no catalisada
G0#-1
Estado de transio da
reao catalisada
Estado Inicial
(S)
G0#1cat
G0
G0#-1cat
Estado Final
(P)
Coordenada de Reao
Figura 6. Variao de energia livre (G) na reao genrica A B.
26
G0 uma constante que se relaciona com a constante de equilbrio da reao pela expresso G0=2.3 RTlogK. Por outro lado, as velocidades das reaes AB e BA ou, respectivamente,
as constantes de velocidade k1 e k-1 no dependem do G0 da reao, mas dos, respectivos,
G10 e G-10, que por sua vez s dependem da energia livre (G) do estado de transio
(energias de ativao). A enzima (catalisador) no muda o G0 da reao, pois
catalisadores no interferem com os estados inicial e final das reaes, mas mudam o
caminho da reao e, por conseqncia diminuem a energia do Estado de Transio.
4.
Uria uma substncia muito estvel em gua, mas que pode ser rapidamente decompostas
por hidrlise se a reao for catalisada pela enzima urease:
H2N
UREASE
C=O + H2O
CO2 + 2 NH3
H2N
Trata-se de reao de primeira ordem, onde v=k1[uria], apesar da equao estequiomtrica
indicar a existncia de 2 reagentes. Esta reao pode ser acompanhada em tubo de ensaio no
laboratrio. As Tabelas 3 e 4 mostram resultados obtidos na prtica.
Tempo (minuto)
NH3(moles)
0.084
0.168
0.252
0.336
10
0.420
27
Uria (mM)
Urease (g)
NH3 (moles)
2,5
0,1
0,21
5,0
0,1
0,42
10
0,1
0,59
15
0,1
0,67
25
0,1
0,73
50
0,1
0,78
100
0,1
0,79
200
0,1
0,78
200
0,00
E + S
k1
ES
kcat
E + P
k-1
A derivao da equao Michaelis Menten:
v = Vmax[S] / (Km + [S]) = kcat[Et][S] / (Km + [S])
apresentada na prxima pgina.
28
Velocidade
naquela [S]
Velocidade mxima
Kdiss aparente do
Complexo enzima-substrato
Concentrao
do substrato
29
5.
6.
7.
onde = (1+[I]/KI)
8.
Grupo de discusso 6
V (mol/L.min)
22
10
39
20
65
50
102
100
120
200
135
Os grficos de, respectivamente, V em funo de [S] e 1/V em funo de 1/[S] podem servir para
determinar Km e Vmax? Como?
30
[S] (M)
Com Inibidor A
Com Inibidor B
1,25
1,72
0,98
1,01
1,67
2,04
1,17
1,26
2,5
2,63
1,47
1,72
5,0
3,33
1,96
2,56
10,0
4,17
2,38
3,49
31
32
33
No primeiro estgio desta reao, a amina faz um ataque nucleoflico ao grupo carbonila do
acetoacetato formando uma base de Schiff (ligao imina).
OH
Grupo de discusso 7
1) Examine a reao de hidrlise de RNA catalisada pela RNase A para verificar que se trata de um
mecanismo de catlise cido-base.
34
2) Faa o grfico da velocidade de uma reao enzimtica em funo do pH para uma enzima
estvel entre pHs 3 e 12, considerando que o substrato no possui grupos ionizveis e a
atividade enzimtica exige no centro ativo uma carboxila (pKa = 5) desprotonada e um grupo
amino (pKa = 9) protonado.
3) Definir catlise eletrosttica. Procure um exemplo de uma enzima que utiliza esta estratgia.
4) Descrever o mecanismo empregado pelas serina proteases (tripsina, quimiotripsina, elastase, etc)
para hidrolisar ligaes peptdicas. Descrever todas as etapas da reao. Quais tipos de catlise
so empregados em cada uma das etapas?
35
36
37
Caso a ligao glicosdica envolva a condensao dos dois OHs glicosdicos como o caso
da trealose, uma 1-1-diglicose, o dissacardeo no pode ser oxidado pelo reagente de
Fehling (dissacardeo no redutor). J a maltose, que possue um OH glicosdico livre um
dissacardeo redutor, sendo oxidado pelo reagente de Fehling.
4. Polissacardeos so polmeros constitudos de centenas ou milhares de resduos de
monossacardeos, geralmente glicose, formando cadeias lineares, como a celulose (1-4poliglicose), ou cadeias ramificadas, como o glicognio e o amido.
O glicognio altamente ramificado, as suas cadeias lineares so formadas por ligaes 14-glicosdicas e suas ramificaes decorrem de ligaes 1-6-glicosdicas (Figura 13). O
glicognio apresenta uma nica extremidade redutora livre (C1 no resduo final na ltima
molcula de glicose da cadeia) e inmeras extremidades no redutoras. A partir das
extremidades no redutoras h acrscimo ou retirada de resduos do polmero. Portanto, as
molculas de glicognio no tm tamanhos definidos.
38
Grupo de discusso 8
39
pode produzir uma maior variedade de estruturas: oligopeptdeos compostos de cinco resduos
de diferentes aminocidos ou oligossacardeos compostos de cinco resduos de diferentes
monossacardeos? Explique.
7) Frutose, o principal acar do mel, comumente usada como adoante de alimento. Este acar
na forma -D-piranose provavelmente a substncia mais doce conhecida. A forma -Dfuranose muito menos doce.
a) Quais so as estruturas da -D-frutopiranose e -D-frutofuranose?
b) A doura do mel diminui ao deix-lo em repouso e ao mesmo tempo aumentando a temperatura.
Explique.
8) Interconverso das formas de D-galactose. Uma soluo recm-preparada da forma de Dgalactose (1g/ml em um tubo polarimtrico de 1 dm) mostra uma rotao ptica de + 150,7o.
Quando deixada em repouso por um longo perodo de tempo a rotao decresce gradualmente
at atingir um valor de equilbrio igual a + 80,2o. Em contraste, uma soluo recm-preparada
(1g/ml) da forma mostra rotao tica de apenas +52,8o . Quando esta soluo deixada em
repouso por vrias horas a rotao aumenta at o valor de equilbrio igual a +80,2o , valor
idntico quele observado para a -D-galactose.
a) Escreva as frmulas de projeo de Haworth das formas e da D-galactose. Qual
caracterstica distingue as duas formas?
b) Por que a rotao de uma soluo recm-preparada da forma decresce gradualmente com o
tempo? Explique por que solues das formas e (de concentraes iguais) atingem o mesmo
valor de rotao ptica no equilbrio?
c) Calcule a composio percentual das duas formas de galactose no equilbrio.
MDULO 9: GLICLISE
40
3. A reao que permite a obteno de NADH a nica de oxido-reduo da gliclise, pela qual
gliceraldedo-3-P oxidado a glicerato-1,3-bisP, atravs da ao oxidante de NAD+ catalisada
pela enzima gliceraldedo desidrogenase. A manuteno da capacidade oxidante da gliclise
exige que NADH seja re-oxidada a NAD+ , uma alternativa para isso apresentada na figura,
atravs da reao pela qual NADH reduz piruvato a lactato, recuperando NAD+. Esta alternativa
ocorre no msculo esqueltico com baixos nveis de O2.
4. J ATP produzido em duas reaes distintas pelas quais um radical fosforil transferido de,
respectivamente, glicerato-1,3-P e P-enolpiruvato para ADP, em transferncias catalisadas por
glicerato-1,3-P-quinase e P-enolpiruvato-quinase. Esta maneira de fosforilao de ADP
conhecida como fosforilao a nvel do substrato, para distingui-la da fosforilao oxidativa da
mitocndria que ser vista mais adiante.
6. Diversas outras hexoses, como frutose, galactose e manose, tambm so metabolisadas pela via
glicoltica.
41
HOCH2
O
GLICLISE
OH
HO
OH
Glicose
OH
ATP
ATP
ADP
ADP
P -OCH2
O
OH
Glicose 6-fosfato
HO
OH
OH
P -O-CH2 O CH2OH
HO
OH
Frutose 6-fosfato
HO
ATP
ATP
ADP
P -O-CH2 O
ADP
CH2O- P
HO OH
HO
HC=O
H2C-O- P
C=O
Diidroxiacetona
fosfato
HC-OH
H2C-OH
Gliceraldedo
3-fosfato
H2C-O- P
Pi
NAD+
Pi
NAD+
NADH
NADH
O=C-O- P
HC-OH
1,3 Bisfosfoglicerato
H2C-O- P
ADP
ADP
ATP
ATP
O=C-OHC-OH
3-Fosfoglicerato
H2C-O- P
COOHC-O- P
2-Fosfoglicerato
H2C-OH
H2O
COOC-O- P
Fosfoenolpiruvato
CH2
ADP
ADP
ATP
C=O
HC-OH
CH3
ATP
COO-
COO-
NAD+
NADH
CH3
Lactato
Piruvato
NAD+
NADH
42
Grupo de discusso 9
Glicose 2 lactato
43
44
Piruvato
CoASH + NAD+
CO2 + NADH
Acetil-CoA
H2O
CoASH
Oxaloacetato
Citrato
NADH + H+
H2O
NAD+
cis-Aconitato
L-Malato
H2O
H2O
Fumarato
Isocitrato
Ciclo de Krebs
FADH2
NAD+
FAD
NADH + H+
Succinato
Oxalosuccinato
GTP
CO2
GDP + Pi
Succinil-CoA
NADH
+ H+
CoASH
CO2
a-Cetoglutarato
NAD+
Grupo de discusso 10
45
produzidos na gliclise e ciclo de Krebs, ocorre acoplada produo de ATP, a partir de ADP +
Pi. Este processo se d na cadeia respiratria ou cadeia de transporte de eltrons, que
compreende um conjunto ordenado de enzimas e transportadores de eltrons inseridos na
membrana interna da mitocndria.
2. A cadeia respiratria contem 4 complexos, I,II, III e IV, ordenados por ordem crescente de
potencial redox, indo do potencial padro de NAD+/NADH (E0= -0,315V) ao do O2/H2O (E0=
+0,815V). Os eltrons so transferidos do complexo I ou II para o complexo III pela coenzima
Q (ou ubiquinona), e do complexo III para o complexo IV pelo citocromo C para chegar ao O2.
NADH e FADH2
exergnica de eltrons do nvel redox de NADH para o de O2 (E0= 1,130V) envolve uma
diferena de energia livre liberada (G0= -218kJ/mol) que em parte retida pelo transporte de H+
46
do lado interno para o externo da membrana, criando o gradiente eletroqumico de prtons que
permitir empurrar o processo endergnico de fosforilao de ADP por Pi para gerar ATP,
atravs da bomba de prtons que constitui a ATP sintase (tambm conhecida com F1F0ATPase).
Espao
Intermembranar
2 H+
4 H+
2 H+
Cit C
Complexo I
Matrix
Mitocondrial
Complexo III
Complexo IV
NAD+
1/2 O2 + 2H+
NADH + H+
H2O
Complexo II
FADH2
4. A grande quantidade de energia livre que seria dissipada na oxidao completa da glicose a CO2
e H2O [C6H12O6 + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O; G0= -2823 kJ/mol] aproveitada para produo de
ATP, graas quase exclusivamente ao processo de fosforilao oxidativa, rendendo 38ATP por
mol de glicose (incluindo neste total 2ATP da gliclise e 2 do ciclo de Krebs).
47
6. A sntese de ATP a partir de ADP e Pi na mitocndria, que catalisada pela ATP sintase,
dirigida pelo processo de transporte de eltrons. Mas como a ATP sintase fisicamente separada
das protenas do transporte de eltrons, a energia livre liberada no transporte de eltrons deve
ser conservada em uma forma que possa ser utilizada pela ATP sintase. A energia livre do
transporte de eltrons conservada pelo bombeamento de H+ da matriz mitocondrial para o
espao intermembranar, criando um gradiente de H+. A volta dos prtons ao interior da
mitocndria termodinamicamente favorvel. A membrana interna da mitocndria impermevel
a prtons em toda sua extenso, exceto na ATP sintase; e ento por este canal que os prtons
atravessam a membrana, de volta matriz mitocondrial. A variao de energia livre associada ao
transporte de um prton atravs da membrana interna da mitocndria pode ser determinada
atravs de medidas da diferena de pH e do potencial de membrana estabelecidos em
mitocndrias consumindo oxignio.
Grupo de discusso 11
48
1. O fgado humano precisa manter nveis mnimos da glicose circulante, porque crebro e
hemcias dependem quase exclusivamente de glicose para produo de energia. No entanto, a
reserva de glicognio heptico no suficiente para essa finalidade. Por isso, o fgado sintetiza
glicose de novo a partir de lactato, piruvato, glicerol, intermedirios do ciclo de Krebs e
aminocidos, atravs de uma via anablica chamada de gliconeognese. No jejum, mesmo o
jejum de poucas horas, a gliconeognese a principal fonte da glicose liberada pelo fgado na
circulao.
2. A gliclise, como j foi visto, um a via catablica com a finalidade de produzir energia na forma
de 2 NADH + 2 ATP a partir da degradao de glicose a piruvato de acordo com a equao
qumica seguinte:
Glicose + 2 NAD+ + 2 ADP + 2 Pi 2 Piruvato + 2 NADH + 2 ATP + 2 H2O + 2 H+
A gliconeognese tem a finalidade de sintetizar glicose a partir de piruvato, isto , faz o caminho
metablico inverso ao da gliclise. Mas, a gliconeognese, contrariamente gliclise, muito
49
endergnica. Para produzir glicose a partir de piruvato necessitam-se 2 NADH + 4 ATP +2 GTP,
conforme a estequiometria indicada na equao abaixo:
2 Piruvato + 2 NADH + 4 ATP + 2 GTP + 2 H2O Glicose + 2 NAD+ + 4 ADP + 2 GDP + 6 Pi + 2 H+
3. A gliconeognese utiliza enzimas glicolticas reversivelmente, mas trs dessas enzimas, a
hexoquinase, a fosfofrutoquinase e a piruvato quinase, catalisam reaes com G- muito
negativo, sendo essencialmente irreversveis. Estas reaes so substitudas na gliconeognese
por reaes exergnicas, tornando termodinamicamente favorvel a sntese de glicose a partir
de piruvato. Destas reaes, as duas primeiras correspondentes s enzimas hexoquinase e
fosfofrutoquinase, so substitudas por reaes simples de hidrlise de ligao fosfo-ester,
catalisadas, respectivamente, pelas enzimas glicose-6-P-fosfatase e frutose-1,6-bis-fosfatase. J
a terceira reao, que permite a volta de piruvato para P-enolpiruvato mais complexa e se d
em duas etapas catalisadas, respectivamente, por piruvato-carboxilase e P-enolpiruvatocarboxiquinase.
4. O balanceamento entre gliclise e gliconeognese coordenadamente controlado por um
complexo sistema de regulao enzimtica, envolvendo interaes alostricas e modificaes
covalentes. Todo esse controle est concentrado nas 3 reaes nas quais gliclise e
gliconeognese seguem reaes independentes, irreversveis e opostas, que so: 1) glicose /
glicose-6-P; 2) frutose-6-P / frutose-1,6-bisP; 3) P-enolpiruvato / piruvato.
Grupo de discusso 12
50
51
52
(acil-CoA)
oxidao
FAD
FADH2
H
R CH2 C = C C S-CoA
(enoil-CoA)
H
H2O
hidratao
HO H
R CH2 C C C S-CoA
H
(L-hidroxiacil-CoA)
H
NAD+
oxidao
NADH
O
(ceto acil-CoA)
CoA
R CH2 C S-CoA +
H3C C S-CoA
(acetil-CoA)
7. A oxidao completa de uma molcula de palmitato (16 C) a CO2 e H2O, atravs da betaoxidao, ciclo de Krebs e cadeia respiratria, rende 129 ATP. importante destacar que este
rendimento, medido em ATP/mol-oxidado, muito superior ao da oxidao completa de
aucares e protenas, pois a oxidao de um cido graxo leva liberao de 37,6 kJ/g de
energia livre, enquanto oxidao de aucares ou protenas libera apenas 16,7 kJ/g.
8. Os cidos graxos so sintetizados no citosol por via anablica prpria que adiciona
seqencialmente unidades de 2 C cadeia em crescimento. Esta via alimentada por
acetilCoA, mas s a primeira unidade de 2 C entra como acetilCoA, as subseqentes so na
forma de malonilCoA. Portanto, o acetilCoA precisa ser previamente ativado a malonilCoA, por
carboxilao e consumo de 1 ATP, para permitir a reao de condensao, levando ao
crescimento da cadeia do cido graxo de uma unidade de 2 C, por ciclo de sntese. A ativao
de acetilCoA catalisada pela acetilCoA-carboxilase, uma enzima sujeita a controle complexo,
53
Grupo de discusso 13
1) Ponto de fuso dos cidos graxos. Os pontos de fuso de uma srie de cidos graxos de 18
tomos de carbono so: cido esterico (69,9oC), cido olico (13,4oC), cido linolico(-5oC) e
cido linolnico (-11oC). Que aspecto estrutural destes cidos graxos de 18 carbonos pode ser
correlacionado com o ponto de fuso? Fornea uma explicao molecular para esta tendncia
do ponto de fuso.
2) Mostre como os cidos graxos so ativados antes de serem degradados. Em que compartimento
celular isso ocorre?
3) Aonde e sob que forma so estocados os cidos graxos? Como os cidos graxos da reserva
metablica so mobilizados para serem oxidados na matriz mitocondrial?
4) Explique os passos da -oxidao dos cidos graxos, partindo de uma molcula de palmitato.
Calcule o rendimento energtico da oxidao completa de palmitato a CO2 e H2O.
5) Na -oxidao, a cadeia de cidos graxos degradada aos pares de carbono. Na sntese de
cidos graxos, a cadeia cresce tambm aos pares de carbono. No entanto, o precursor na
elongao da cadeia, durante a sntese, malonil-CoA e no acetil-CoA. Explique porqu.
54
6) Equacione as etapas que compem o conjunto de reaes que permitem adicionar acetil-CoA
cadeia de cido graxo crescente durante a sntese de palmitato. Mostre que etapa torna o
processo favorecido termodinamicamente.
7) Compare a -oxidao e a biossntese de palmitato, mostrando diferenas e semelhanas em:
a) carregadores de grupos acila;
b) reaes de xido-reduo;
c) coenzimas de xido-reduo;
d) gasto ou produo de energia em termos de equivalentes de ATP e de coenzimas redutoras.
8) Mostre como se d a oxidao do cido olico.
1. Molculas anfiflicas, como lipdeos com uma nica cauda hidrofbica, cidos graxos livres e
detergentes, quando em soluo aquosa e acima de um limiar de concentrao
(concentrao micelar crtica ou cmc) formam agregados globulares chamados micelas.
2. Por outro lado, lipdeos com duas caudas hidrofbicas, como glicerofosfolipdeos e
esfingolipdeos, tendem a formar bicamadas lipdicas, que so a base estrutural das
membranas biolgicas.
Micela
Bicamada
55
para as membranas biolgicas, que foi plenamente confirmado por resultados experimentais
estruturais e funcionais.
56
57
Grupo de discusso 14
1) O que concentrao micelar crtica. Como varia tamanho e forma de micelas formadas por
anfiflicos de uma nica cauda hidrocarbonada? Explique.
2) Uma hiptese central na pesquisa de membranas que os lipdeos da membrana devem ser
fludos (em oposio a "congelados") a fim de que a membrana possa desempenhar suas
funes. O apoio para esta hiptese fornecido pela observao de que a composio de cido
graxo das membranas pode ser alterada pelas condies nas quais a bactria cresce. Por
exemplo, se a bactria est crescendo em temperatura menor que a normal, as quantidades
observadas de cidos graxos insaturados (relativas ao contedo de cido graxo saturado) esto
acima do normal.
Contrariamente, se a bactria est crescendo em temperatura acima da normal, as quantidades
observadas de cidos graxos insaturados nos lipdeos da membrana (relativas aos cidos
graxos saturados) esto abaixo do normal.
a) Sugira razes para o fato de que o contedo lipdico na membrana bacteriana deve ser fluido
para que a membrana intacta opere apropriadamente.
b) Explique como a alterao observada nos nveis dos cidos graxos insaturados relativa aos
nveis dos cidos graxos saturados, em diferentes temperaturas de crescimento, apia a
hiptese da fluidez da membrana.
3) Fornea uma explicao termodinmica para o fato de que molculas de fosfolipdeo difundem
rapidamente no plano da bicamada, mas muito lentamente mudam de uma face oposta.
4) Descreva os mecanismos pelos quais detergentes extraem protenas integrais de membrana,
mantendo-as em soluo.
5) Explique porque soda funciona bem para desentupir pias entupidas com gordura animal.
6) Para saber se uma bactria tomava leucina e etileno glicol por transporte mediado ou no
mediado, foram feitas medidas de velocidade inicial de tomada em funo da concentrao de
ambas substncias, resultando na tabela fornecida abaixo. O que voc conclui do exame dessa
tabela? Explique e calcule Kt e Vmax se encontrar evidncias de transporte mediado.
58
Componente
Leucina
Concentrao [M]
-6
110
-6
220
-6
480
-5
830
-5
1700
-4
2600
-4
3100
-3
3200
-3
-3
5 x 10
0,01
10
0,05
50
0,1
100
0,5
500
1,0
1000
1 x 10
2 x 10
5 x 10
1 x 10
3 x 10
1 x 10
5 x 10
1 x 10
Etileno glicol
1 x 10
7) Clulas epiteliais de intestino de camundongo isoladas em cultura transportam L-leucina e Dleucina mostrando Kt (mM) e Vmax, respectivamente iguais a: 0,24 e 420 para L-leucina e 4,7 e
310 para D-leucina, ambos em presena de Na+ no meio de cultura. Mas na ausncia de Na+ , Lleucina mostra 0,24 e 23 enquanto D-leucina mostra 4,7 e 5 para Kt (mM) e Vmax,
respectivamente. Classifique esse transportador de leucina quanto ao tipo e mecanismos de
ao. Que efeitos voc esperaria se nesse meio de cultura fosse colocada valinomicina (ionforo
de Na+)? E se fosse dissolvida ouabana (inibidor da ATPase Na+/K+) no meio de cultura?
Explique.
8) O pH e a absoro de drogas. A droga aspirina, intensamente receitada, um cido fraco com
um pKa de 3,5. A aspirina absorvida para o sangue atravs das clulas de revestimento do
estmago e do intestino delgado. Para uma substncia ser absorvida ela deve atravessar
facilmente a membrana celular. A passagem atravs da membrana celular determinada pela
polaridade da molcula: molculas inicas (carregadas) e molculas altamente polares passam
lentamente, enquanto aquelas neutras e hidrofbicas passam rapidamente. Como o pH do suco
gstrico cerca de 1 e o pH no intestino delgado, cerca de 6, pergunta-se:
a) Escreva por frmulas estruturais a ionizao reversvel da aspirina.
b) Onde a aspirina mais absorvida para a corrente sangunea, no estmago ou no intestino
delgado? Justifique claramente a sua escolha.
59
1. Muitas funes celulares que envolvem reaes endergnicas so efetuadas graas hidrlise
exergnica de ATP. Outras reaes endergnicas, como a sntese de cidos graxos e colesterol
e a fotossntese, requerem NADPH, que tem um grande poder redutor.
2. O grupo fosforila no carbono 2 de uma das unidades de ribose do NADPH o diferencia de NADH.
NADH oxidado pela cadeia respiratria para gerar ATP, enquanto que NADPH serve como um
doador de eltrons em reaes biossintticas redutoras.
C3 + C7
Transcetolase
C7 + C3
C4 + C6
Transaldolase
C5 + C4
C3 + C6
Transcetolase
6. O excesso de ribose-5-fosfato formado pela vias das pentoses pode ser completamente
convertido em intermedirios da via glicoltica.
60
8. A via percorrida pela glicose-6-fosfato depende da necessidade celular de NADPH + H+, ribose-5fosfato e ATP:
Quando muito mais ribose-5-fosfato requerida que NADPH + H+, a maior parte de
glicose-6-fosfato convertida a frutose-6-fostato e gliceraldedo-3-fosfato pela via
glicoltica, a transaldolase e a transcetolase convertem esses em ribose-3-fosfato.
Quando a necessidade de NADPH + H+ e ribose-5-fosfato esto balanceadas, a reao
predominante a formao de 2 NADPH e uma ribose-5-fosfato de glicose-6-fosfato pela
fase oxidativa da via das pentoses.
Quando muito mais NADPH + H+ requerido que ribose-5-fosfato, a glicose-6-fosfato
completamente oxidada a CO2, ou convertida a piruvato.
Grupo de discusso 15
1) Mostre a parte oxidativa do ciclo das pentoses com as equaes das reaes envolvidas,
indicando os agentes oxidantes e a origem do carbono presente no CO2 liberado.
2) Compare NADH e NADPH, indicando suas funes no metabolismo de carboidratos. Explique
porque a via da pentose-fosfato muito mais ativa no tecido adiposo que no msculo.
3) Quando h necessidade de NADPH, o ciclo das pentoses pode funcionar dando um resultado
lquido que equivale oxidao total de glicose a CO2. Explique este processo atravs das
respectivas reaes estequiometricamente equilibradas.
4) Ribose 5-fosfato pode ser obtida para a sntese de nucleotdeos atravs da via das pentoses, com
ou sem oxidao da glicose. Mostre como isso possvel com as respectivas equaes
qumicas.
4.) Explique como a via da pentosefosfato controlada, tendo em vista que grande parte das
reaes dessa via reversvel.
6) Compare as reaes catalisadas por transaldolases e transcetolases, indicando reagentes,
produtos e a natureza das reaes.
61
MDULO 16 E 17 FOTOSSNTESE
4. Os primeiros estudos de fotossntese realizados levaram concluso de que CO2 era a fonte do
O2 gerado na fotossntese. Em 1931, entretanto, demonstrou-se que bactrias fotossintetizantes
anaerbicas, sintetizam glicose a partir de CO2, sem gerar O2:
CO2 + 2 H2S luz (CH2O) + 2 S + H2O
luz
(CH2O) + H2O
7. Plantas e cianobactrias utilizam o poder redutor gerado pela oxidao de H2O dirigida pela luz
para produzir NADPH.
9. Quando iluminado, o FS II passa para uma forma excitada e perde eltrons, os quais so
transportados por reaes de xido-reduo para o fotossistema I. O PS I iluminado fornece
62
10. Os componentes envolvidos no transporte de eltrons de H2O para NADP+ com produo de
NAPDPH + H+ esto organizados em trs partculas, que esto ligadas a membrana tilacide: (1)
fotossistema II; (2) complexo do citocromo b6f; (3) fotossistema I (fotofosforilao no-ciclica).
11. Os cloroplastos geram ATP de maneira muito semelhante da mitocndria, ou seja, atravs do
acoplamento da dissipao de um gradiente de prtons sntese de ATP.
12. Na fotofosforilao cclica, os eltrons emitidos por P700 (PSI) so transferidos ao complexo
citocromo b6f, retornando finalmente a P700. No h sntese de NADPH + H+, nem liberao de
oxignio.
14. O ciclo de Calvin engloba duas fases: (1) a fase de produo, na qual 3 molculas de ribulose-5fosfato reagem com 3 molculas de CO2, gerando 6 molculas de gliceraldedo-3-fosfato, com o
gasto de 9 ATPs e 6 NADPH + H+; (2) a fase de recuperao, na qual os tomos de carbono de 5
gliceraldedo-3-fosfato entram em uma srie de reaes para dar origem a 3 ribulose-5-fosfato,
com as quais o ciclo recomea.
Grupo de discusso 16
63
4) Porque a descoberta da reao de Hill, em 1939, deu apoio hiptese anterior de Van Niel,
propondo que o O2 da fotossntese vem da gua?
5) Compare a fase clara da fotossntese com o processo de respirao na mitocndria, indicando
diferenas e semelhanas.
6) Sabe-se que a produo de O2 na fotossntese requer o funcionamento de dois fotossistemas.
Explique resumidamente como ocorre a interao entre os dois fotossistemas, incluindo doador
e receptor de eltrons no processo.
Grupo de discusso 17
14
tempo. Qual o significado dessa observao e como ele est relacionado com as reaes
luminosas da fotossntese? Por que cessa a converso de
14
tempo?
64
Gli 1-P
65
2 Pi
UDPG
Glicognion
Fosforilase
SintaseI
Glicognion+1
Pi
UDP
fcil notar que se estas enzimas funcionarem concomitantemente o ciclo ser FTIL, cujo
nico resultado lquido ser dissipao de energia atravs da reao:
UTP + H2O UDP + Pi
Conclui-se que, necessariamente, no hepatcito estas enzimas so coordenadamente
reguladas, isto , quando a fosforilase ativada para mobilizar glicose-1-P, a sintase
desativada, e vice-versa, conforme a necessidade celular.
9. Ambas fosforilase e sintase so reguladas por fosforilao (modificao covalente) em resduos
especficos de serina, reaes catalisadas pela mesma protena-quinase que possui dupla
especificidade, sendo por isso chamada de sintase-fosforilase quinase. A fosforilase e a sintase
so espcies fosforiladas, portanto a fosforilao, catalisada pela sintase-fosforilase quinase,
causa ativao da fosforilase e inativao da sintase.
10. A fosforilase a e a sintase I (formas ativas), por um lado, e a fosforilase b e a sintase D (formas
no ativas), por outro, so, respectivamente interconversveis. Para tanto necessrio que
fosforilase a e a sintase I sejam desfosforiladas, atravs de uma reao que requer catlise. A
principal enzima, catalisadora comum destas desfosforilaes, a fosfoprotena fosfatase 1.
11. A integrao metablica requerida pelo bom funcionamento do organismo faz com que as
interconverses coordenadas da fosforilase e sintase do glicognio no fgado, por fosforilao,
sejam controladas extracelularmente por hormnios especficos, principalmente: adrenalina,
glucagon e insulina.
12. As formas inativas fosforilase b e sintase D so intracelularmente estimuladas por fatores
alostricos
positivos,
por
razes
de
economia
interna
do
metabolismo
celular,
66
Grupo de discusso 18
67
68
mensageiro da ao hormonal, sendo cAMP o primeiro a ser descrito, e permitiu dar incio
progressiva compreenso dos mecanismos de ao do receptor de adrenalina. Devemos
lembrar que os primeiros mensageiros qumicos extracelulares so os hormnios. cAMP tem
efeito transiente e hidrolisada pela ao da fosfodiesterase. Na clula, o balano entre as
reaes de sntese (a) e degradao (b) regula a concentrao intracelular do cAMP.
a) ATP + H2O cAMP + 2 Pi; catalisada pela adenilato ciclase
b) cAMP + H2O AMP; catalisada pela fosfodiesterase.
7. A base da ao metablica do cAMP a ativao alostrica de uma quinase cujos substratos
so protenas, sendo conhecida como protena quinase dependente de cAMP, ou simplesmente
PKA (Protein Kinase dependent on cAMP). A PKA, uma vez ativada, catalisa a fosforilao
ativadora (modificao covalente) de uma cascata de protenas quinases que terminam na
fosforilao da fosforilase a e da sintase do glicognio, causando, respectivamente, a ativao e
a inativao dessas enzimas. O resultado final dessa seqncia de ativaes enzimticas, com
alternncia de regulao alostrica e modificao covalente, a fosforlise do glicognio
liberando glicose-1P, comandada por sinais hormonais extracelulares.
8. Os efeitos de ativao ou no da via dependem do receptor ativado, no caso dos receptores
adrenrgicos, os efeitos de 1 so mediados atravs dos ons clcio e e a ativao de 2 leva a
inibio da via de adenilato ciclase. H casos aonde a protena G do tipo Gs sendo ativadora
de adenilato ciclase e do tipo GR inibindo a adenilato ciclase. Algumas toxinas podem ativar ou
bloquear a via de transduo de sinal: toxina da clera e a toxina da coqueluche.
9. Dois hormnios so os principais responsveis pelo equilbrio da concentrao da glicose
circulante: glucagon e insulina.
10. O glucagon um hormnio que tem efeitos equivalentes aos da adrenalina no controle do
metabolismo do glicognio: possui um receptor da famlia dos receptores acoplados a protenaG e ativa a cascata que se inicia com cAMP/PKA. Este liberado em condies de hipoglicemia
ativando processos degradativos para manuteno da glicemia sangunea. A PKA (protena
quinase ativada por cAMP) fosforila a fosforilase quinase tornando-a ativa. A fosforilase quinase
fosforila agora glicognio fosforilase. A glicognio fosforilase ativada (quando fosforilada,
glicognio fosforilase b a) catalisa a hidrlise de resduos de glicose do glicognio liberando
grupos de glicose-1-fosfato. No mesmo tempo, a fosforilase quinase, ativada pela cascata do
receptor de glucagon-protena-G, cAMP/PKA, fosforila a glicognio sintase, a qual se torna
inativa quando fosforilada (sntase I sintase D).
11. A insulina tem efeito oposto, promove a absoro de glicose pelo fgado e msculos e usa
deposio nas reservas de glicognio. Mas importante notar que a insulina tem mecanismos
de ao totalmente diferentes da adrenalina e do glucagon. Os receptores de insulina no
pertencem famlia dos receptores acoplados a protena-G e no tm ao sobre a adenilato
ciclase. Seus receptores so do grupo de receptores cujo domnio intracelular apresenta
atividade intrnseca de protena-quinase de tirosina. A insulina estimula fosfoprotenas
69
70
Grupo de discusso 19
1) Os hormnios podem ser de natureza qumica muito diferente, por exemplo, adrenalina, uma
catecolamina, e glucagon, um peptdeo. Apesar disso, desencadeiam o mesmo processo
metablico no fgado, isto , mobilizao de glicose da reserva de glicognio. Se um hormnio
um sinal qumico, como possvel que substncias quimicamente to diferentes transmitam a
mesma sinalizao metablica para o hepatcito?
2) O sinal hormonal, por exemplo, da adrenalina no hepatcito, rapidamente decodificado e
amplificado numa cascata que alterna ativaes alostricas e reaes enzimticas. Mostre quais
so os fundamentos desse processo que garantem essa rapidez e amplificao.
3) As vias metablicas clssicas como, por exemplo, a gliclise e a via de biossntese de cidos
graxos, cuidam da grande massa do trabalho metablico, como, respectivamente, produo e
armazenamento de energia. H, no entanto, vias ou circuitos, quantitativamente insignificantes,
mas fundamentais, para o controle das vias metablicas massivas. Os circuitos, ou vias
regulatrias, acionados pelos hormnios pertencem a este grupo. Que circuito regulatrio
permite adrenalina promover a gliclise no msculo e a gliconeognese no fgado?
4) O nvel de glicose no sangue aps um perodo de jejum de aproximadamente 0,8 mg/ml (4
mM). Depois da ingesto de alimentos, o nvel de glicose passa a ser de aproximadamente 1,2
mg/ml (6 mM). Explique porque os nveis de glicose variam to pouco em situaes alimentares
to diferentes. Como esses nveis so controlados?
5)
6)
A concentrao de ATP na clula est em torno de 5 mM. A quantidade total de ATP pequena
e fonte primria de energia para o funcionamento celular. Por outro lado, o ATP tambm o
reagente que permite gerar cAMP, um dos mais importantes sinais qumicos intracelulares de
regulao metablica. Alm disso, cabe lembrar que todos os efeitos regulatrios do cAMP
decorrem da ativao da enzima quinase de protena dependente de cAMP, conhecida como
PKA. Tendo em conta todos estes fatos conhecidos, qual deve ser a ordem de grandeza da
constante de ativao (Ka, semelhante a Km) de PKA por cAMP? Justifique sua resposta.
71
72
Grupo de discusso 20
73
Grupo de discusso 21
1) CO2 e N2 existem na atmosfera e so fontes dos elementos C e N para os seres vivos. CO2
eficientemente fixado pelas plantas em geral atravs da fotossntese. N2 por outro lado, apesar
de extremamente abundante, 70 a 80% do ar, no fixado pela grande maioria das plantas, que
necessitam espcies reduzidas ou oxidadas de N2 para a sntese de compostos nitrogenados.
Somente algumas poucas formas de bactrias tm a capacidade de fixao de N2. Compare o
processo de fixao de CO2 com o de fixao de N2, e procure mostrar porque as plantas fixam
muito bem CO2, mas no N2.
2) Equacione a reao da nitrogenase e mostre aonde ocorre.
3) Qual a funo de compostos nitrogenados na respirao anaerbica? Descreva a respirao
anaerbica identificando doadores e aceptores de eltrons?
74
4) Certas bactrias oxidam NH3 a nitritos e nitratos, enquanto plantas e bactrias em geral reduzem
nitritos e nitratos a NH3. Qual a funo da reduo de nitritos e nitratos na vida desses
organismos?
5) Cianobactrias conseguem fazer fotossntese e fixao de nitrognio no mesmo tempo. Explique
como isso ocorre.
6) Compare as vias de assimilao de amnia em organismos ricos e deficientes em nitrognio.
75
MICROPIPETADORES
76
Fonte: http://www.analiticaweb.com.br/
77
I.
FUNDAMENTOS
A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento
78
I0
It
*
*
Absorbncia
*
*
*
Concentrao (mol/L)
79
II.
OBJETIVOS
1) Determinao da concentrao de uma protena em soluo aquosa por fotometria.
2) Determinao do espectro de absoro de luz de aminocidos e bases purnicas e
pirimidnicas.
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1)
1a)
0,5 mL de gua,
80
1,5 mL de gua,
comprimentos de onda 400, 420, 450, 470, 500, 520, 550, 580, 600, 630, 650, 680 e 700 nm. Usar a
soluo de biureto como branco (tubo 2).
Com isso, voc estar construindo a curva de absorbncia em funo do comprimento de
onda. Estabelecer qual o mx do produto da reao de biureto.
1b)
(protena padro) e a soluo de protena desconhecida. No tubo branco no dever ser adicionada
soluo de protena. A ordem de adio dos componentes da reao deve ser:
-
gua,
Tabela 1 Dados para a construo da curva padro para determinao de concentrao de protenas.
Padro de
tubos
albumina
(8mg/mL)
protena
desconhecida
gua destilada
reagente
concentrao
absorbncia (540
biureto
(mg/mL)
nm)
branco
1,5 mL
2,5 mL
0,1mL
1,4 mL
2,5 mL
0,2mL
1,3 mL
2,5 mL
0,4mL
1,1 mL
2,5 mL
0,7mL
0,8 mL
2,5 mL
1,0mL
0,5 mL
2,5 mL
1,0 mL
0,5 mL
2,5 mL
amostra
desconhecida
81
2a) Determinao do mx
Pipetar 1 mL de cada soluo em uma cubeta de quartzo de espectrofotmetro:
-
2,0 mL
0,1 mL
1,9 mL
0,2 mL
1,8 mL
0,4 mL
1,6 mL
0,7 mL
1,3 mL
IV.
RELATRIO DE LABORATRIO 1
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, o relatrio deve incluir
82
428
3540
2730
470
4170
2290
a) Uma soluo de transferrina exibe uma absorbncia de 0,463 em 470 nm em uma clula de 1 cm.
Calcule a concentrao de transferrina em miligramas e a concentrao de ferro em microgramas
por mililitro.
b) Pouco tempo depois da adio de desferrioxamina (que dilui a amostra), absorbncia em 470 nm
foi de 0,424 e a absorbncia em 428 nm foi de 0,401. Calcule a frao de ferro na desferrioxamina.
Lembre-se de que a transferrina se liga a dois tomos de ferro, e a desferrioxamina se liga apenas a
um.
7.
coeficiente de absortividade molar de 313 M-1 cm-1 numa clula com 2 cm de caminho ptico.
83
I.
FUNDAMENTOS
Aminocidos
As unidades constituintes das protenas so os L--aminocidos. Como o prprio nome
indica, estes compostos apresentam pelo menos um grupo amino (-NH2) e um grupo carboxlico (COOH). Em conseqncia deste fato, ao serem dissolvidos em gua, os aminocidos apresentam
carter anfotrico, ou seja, comportam-se como cido e como base. Os grupos amina e carboxila
podem sofrer protonaes e desprotonaes reversveis, comportando-se como eletrlitos fracos.
Se os considerarmos em suas formas de cidos conjugados: -NH3+ e -COOH, veremos que cada um
deles apresentar um valor de pKa. Assim, um aminocido apresenta pelo menos dois valores de
pKa e dependendo da natureza ionizvel ou no do grupo R (radical) ligado ao carbono a, pode
ocorrer ou no um terceiro valor de pKa. Em pH 7,0 o amino grupo apresenta-se protonado (forma
cida) e o grupo carboxila desprotonado (forma bsica) (figura 1).
84
lquida ou gasosa, preenche os interstcios da fase estacionria e deve ser capaz de fluir atravs
desta. As fases mvel e estacionria devem ser escolhidas de forma que os compostos que sero
separados durante o processo cromatogrfico possuam um coeficiente de partio definido entre as
duas fases. Neste processo, vrios mecanismos de distribuio podem ser empregados: a
distribuio pode ser uma simples partio entre dois lquidos imiscveis; um equilbrio de adsoro
entre uma fase estacionria adsorvente e uma fase lquida mvel; ou um equilbrio de troca inica
entre uma fase estacionria trocadora de on e uma fase mvel constituda por uma soluo de um
eletrlito.
Cromatografia de aminocidos em papel
Neste protocolo emprega-se uma mistura de solventes que interagem com as fibras de
celulose no papel de formas diferentes. O deslocamento do soluto pode ser explicado da seguinte
forma: as fibras de celulose do papel possuem uma forte afinidade pela gua presente na mistura de
solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica. O papel, assim, pode ser visto como um
suporte inerte contendo uma fase estacionria aquosa (polar). Na medida em que o solvente flui
atravs de uma seo do papel contendo o soluto, uma partio deste composto ocorre entre a fase
mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa (polar). Desta forma, parte do soluto
deixa o papel e entra na fase mvel. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre
a fase mvel e a fase estacionria a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao ao papel
para um outro ponto localizado a alguma distncia do local de aplicao, no sentido do fluxo de
solvente. Aps o equilbrio do papel com o vapor de um solvente saturado com gua, o
desenvolvimento do solvente produz a separao (figura 2).
85
distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior. A Tabela I apresenta valores de RF de
alguns aminocidos nas condies descritas.
RF = distncia percorrida pelo aminocido no papel
distncia percorrida pela fase mvel
Atravs da cromatografia em papel identificaremos um aminocido desconhecido em comparao
com quatro outros conhecidos (denominados de aminocidos-padro). Com ajuda da Tabela II e dos
valores de pKa obtidos na titulao, confirmaremos a identidade do aminocido.
A solubilidade relativa dos aminocidos nestas duas fases pode ser mudada por alteraes
na polaridade do solvente, ou no pH da soluo, o qual ir alterar o estado inico dos aminocidos.
Sob um conjunto adequado de condies, ento, cada molcula de uma mistura ir se deslocar a
uma diferente velocidade sobre a fase estacionria e estar a uma distncia especfica de um do
ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente.
Devido ao fato dos aminocidos no absorverem luz no comprimento de onda visvel, eles
no podem ser vistos. Assim, algum mtodo deve ser usado aps a cromatografia para localiz-los.
A reao de ninhidrina usada para este propsito por que reage com grupamentos amino livres
produzindo um composto colorido (usualmente prpura) (figura 3). Diversos aminocidos, contudo,
produzem diversas tonalidades de cores com a ninhidrina, o que pode ajudar em sua identificao.
A reao da ninhidrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a reao da
ninhidrina com a tirosina produz uma colorao azul metlica.
86
II.
OBJETIVOS
1) Identificao de um aminocido atravs de seu RF, determinado pela tcnica de
cromatografia em papel.
2) a) Identificao de um aminocido atravs de seus pKas, determinados pela tcnica de
titulao.
b) Comparao da curva de titulao de um aminocido com a de um cido fraco
monoprtico.
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1)
Cromatografia em papel
Tomar uma folha (23 x 16 cm) de papel Whatman n 1 e fazer um trao a lpis ao longo do
comprimento maior a 2 cm da borda. Evitar tocar no papel durante toda a operao. Deixar uma
margem de 1,5cm de cada lado. Marcar seis pontos sobre essa linha que distem 4 cm um do outro e
numer-los a lpis de 1 a 6. As amostras devem ser aplicadas nos pontos numerados (3 uL) de tal
modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possvel.
Nos nmeros de 1 a 4 aplicar os padres e no nmero 6, a mistura de padres. A amostra
desconhecida aplicada no nmero 5.
Enrolar o papel de modo a transform-lo em um cilindro e prender as extremidades
superiores com clips.
Colocar 25 mL de solvente de Partridge (n-butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1), em uma
placa de Petri e mergulhar o cilindro de papel em seu interior de modo que este fique perfeitamente
na vertical. Evitar que o papel toque na parede da placa.
Cobrir o sistema com um bquer de 2 L e deixar o solvente migrar 10 cm.
Retirar o papel e marcar imediatamente a linha de frente do solvente.
Secar o papel na estufa.
Mergulhar em soluo 0,1% de ninhidrina em acetona e levar estufa (80C-100C) por
alguns minutos.
Delimitar com lpis as manchas que aparecem no papel.
Determinar o RF dos padres e do aminocido desconhecido e comparar com os dados
fornecidos na tabela 1, para sua identificao.
87
2)
Aminocido
RF
Aminocido
RF
Cys
0,08
Ala
0,38
Lys
0,14
Pro
0,43
His
0,20
Tyr
0,45
Arg
0,20
Trp
0,50
Asp
0,24
Met
0,55
Gly
0,26
Val
0,60
Ser
0,27
Phe
0,68
Glu
0,30
Ile
0,72
Thr
0,35
Leu
0,80
Titulao
Colocar 50 mL da soluo do aminocido (0,10 M) em pH 1,0 em um bquer e titular com
Aminocido
pKa
Aminocido
pKa
Glu
2,19
4,25
9,67
2,18
8,95
10,53
1,82
6,00
9,17
1,71
8,33
10,78
Thr
2,62
10,43
2,20
8,80
2,30
9,70
2,36
9,60
1,99
10,60
2,34
9,60
Lys
His
Cys
Asn
Ala
Leu
Pro
Gly
88
IV.
RELATRIO DE LABORATRIO 2
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, o relatrio deve incluir a
89
I.
FUNDAMENTOS
A Cintica Enzimtica estuda os mecanismos de reaes qumicas catalisadas por enzimas.
E + S
k1
k-1
ES
k2
E + P
Vmx . [S]
v =
Km + [S]
Na figura 2 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da
concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis e Menten.
Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso de velocidade
apresentada acima.
90
91
Vmx
Vmx / 2
Km
Figura 2 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima michaeliana.
C12H22O11 + H 2O
Sacarose
C 6H12O6 + C 6H12O6
Glicose
Frutose
A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs
da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reao
entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem
o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540
nm.
Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores formada, por
um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (mols) de
sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em mols de
sacarose hidrolisada por minuto.
Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido
possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie
em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter os tubos em gelo durante a
adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos,
92
com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C
para reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e
simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra.
A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de enzima
necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto.
II.
OBJETIVOS
Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de uma
reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os parmetros
cinticos e discutir seus valores e importncia.
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1)
(glicose 6 mM + frutose 6 mM), conforme indicado na tabela 1. Complete o volume em cada tubo
para 2,0 mL com tampo. Adicionar em seguida 2 mL do reagente DNS. As quantidades esto
indicadas na tabela 1.
Tabela 1 Curva padro da soluo redutora.
soluo padro
soluo
redutora (mL)
tampo (mL)
branco
2,0
2,0
0,2
1,8
2,0
0,4
1,6
2,0
0,6
1,4
2,0
0,8
1,2
2,0
1,0
1,0
2,0
tubos
reagente
DNS
(mL)
absorbncia
sacarose
(540 nm)
hidrolisada(mols)
0,000
0,00
93
2.
sacarose
tubos
5% em
tampo
(mL)
tampo
soluo
pH 4,77
enzima
(mL)
(mL)
branco
1,0
1,0
1,0
0,9
0,1
1,0
0,7
0,3
1,0
0,5
0,5
1,0
0,3
0,7
1,0
0,1
0,9
1,0
1,0
sacarose
Concentrao
Abs. 540
enzima (M)
nm
0,00
0,000
hidrolisada por
min. (mol/min)
0,00
94
sacarose
tubos
5% em
tampo
(mL)
tampo
soluo
pH 4,77
enzima
(mL)
(mL)
branco
1,0
1,0
0,05
1,45
0,5
0,1
1,4
0,5
0,3
1,2
0,5
0,5
1,0
0,5
0,7
0,8
0,5
1,0
0,5
0,5
sacarose
concentrao
Abs. 540
sacarose (M)
nm
0,000
hidrolisada por
min. (mol/min)
0,00
95
IV.
RELATRIO DE LABORATRIO 3
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, as seguintes questes
No item 2 do protocolo dito que, devido alcalinidade do reagente DNS, sua adio faz a
96
I.
FUNDAMENTOS
Mtodos de Purificao de Protenas
possvel purificar e isolar protenas utilizando-se princpios fsico-qumicos, que levam em
97
Solubilidade
mg/mL
pH
98
II.
OBJETIVOS
1) Precipitar as protenas totais de uma soluo de leite em p, utilizando os conceitos de
precipitao no pI.
2) Utilizar eletroforese em gel de poliacrilamida/SDS (SDS-PAGE) para separar as protenas
de diferentes amostras e estimar sua concentrao.
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1)
Precipitao no pI
Preparar uma srie de tubos de ensaio de acordo com a tabela 1
99
Tubo
1,0 mL
1,0 mL
cido Actico 50 mM
1,0 mL
1,0 mL
1,0 mL
6,7
5,7
4,7
3,7
2,7
Adicionar, a cada um dos tubos, uma alquota (5,0 mL) de soluo de leite em p desnatado
(5%, previamente centrifugado).
Agitar os tubos e aguardar 5 minutos
Separar alquotas de 1,0 mL, distribuir em tubos plsticos pequenos e centrifugar (5000 rpm,
5 minutos, temperatura ambiente). Descartar a fase sobrenadante e ressuspender o precipitado em
NaOH 0,1M (1,0 mL) (Observao: utilizar o mesmo procedimento mesmo para os tubos que
aparentemente no apresentam precipitado)
Aps a dissoluo total do precipitado, separar uma alquota da soluo obtida (10,0 L)
para SDS-PAGE.
2.
Albumina bovina a 4,0 mg/mL (5,0 L) (padro de peso molecular: 66,0 KDa)
Montar o aparato para eletroforese conforme figura 3 (o gel de eletroforese ser preparado
previamente de acordo com o apndice 1), adicionar na cuba o tampo de corrida at cobrir os
poos do gel para eletroforese.
100
Adicionar tampo de amostra (10 L) a cada uma das amostras, e aquecer (2 minutos,
100C) para desnaturar as protenas. Resfriar (gelo) e aplicar 15 L nos poos do gel para
eletroforese seguindo a ordem da tabela 2.
Tabela 2 Adio das amostras ao SDS-PAGE
poo n
Amostra
padro
Aplicar a tenso nos eletrodos do aparato de eletroforese (150 V) e aguardar (30 minutos)
at que o corante marcador (Azul de Bromofenol) se aproxime da base do gel
Interromper a eletroforese e mergulhar o gel em uma soluo de colorao: Coomassie Blue R
(0,25g) em metanol : cido actico : gua (45% : 10% : 45%). Aguardar (5-10 minutos)
Substituir a soluo de colorao pela soluo de descolorao: metanol : cido actico :
gua (45% : 10%: 45%) (15 minutos)
Verificar as protenas coradas, e estimar por comparao, a purificao da amostra.
IV.
RELATRIO DE LABORATRIO 4
Alm da apresentao e discusso dos dados obtidos no laboratrio, as seguintes questes
pH corresponde?
2.
leite em p? Compare com a frao total de leite em p utilizada para fazer a eletroforese. Houve
eficincia na separao dessa protena?
3.
A tabela abaixo mostra valores de pI para diferentes protenas, com seus respectivos valores de
peso molecular (em kDa). Observe a banda de protena purificada corada no gel de poliacrilamida e
a posio relativa ao padro de albumina bovina adicionado.
101
Protena
pI
Casena
4,7
20,0-23,0
Insulina
5,4
6,0
Colgeno
6,6
130,0
Hemoglobina
7,1
64,5
Citocromo c
10,6
13,0
Histona
10,8
12,0 a 20,0
De acordo com os valores de pI e de peso molecular, qual seria a protena purificada da soluo
de leite em p?
4.
purificao seria eficiente? Como a albumina bovina poderia ser detectada? E se houvesse
contaminao do leite em p com hemoglobina, esse mtodo de purificao seria eficiente?
Consulte os dados de pI e justifique sua resposta.
5. O que eletroforese? Qual a funo do gel de empilhamento? E do gel de separao (ou de
resoluo)? Observe os diferentes pHs das solues B e C (vide Apndice) utilizadas para fazer os
gis de resoluo e de empilhamento, respectivamente. Por que o gel de empilhamento e o gel de
resoluo possuem pHs diferentes? Porque h SDS no gel?
6. Conforme a figura abaixo, uma mistura de trs protenas cujos valores de pI so 4,0; 7,0 e 11,0 foi
submetida a eletroforese. Usando-se tampes de valores de pH = 4,0; 7,0 e 11,0 esquematizar as
posies relativas das trs protenas em cada tampo. Protenas de mesma carga correriam a
mesma distncia numa eletroforese? Existe alguma possibilidade de se separar protenas diferentes
s que de cargas iguais?
102
Normal
(-)
(+)
8. Uma protena com 40 kDa e outra com 90 kDa foram utilizadas como padro num gel de
poliacrilamida com SDS. A motilidade relativa foi de 0,92 e 0,54 respectivamente. Qual seria a
massa aparente de uma protena neste gel, com motilidade de 0,72.
9. Apesar de uma cromatografia em coluna de gel filtrao e uma eletroforese gel de poliacrilamida
usarem princpios fsicos semelhantes, porque ao separamos uma protena de 40 kDa e outra de 15
kDa a de maior peso a primeira a ser eluda da cromatografia e a de menor peso a que mais se
move na eletroforese do gel. Em que situaes voc usaria a cromatografia? E a eletroforese?
103
V.
APNDICE
Preparao do gel de acrilamida / SDS
Inicialmente montam-se as placas de vidro com os espaadores posicionados. Vedar o
espao entre as placas com agarose (1% aquecida em ebulio). Aguardar resfriamento.
PRECAUES: Acrilamida neurotxica quando no polimerizada. Utilize sempre luvas
descartveis para manipular solues contendo acrilamida. Evite inalar TEMED (mesmo diludo,
pode ser txico) e butanol.
Preparar a soluo para o gel de resoluo (de corrida):
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo (aplicando-a no espao entre as placas de
vidro com uma pipeta. Sero necessrios aproximadamente 4,0 mL de soluo. Aguardar a
polimerizao do gel (5 minutos). Ser necessrio deixar aproximadamente 1,0 cm de espao para
aplicar o gel de empilhamento
OBS: A soluo comea a polimerizar muito rapidamente, necessrio ateno e rapidez
para aplicar a soluo no aparato de eletroforese.
Preparar a soluo para o gel de empilhamento:
OBS: Adicionar o TEMED por ltimo, pois ele o agente polimerizante deste gel.
Utilizar a soluo imediatamente aps o preparo, aplicando-a sobre o gel de resoluo (deve
preencher um espao de cerca de 1 cm de altura). Colocar um pente plstico para formar os poos
onde as amostras sero aplicadas (de acordo com a demonstrao). Sero necessrios
aproximadamente 1,60 mL de soluo. Aguardar a polimerizao do gel (15 minutos)
104
105
106
I.
FUNDAMENTOS
Enzimas transaminases ou aminotransferases so importantes no metabolismo de
107
NH3+
R
O
COO-
C
COO-
-CETOCIDO
AMINOCIDO
O
C
NH3
H
CH2
HO
CH2
HO
+
N
H
H3C
CH2
+
N
H
H3C
Piridoxal-fosfato
Piridoxamino-fosfato
O
NH3+
-OOC
-OOC
CH2
CH2
GLUTAMATO
C
H
COO-
CH2
CH2
C
COO-
-CETOGLUTARATO
108
II.
OBJETIVOS
III.
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1)
2)
109
Incubar os dois tubos (reao e controle negativo) a 37C por 30 minutos. Em seguida,
inativar a reao em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar a 5000 rpm, 10 minutos
(centrfuga Eppendorf). Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e
fazer a cromatografia com os padres adequados.
3.
Cromatografia
Em um papel de filtro Whatman nmero 1 (10 cm X 20 cm) traar com um lpis uma linha
horizontal de 2,5 cm de altura a partir da origem (ponto de contato do papel com a soluo na cuba
de cromatografia). Marcar 7 pontos com 2,5 cm de distncia entre si.
Aplicar, com um capilar de vidro fino, sobre os pontos marcados, uma pequena alquota dos
padres de alanina, glutamato, piruvato, e -cetoglutarato, a mistura de reao, o branco (controle
negativo) e 2,4-dinitrofenil-hidrazina. Sobre os pontos onde foram aplicados os padres e as
amostras, adicionar 3 uL de 2,4-dinitrofenil-hidrazina.
O solvente utilizado para a cromatografia ser uma mistura de butanol/etanol/NH4OH 0,5 M
na proporo 70:20:30 (v/v).
Aps o solvente alcanar 1 cm do final do papel, secar o papel a 80C em estufa e marcar os
produtos coloridos formados. Revelar os aminocidos do cromatograma com a soluo de
ninhidrina, secando em seguida o papel. Marcar a posio das manchas que aparecerem.
IV.
RELATRIO DE LABORATRIO 5
O relatrio deve conter os resultados do procedimento experimental, com possveis
Procure nos livros a reao que ocorre entre a ninhidrina e os aminocidos e tambm qual a
110
a)
Explique a reao geral que leva a formao de aminas biognicas a partir de aminocidos.
b)
c)
d)
Crie uma hiptese de um defeito gentico que torne este aminocido em aminocido essencial.
e)
que a dopamina por si s no pode ser usada, pois no passa pela barreira hematoenceflica e
deste modo no pode chegar ao crebro).
4.
a)
Explique como glutamato age como neurotransmissor (transmitindo um sinal qumico que se
torna eltrico).
b)
Explique como glutamato pode ser removido da fenda sinptica, mencionando o tipo de
e)
5.
dois anos de idade foi levada ao hospital. Sua me indicou que ela vomitava freqentemente,
especialmente aps as refeies. O peso da criana e o seu desenvolvimento fsico eram abaixo do
normal. Seus cabelos, embora escuros, continham pores de cabelos brancos. Uma amostra de
urina tratada com cloreto frrico (FeCl3) apresentou uma cor verde caracterstica da presena do
cido fenilpirvico. A anlise quantitativa de amostras de urina apresentou os resultados mostrados
na tabela abaixo.
Substncia
Fenilalanina
Fenilpiruvato
Fenilactato
Paciente (mmol/L)
7,0
4,8
10,3
Normal (mmol/L)
0,01
0
0
a)
Sugira que enzima possa estar deficiente. Proponha um tratamento para esta condio.
b)
c)
d)
6.
111
Gatos, depois de jejum por uma noite, receberam uma nica refeio de uma dieta de aminocidos
completa sem arginina. Dentro de duas horas, os nveis de amnia sanguneos aumentaram de
nvel normal de 18 mg/l para 140 mg/l e os gatos apresentaram sintomas clnicos de intoxicao
pela amnia. Um gato morreu 4,5 horas depois de ingerir apenas 8 g da dieta. Um grupo controle
alimentado com a dieta completa de aminocidos ou com uma dieta de aminocidos ou com uma
dieta de aminocidos onde arginina foi substituda pela ornitina no apresentou nenhum sintoma
clnico anormal.
a)
b)
O que induziu o aumento dos nveis de amnia? Por que a ausncia de arginina levou
112