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FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE MEDICINA


VETERINARIA

GUA DE PRCTICA
INMUNOLOGA VETERINARIA

AUTOR: MSc. MV. Hugo Castillo Doloriert


2015 1B

INDICE

INTRODUCCIN

Prctica N1: Reconocimiento de rganos linfoides primarios y secundarios

Prctica N2: Aislamiento de clulas mononucleares de sangre perifrica

Prctica N3: Manipulacin y vas de inoculacin y sangra en conejos

11

Prctica N4: Preparacin de inculos inmunognicos en conejos

15

Prctica N5: Pruebas inmunolgicas de unin primaria

21

Prctica N6: Pruebas inmunolgicas de unin secundaria

26

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

31

INTRODUCCIN

La presente gua tiene como finalidad organizar de manera secuencial las diferentes
actividades prcticas a realizar durante el desarrollo del curso de inmunologa veterinaria.
Las prcticas en base a muestras biolgicas (aislamiento de PBMC, pruebas de unin
primaria y secundaria), animales de laboratorio (reconocimiento de rganos linfoides,
protocolo de inmunizacin), as como la exposicin de artculos cientficos de publicacin
reciente en revistas de impacto en el rea de la inmunologa veterinaria y comparada
complementarn la formacin del estudiante abarcando las temticas indicadas en el
silabo del curso.
Cada prctica est estructurada de la siguiente manera: Una introduccin general al
tema de la actividad, una lista de materiales a emplear, y los procedimientos a ejecutar
para el adecuado desarrollo de las diferentes tcnicas o mtodos. Al final de cada actividad
se encuentra un formato de informe de prctica as como un cuestionario con dos a cuatro
preguntas que tienen como objetivo reforzar los conceptos ms importantes brindados
durante la sesin, as como evaluar el criterio y el aprendizaje del alumno.
Los informes de las prcticas sern entregados de manera grupal, por mesa de
trabajo, a la semana siguiente de haber concluido cada actividad para su respectiva
calificacin por los docentes responsables del curso.

PRCTICA N 1: Reconocimiento de rganos linfoides primarios y secundarios

El sistema inmunitario comprende un conjunto de rganos y estructuras diversas en


cuanto a naturaleza, origen y funcin, localizados en lugares diferentes del organismo.
Funcionalmente, los rganos del sistema inmune se clasifican en primarios y secundarios.
Los primeros suministran el microambiente para la maduracin de los linfocitos, mientras
que los segundos se encargan de capturar el microorganismo o antgeno mediante clulas
presentadoras de antgeno, suministrando el entorno adecuado para que los linfocitos
interacten con l. Los distintos rganos linfoides estn interconectados por vasos
sanguneos y linfticos, de modo que se constituye un sistema entrelazado y bien
comunicado. El papel fundamental de los rganos del sistema inmune es intervenir en los
procesos frente a agentes extraos, memorizarlos para reconocerlos ante una segunda
posible infeccin o invasin, y adems retener su integridad preservando sus propias
estructuras.

I. Animales y materiales
Animales: Cobayos y pollos menores de 4 semanas de edad.

Recipiente de vidrio con tapa


Instrumental de diseccin
Bandeja para necropsia
Contenedor material cortante
Cloroformo
Alcohol / desinfectante
Algodn
Microscopio
Estereoscopio
Estereoscopio

II. Procedimiento
A) Procedimientos de extraccin de rganos linfoides en mamferos
1. Sacrificar al animal por sobredosificacin de cloroformo en campana.
2. Retirar al animal de la campana y colocarlo decbito dorsal.
3. Disecar la piel y observar la presencia de ganglios linfticos superficiales
4. Realizar una incisin abdominal central y proceder a la apertura del peritoneo.
5. Identificar el bazo y ganglios linfticos, relacionar la ubicacin anatmica con la
funcin.
6. Extraer los rganos linfoides y observarlos en el estereoscopio.
7. Desprender el intestino, abrir el lumen intestinal e identificar y disecar las placas
de Peyer.
8. Abrir la caja torcica e identificar el timo y los ganglios linfticos mediastnicos
9. Extraer los rganos linfoides con ayuda de unas pinzas y observarlos en el
estereoscopio.

B) Procedimientos de extraccin de rganos linfoides en aves


1. Sacrificar al animal por sobredosificacin de cloroformo en campana
2. Con tijeras haga un corte longitudinal a travs de la piel del cuello hacia la entrada
del trax para observar el timo.
3. Realizar una incisin abdominal central y proceder a la apertura del peritoneo.
4. Identificar el bazo y extraerlo para observarlo en el estereoscopio.
5. Diseccionar la porcin dorsal del recto para observar la bolsa de Fabricio, extraerla
y seccionarla para observar los lbulos
6. Desprender el intestino, e identificar el divertculo de Meckel, las placas de Peyer y
las tonsilas cecales.
7. Localizar e diseccionar la glndula de Harder situada en la conjuntiva del prpado
inferior del ave.
8. Extraer los rganos linfoides con ayuda de unas pinzas y observarlos en el
estereoscopio.

Figura 1.1. Ubicacin anatmica de los rganos linfoides en aves

C) Observacin de glbulos blancos en frotis de sangre (opcional)


1) Durante las necropsias de los cobayos y las aves, tome una gota de sangre de
cada especie y colquela en uno de los extremos de una lmina porta-objetos
2) Realice un frotis sanguneo con ayuda de otra lmina porta-objeto
3) Deje secar el frotis y cubra la lmina con el colorante Wright durante 2 minutos
y luego agregue el mismo volumen de solucin tampn y espere 5 minutos.
Enjuague
4) Observe los glbulos blancos o leucocitos al microscopio a 40X y 100X (con aceite
de inmersin)

D) Observacin y descripcin de cortes histolgicos de rganos linfoides


Observar al microscopio y describir las siguientes lminas histolgicas:

Timo

Bursa
Mdula sea
Ganglio linftico
Bazo
Placa de Peyer
6

III. Formato de Informe

Ttulo de la prctica:
Seccin:

Mesa:

Fecha:

Integrantes:

tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cules son las principales funciones de los rganos linfoides primarios
y secundarios
2. Qu son y cul es la importancia del divertculo de Meckel y la
glndula de Harder?
3. Grafique y seale los principales rganos linfoides observados en
mamferos
4. Tienen las aves ndulos linfticos? Ample.

PRCTICA N 2: Aislamiento y reconocimiento de clulas del sistema inmune

La primera etapa en el estudio de linfocitos u otras clulas mononucleares sanguneas es


su aislamiento para que sus propiedades puedan ser analizadas in vitro. Las clulas
mononucleares pueden ser fcilmente aisladas de sangre perifrica por centrifugacin en
un gradiente de densidad constituido por una mezcla de polmeros polisacridos (Ficoll).
Uno obtiene a la interfase una poblacin de clulas mononucleares separadas de glbulos
rojos y de las clulas polimorfonucleares (neutrfilos u eosinfilos principalmente). A la
poblacin celular obtenida se le conoce como clulas mononucleares de sangre perifrica,
comnmente abreviado como PBMC (peripheral blood mononuclear cells), y est incluye
a diferentes tipos celulares como los linfocitos T, linfocitos B, clulas natural killer,
monocitos y clulas dendrticas.

I. Materiales y equipos
Muestras de sangre
Tubos falcon x 15 50 ml
Micropipetas automticas
Puntas de 1000 ul
Histopaque
RPMI
Azul de tripn
Cmara de Neubauer
Centrfuga
Microspcopio

II. Procedimiento
1. Obtener muestras sanguneas con EDTA de animales o humanos
2. Transferir la muestra de sangre hacia un tubo de 15 ml y adicionar el mismo
volumen de RMPI.

3. En otro tubo de 15 ml adicionar 1/3 de histopaque (5 ml)


4. Luego adicionar muy lentamente e inclinando el tubo, 2/3 de la sangre diluida en
el primer paso (10 ml), sobre el histopaque.
5. Centrifugar a 1400 rpm (sin freno) durante 30 minutos
6. Recuperar el anillo de clulas blancas (Buffy coat) y transferirlos a otro tubo de 15
ml
7. Aforar a 15 ml con RPMI
8. Centrifugar a 900 rpm durante 10 minutos (primera vez)
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 15 ml de RPMI

ANTES DE LA CENTRIFUGACIN

DESPUS DE LA CENTRIFUGACIN

Plasma

Sangre diluida
(v/v)

Buffy coat (PBMC)

Histopaque
Histopaque

Eritrocitos y
granulocitos

Figura 2.1. Orden de los estratos formados despus de la centrifugacin con histopaque

10. Centrifugar a 900 rpm durante 10 minutos (segunda vez)


11. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 ml de RPMI.
12. Realizar el conteo de clulas viables y muertas en una cmara de Neubauer. Diluir
2X en azul de tripn (0.4%).

III. Formato de informe

Ttulo de la prctica:
Seccin:

Mesa:

Fecha:

Integrantes:

tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cul es el fundamento de la tcnica de aislamiento de PBMC
realizada en clase?
2. Describa brevemente una tcnica alternativa para el aislamiento de
leucocitos
3. Referencie un artculo cientfico en el que se emplee alguna tcnica
de aislamiento de leucocitos, e indique la razn de su utilizacin.

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PRCTICA N 3: Manipulacin y vas de inoculacin y sangra en conejos

Sin los animales de laboratorio, el conocimiento de las ciencias biolgicas no estara al


nivel que se encuentra hoy en da. Los animales de experimentacin, como los ratones y
conejos, han proporcionado modelos para la realizacin de diferentes investigaciones en
diferentes reas de las ciencias de la vida.
La inoculacin de sustancias es una prctica generalizada en la prctica veterinaria. En el
rea de la inmunologa las vacunaciones representan la prctica ms extendida, pero
tambin existen pruebas diagnsticas como la de reaccin de tuberculina o los test
alrgicos que demandan cierto conocimiento de las diferentes vas de inoculacin.
Asimismo, la toma de muestras sanguneas es un procedimiento de rutina en la mayor
parte de los laboratorios de inmunologa y en la prctica veterinaria en general, ya que a
travs de este procedimiento se obtienen clulas, fluidos y molculas tanto para la
investigacin como para el diagnstico.
La presente prctica tiene como objetivo conocer las diferentes vas de inoculacin y
sangra en conejos en congruencia con una apropiada manipulacin. Al finalizar la prctica
el alumno ser capaz de, sujetar y manipular correctamente los animales de laboratorio,
reconocer las diferentes vas de inoculacin en conejos e identificar los mtodos de sangra
ms frecuentes en la prctica inmunolgica veterinaria.

I. Animales y materiales
Animales: Conejas blancas de 3 kg.

Jeringas descartables de 1 y 3 ml.


Agujas de diferentes calibres (21, 23 y 25 G)
Contenedor para material punzocortante.
Promazil
Lidocaina 2% en jalea

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Termmetro y estetoscopio
Balanza romana
Gasa y algodn
Suero fisiolgico
Alcohol

II. Procedimiento
A) Sujecin de los conejos
Para proceder con la evaluacin clnica del animal, es necesario realizar una correcta
sujecin. Con la mano derecha sujetar tranquilamente al conejo de la parte trasera del
cuello, firme pero con suavidad, luego colocar la mano izquierda debajo de las ancas
del conejo para soportar su peso. Tambin se puede sujetar la piel de los hombros con
la mano izquierda y con la derecha sujetar al conejo de la piel del lomo. Nunca levantar
al animal de las orejas, ni cargarlo slo de los hombros, esto es muy doloroso para el
animal.

Figura 3.1. Izquierda: Sujecin del conejo por la nuca y ancas. Derecha: Sujecin del
conejo por el lomo con ambas manos *

____________________________________________________________________
12

* Extrado del libro Prcticas de inmunologa general y aplicada a veterinaria


B) Evaluacin clnica del animal
Conocida la correcta sujecin del conejo, se proceder a la evaluacin clnica del animal,
para lo cual se medirn las constantes fisiolgicas (temperatura, frecuencia cardiaca y
frecuencia respiratoria) y se examinar externamente al animal a fin de descartar algn
posible problema infeccioso y/o parasitario. Finalmente, con ayuda de una balanza se
registrar el peso del animal.

C) Sangra a partir de la oreja marginal


1. Tranquilizar al animal mediante el uso de acepromazina va intramuscular (0.5
1 mg/kg).
2. Esperar de 5 a 10 minutos para que el tranquilizante haga efecto
3. Aplicar clorhidrato de lidocana 2% en jalea sobre la oreja del conejo
4. Esperar 5 minutos para que el anestsico tpico haga efecto
5. Opcionalmente rasurar la piel sobre la vena marginal de ambas orejas
6. Desinfectar la zona con alcohol
7. Inducir la hemostasia de la vena e introducir suavemente una aguja 21G x 1.5
hasta que la sangre empiece a fluir
8. Realizar la colecta inmediatamente en un tubo con EDTA.

Figura 3.2. Obtencin


de muestra sangunea
a travs de la vena
marginal o arteria
auricular en el conejo

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III. Formato de informe


Ttulo de la prctica:
Seccin:

Mesa:

Fecha:

Integrantes:

tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Realice un esquema comparativo entre las vas de inoculacin IM, SC
e ID. Brinde 2 ejemplos de sustancias que son inoculadas por esas
vas.
2. Qu cantidad de volumen sanguneo se puede obtener de un
conejo adulto, y con qu frecuencia?
3. Cul es la diferencia entre suero y plasma sanguneo?

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PRCTICA N 4: Preparacin e inoculacin de inmungenos en conejos

El mtodo ms efectivo de iniciar la formacin de anticuerpos consiste en la inoculacin


de un inmungeno en los tejidos o en la sangre. La va oral resulta menos efectiva porque
la mayora de los antgenos son protenas o carbohidratos que se digieren en el tracto
gastrointestinal, sin embargo en algunos casos como en las vacunas orales contra la polio
o la salmonella resulta ser una buena va de inmunizacin. Adems en el caso de las
alergias alimentarias es evidente que esta va es la que sirve de ingreso a los alrgenos.
Los antgenos pueden ser tanto solubles o particulados de acuerdo con su tamao. El
poder inmunizante de los antgenos en solucin aumenta si persisten en los tejidos por
periodos prolongados, por ello cuando los antgenos solubles se administran como una
solucin homognea, son rpidamente absorbidos en la circulacin sangunea, donde
sern catabolizados y removidos. Slo una pequea parte del antgeno es atrapado por las
clulas presentadoras de antgenos, con la consecuente baja produccin de anticuerpos.
El mtodo ms comn para incrementar las respuestas inmunitarias frente a los antgenos
es la utilizacin de adyuvantes. Esta mejora en la inmunogenicidad que aportan los
adyuvantes a los antgenos se asocia con una prolongada presencia en los tejidos y una
estimulacin no especfica del sistema inmune. Uno de los adyuvante ms conocidos es el
adyuvante completo de Freund que consiste en una emulsin en aceite mineral, orgnico
con bacilos de Mycobacterium sp., muertos por calentamiento, o sin micobacterias, el cual
es conocido como el adyuvante incompleto de Freund. La preparacin completa estimula
notablemente la respuesta inmune, tanto celular como humoral, pero produce la
formacin de granulomas en el sitio de inyeccin por lo que no se utiliza en humanos y
debe vigilarse su uso en animales
La dosis mnima efectiva de un inmungeno depende de la va de administracin y del
adyuvante empleado. Asimismo, las dosis crecientes y consecutivas de inmungenos
generan una respuesta inmune que aumenta en amplia escala. Sin embargo es necesario
resaltar que las respuestas a estmulos idnticos pueden variar entre individuos. Las dosis
excesivas o submnimas del inmungeno tienden a inducir la ausencia de toda respuesta
inmune especfica, denominada tolerancia inmunolgica.
Los anticuerpos son producidos por las clulas plasmticas, las cuales derivan de la
activacin y diferenciacin de los linfocitos B estimulados directamente por el antgeno y
15

por los linfocitos T colaboradores. En una respuesta primaria, se estimulan a los linfocitos
vrgenes productores principalmente de Ig M, y ante una estimulacin ulterior se
estimularn a los linfocitos de memoria, lo cuales tras su diferenciacin en clulas
plasmticas producirn Ig G en mayor proporcin.
El periodo latente entre la inoculacin inicial del antgeno y la aparicin de anticuerpos
vara segn la va, la dosis, la naturaleza del antgeno y el tipo de adyuvante utilizado. En
la prctica, se pueden detectar anticuerpos entre los 3 y 14 das despus de la inoculacin,
registrndose entre el noveno y el dcimo da en promedio una tasa mxima de
produccin. Los sueros pueden ser enteros o purificados, y la concentracin de
inmunoglobulina especfica es valorada a travs de pruebas de reaccin primaria y
secundaria.
El objetivo de esta prctica es reforzar los conceptos de respuesta inmune primaria y
secundaria, adyuvantes, los cuales son la base de las vacunaciones, as como familiarizar
al estudiante con la sueroterapia.

I. Animales, materiales y equipos


Animales: Conejas blancas de 3 kg.
Cepas bacterianas
Formaldehido
Albmina srica bovina (ASB)
Adyuvante completo de Freund (ACF)
Adyuvante incompleto de Freund (AIF)
Jeringa de 20 ml
Jeringas de tuberculina
Agujas hipodrmicas 18G x 1.5
Placa Petri
Tubos eppendorf 2 ml
Alcohol y algodn
Suero fisiolgico
Vrtex
Balanza analtica

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II. Procedimientos
A) Preparacin de inmungenos
Albmina srica bovina (ASB).1. Disolver la ASB a razn de 50 mg en 2 ml de solucin salina fisiolgica.
2. Verter en una placa petri o en un tubo plstico, 2 ml del ASB disuelto y 2 ml de
adyuvante completo de Freund.
3. Con una jeringa de 20 ml y una aguja 18G x 1.5 proceder a cargar y descargar la
mezcla repetidas veces hasta obtener una solucin cremosa.
4. Confirmar que la emulsin ha sido completada colocando una gota de la suspensin
sobre un recipiente con agua. Si la gota no se diluye y flota o permanece intacta, la
emulsin estar lista para usarse, caso contrario repetir el paso 3.
5. Para preparar la emulsin con adyuvante incompleto de Freund repetir los mismos
pasos cambiando el adyuvante completo de Freund por el incompleto.

Componentes estructurales bacterianos.1. Como primer paso se puede elegir entre el procedimiento a o b.
a. Centrifugar un cultivo bacteriano en caldo a 6000 rpm x 10 minutos.
b. Realizar una suspensin antignica en solucin salina fisiolgica o agua
ultrapura a partir de cultivo bacteriano en placa, hasta alcanzar una
concentracin equivalente a 3 segn la escala de Mc Farland.
Posteriormente centrifugar la suspensin a 6000 rpm x 10 minutos.
2. Para ambos casos, descartar el sobrenadante y realizar 2 lavados (centrifugar y
decantar) consecutivos del sedimento con PBS.
3. Resuspender el sedimento en 2 ml de agua ultra pura
4. Lisar las bacterias obtenidas en el sedimento sometindolas a choque trmico
mediante cambios bruscos de temperaturas de - 80C a 100C (5 minutos en cada
temperatura). Repetir esta operacin de 3 4 veces.
5. Verter en una placa petri o en tubo plstico los 2 ml del lisado bacteriano y
mezclarlo con 2 ml de adyuvante completo de Freund.
6. Repetir los pasos 3, 4 y 5 del procedimiento A.

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Exotoxinas bacterianas.1. Centrifugar un cultivo en caldo de una especie bacteriana productora de exotoxinas
a 6000 rpm x 10 minutos.
2. Tomar 2 ml del sobrenadante, 0,2 ml de formol 40% y 2 ml de adyuvante completo
de freund y mezclarlas en una placa petri o en un tubo plstico
3. Repetir los pasos 3, 4 y 5 del protocolo Antgeno I (A).

B) Inoculacin de inmungenos
1. Inocular a los conejos la suspensin inmunognica emulsionada con adyuvante
completo de Freund o adyuvante saponina Quil A, por va intramuscular (0.25 ml)
subcutnea e intradrmica (0.05 - 0.1 ml, en 8 sitios diferentes sobre el dorso).
2. A los 14 das post inoculacin se aplicar, va intramuscular (0.25 ml) y subcutnea
(0.25 ml), la segunda dosis de inmunizacin de las mismas suspensiones
inmunognicas pero esta vez emulsionadas con adyuvante incompleto de Freund.
3. Opcionalmente, a los 7 das despus de la segunda dosis, se aplicar va
intramuscular la tercera y ltima dosis (0.25 ml) de inmunizacin de las mismas
suspensiones inmunognicas emulsionadas con adyuvante incompleto de Freund.
4. A los 7 das despus de la ltima inoculacin realizar una sangra del conejo por
puncin cardiaca con una jeringa con anticoagulante (EDTA) de 15 a 20 ml de
sangre. Como alternativa a la puncin cardiaca se puede obtener las muestras de
sangre a partir de la puncin de la vena marginal de la oreja. Ver las indicaciones
de mtodos de sangra en la prctica anterior.
5. Centrifugar la sangre obtenida a 5000 rpm por 10 minutos y posteriormente con
ayuda de una pipeta pasteur transferir el plasma obtenido a un tubo estril.
6. A partir del plasma obtenido se proceder purificar las gammaglobulinas para
posteriormente verificar la presencia de anticuerpos especficos mediante las
prueba de precipitacin y/o inmunodifusin doble en gel de agar.

Nota: Llevar un control minucioso de las dosis y vas de inoculacin de inmungenos,


das e intervalos entre inoculaciones, as como la alimentacin y limpieza de los animales
durante la experimentacin.

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Figura 4.1. Sitios anatmicos y ngulos referenciales para las inyecciones intramuscular,
subcutneo, endovenoso e intradrmica.

Figura 4.2. Vas de administracin y volmenes recomendados (ml/kg) en diferentes


especies animales.

____________________________________________________________________
* Extrado del libro Prcticas de inmunologa general y aplicada a veterinaria
19

III. Formato de informe


Ttulo de la prctica:
Seccin:

Mesa:

Fecha:

Integrantes:

Items a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cules son los efectos que los adyuvantes producen en el sistema
inmunitario?
2. Liste 5 adyuvantes empleados en vacunas de uso veterinario
3. Cules son las diferencias entre los anticuerpos policlonales y
monoclonales?

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PRCTICA N 5: Pruebas inmunolgicas de unin primaria

La inmunologa utiliza las tcnicas comunes a varios dominios de la biologa. Sin embargo,
las tcnicas ms especficas han sido desarrolladas a la iniciativa de inmunlogos y son
particularmente utilizados por estos ltimos. Estas tcnicas de inmunodiagnstico han
sido divididas clsicamente en pruebas de unin primaria, secundaria y terciaria. Las
pruebas de unin primaria miden o cuantifican la cantidad de inmunocomplejos (Ag-Ac) a
travs de radioistopos, fluorocromos o enzimas. En las pruebas de unin secundarias la
reaccin antgeno-anticuerpo va seguida de una segunda reaccin como la precipitacin o
la aglutinacin, perceptibles visualmente. Por ltimo, las pruebas de unin terciaria
evalan la capacidad de los anticuerpos de neutralizar la actividad biolgica de antgenos
como los virales o toxinas bacterianas.
Dentro de las pruebas de unin primaria ms importantes tenemos al ELISA,
radioinmunoanlisis, western blot, inmunofluorescencia, inmunohistoqumica, citometra
de flujo, inmunofiltracin, inmunocromatografa, entre otras. En la presente prctica se
conocern las tcnicas de inmunofluorescencia directa, as como pruebas de diagnstico
rpido de uso en la clnica veterinaria para la deteccin de antgenos o anticuerpos
especficos contra patgenos de importancia en peros y gatos.
El test SNAP, de laboratorios IDEXX, es una de las prueba rpidas ms empleadas en
veterinaria y se basa en la tecnologa de ELISA, lo que permite realizar anlisis de calidad
de una manera fcil y rpida sin tener que recurrir al anlisis de un laboratorio. Esta prueba
se basa en la bsqueda de antgenos y/o anticuerpos en diferentes medios: heces, sangre,
suero. Este mtodo es bsicamente referencial, por lo que se debe complementar el
resultado con pruebas adicionales y/o con los hallazgos a la evaluacin clnica.
El diagnstico de laboratorio de rabia est orientado hacia el examen del tejido nervioso
de animales muertos bajos sospecha de infeccin rbica. Para esto se examinan
conjuntamente el cerebro, cerebelo y Asta de Ammon o hipocampo, en busca de
antgenos del virus de la rabia. Estos antgenos son detectados a partir de improntas
mediante el empleo de anticuerpos especficos marcados con fluorocromos como el
isoticionato de fluorescena (FITC). Esta tcnica se conoce como inmunofluorescencia
directa (IFD).
El objetivo de la prctica es familiarizar al alumno con los mtodos de inmunodiagnstico
primario utilizados en medicina de animales de compaa.
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I. Materiales y equipos
Canine SNAP 4Dx (IDEXX)
Botella de 8 ml de conjugado anti-HW/AP/LY/EC:HRPO
Soporte de reactivos
Pipetas cuentagotas
Tubos de ensayos
Dispositivos SNAP
Suero canino positivo para Ehrlichia, Anaplasma o Borrelia
Micropipetas automticas y puntas para 10, 200 y 1000 ul
Impronta de cerebro positivo para rabia
Microscopio de inmunofluorescencia

II. Procedimiento
A) Kit para la deteccin de antgeno de Dirofilaria immitis, anticuerpos frente a
Anaplasma phagocytophilum Borrelia burgdorferi- Ehrlichia canis (SNAP 4Dx Canino)
1) Equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos
2) Con la pipeta del kit verter 3 gotas de muestra en un tubo de ensayo nuevo
3) Agregar 4 gotas de conjugado al tubo de ensayo sosteniendo la botella en posicin
vertical
4) Tapar el tubo de ensayo y mezclarlo a fondo invirtindolo entre 3 y 5 veces
5) Colocar el dispositivo sobre una superficie horizontal. Agregar todo el contenido
del tubo de ensayo en el pocillo de muestras (Ver figura abajo). La muestra fluir a
travs de la ventana de resultados, alcanzando el crculo de activacin en unos 30
60 segundos.
6) En cuanto la muestra aparezca en el crculo de activacin, presione con fuerza el
activador hasta que quede alineado con el cuerpo del dispositivo.
7) Leer los resultados del anlisis cuando hayan pasado 8 minutos. Ver el cuadro a
continuacin para la interpretacin de los datos.
22

Cuadro de referencia para la utilizacin y anlisis del tests:


Agentes transmitidos por vectores
Ag/Ac y Sensibilidad +
Especificidad
Detecta Anticuerpo contra:
- Anaplasma phagocytophilum
- Anaplasma platys
Sensibilidad: 99.1%
Especificidad: 100%

Cundo llevar a cabo el

Imgenes del

test

test positivo

3 6 semanas desde la
exposicin. Si el perro es
sintomtico y el test es
negativo,
confirmar
resultado con PCR (en fase
aguda todava no hay
anticuerpos)

Detecta Antgeno de:


- Dirofilaria immitis
Sensibilidad: 99.2%

5 7 meses tras la
exposicin

Especificidad: 100%
Detecta Anticuerpo contra:
- Borrelia burgdorferi
Sensibilidad: 98.8%

3-6 semanas
exposicin

tras

la

1-3 semanas
exposicin

tras

la

Especificidad: 100%
Detecta Anticuerpo contra:
- Ehrlichia canis
Sensibilidad: 96.2%
Especificidad: 100%

Fuente IDEXX

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Figura 5.1. Esquema de utilizacin del


dispositivo SNAP 4Dx. Inserto IDEXX

B) Diagnstico de rabia por la tcnica de inmunofluorescencia directa (IFD)


1) El primer paso cuando se realiza la IFD es la preparacin de lminas de impronta de
cerebro. Para realizar un examen completo deben evaluarse tres reas del cerebro:
Corteza cerebral, cerebelo e hipocampo o Asta de Ammon
2) Los cortes de tejido de cada una de las reas mencionadas se colocan sobre un
bajalengua o en papel filtro
3) Se efectan improntas sobre lminas portaobjetos de cada una de las reas
mencionadas. El exceso de tejido puede quitarse utilizando papel filtro.
4) Las lminas se secan al medio ambiente. Esto normalmente toma 30 minutos.
5) Despus de secar, las lminas son sumergidas en bastidores con acetona para fijar
la impronta durante 1-4 horas. La fijacin facilita la adherencia y la reaccin del
antgeno con el conjugado que posteriormente ser utilizado.
6) Aplicacin del conjugado especfico sobre las lminas fijadas. Luego son incubadas
en una cmara hmeda a 37C por 30 minutos para facilitar la reaccin inmune.
7) Lavado de las lminas con PBS para quitar el conjugado que no ha reaccionado.
Luego se enjuaga con agua destilada para eliminar los residuos de sal de PBS.
Proceder al montaje de las improntas usando lminas cubreobjetos y glicerina
fosfatada.
8) Las lminas se observan en con un microscopio de inmunofluorescencia en un
cuarto oscuro.
9) Si la muestra es positiva, el antgeno de la rabia aparecer coloreado de verde
luminoso bajo el microscopio fluorescente.
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III. Informe de la prctica


Ttulo de la prctica:
Seccin:

Mesa:

Fecha:

Integrantes:

tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cul es el fundamento de las pruebas de diagnstico rpido tipo SNAP?
2. En las pruebas serolgicas, qu es un anticuerpo secundario?
3. Grafique las diferentes etapas de la tcnica de IFD desarrollada en la
sesin
4. En la prueba de inmunofluorescencia, qu es un fluorocromo y para
que sirve?

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PRCTICA N 6: Pruebas inmunolgicas de unin secundaria

La reaccin antgeno anticuerpo constituye el fenmeno central del diagnstico


inmunolgico. En esta reaccin se distinguen dos fases, la primera consiste en la unin del
antgeno con el anticuerpo (la cual es reversible) y la segunda en las manifestaciones que
resultan de dicha unin (la cual es irreversible). Para estudiar la segunda fase de la reaccin
antgeno - anticuerpo se dispone de pruebas llamadas de reaccin secundaria.
Si el antgeno es soluble, el complejo antgeno-anticuerpo puede precipitar, pero si el
antgeno es particulado, el antgeno se aglutinar en forma de agregados al unirse al
anticuerpo; en otros casos, el complemento en presencia de complejo anticuerpoeritrocito provocar la hemlisis con la consiguiente liberacin de hemoglobina.
Dentro de las tcnicas de reaccin secundaria tenemos a la prueba de precipitacin,
inmunodifusin radial, inmunoelectroforesis, pruebas de aglutinacin, entre otras. En la
presente prctica desarrollaremos las pruebas de Rosa de Bengala, adems se realizar la
evaluacin de los sueros hiperinmunes obtenidos en prcticas anteriores mediante las
tcnicas de precipitacin capilar e inmunodifusin en gel de agar.
En breve, la prueba de Rosa de Bengala es una tcnica rpida para la deteccin de
anticuerpos anti-Brucella en suero bovino. La suspensin bacteriana es reactiva tanto con
anticuerpos IgG como IgM. La determinacin se efecta ensayando la suspensin
tamponada de Brucella coloreada con Rosa de Bengala (pH 3.6) frente a los sueros
problemas. La presencia o ausencia de aglutinacin visible es indicativa de la presencia o
ausencia de anticuerpos en las muestras ensayadas.
Por otro lado, la prueba de precipitacin capilar es una tcnica simple utilizada como un
test de precipitacin cualitativo en el diagnstico de enfermedades infecciosas, y la tcnica
de inmunodifusin doble es un mtodo que permite al antgeno y al anticuerpo difundirse
uno hacia otro a travs de un soporte agar, formando de esta manera una lnea de
precipitacin en la zona de equivalencia.

Estas pruebas sern empleadas para la

evaluacin de la seroconversin de anticuerpos en los conejos inmunizados en la prctica


N 4.
El objetivo de la presente prctica es familiarizar al estudiante con las diversas tcnicas de
reaccin secundarias, las cuales en su mayora son rpidas y de fcil implementacin, en
el diagnstico de enfermedades y valoracin de anticuerpos, as como reforzar los
conceptos de interaccin antgeno anticuerpo.
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I. Materiales
Antgeno Brucella abortus + Rosa de Bengala
Placa de vidrio para aglutinacin
Suero obtenido de bovinos positivos a Brucella abortus
Platos de inmunodifusin radial (IDR)
Sueros de referencia para kit IDR
Sueros de alpacas para la cuantificacin
Capilares
Lminas portaobjetos
Agar noble / Agarosa
Placas Petri
Pipetas automticas de 200 ul
Puntas de 200 ul

III. Procedimiento
A) Prueba de rosa de bengala (Brucella abortus)
1) Llevar las muestras de suero y de antgeno a temperatura ambiente (22 + 4C).
2) Colocar 25-30 l de cada muestra de suero en una baldosa blanca, placa esmaltada
o de plstico, o en una placa para aglutinacin.
3) Agitar suavemente la botella de antgeno, y colocar el mismo volumen de antgeno
prximo a la gota de suero.
4) Inmediatamente despus de aadir la ltima gota de antgeno en la placa, mezclar
cuidadosamente el suero y el antgeno hasta producir una zona circular u oval de
aproximadamente 2 cm de dimetro.
5) La mezcla se agita suavemente durante 4 minutos a temperatura ambiente en un
agitador circular o manualmente.
6) Comprobar la aglutinacin tan pronto como se completa el perodo de 4 minutos.
Cualquier reaccin visible se considera positiva.
7) Lectura:
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Reaccin negativa: Suspensin uniforme sin cambio visible alguno, tal como se
presenta en el control negativo.

Reaccin

positiva:

Aglutinacin

dbil

intensa,

fcilmente

visible

macroscpicamente.

Figura 6.1. Resultados positivos y


negativos a la prueba de Rosa de
Bengala en suero y plasma
sanguneo. Tomada de: Rev.
per. med. exp. salud pblica
v.24 n.4 Lima oct./dic. 2007

B) Tcnica de precipitacin capilar (A partir de los sueros de conejos inmunizados)


1) Equilibre a temperatura ambiente las muestras de suero y de suspensin antignica
2) Llene por capilaridad hasta la mitad de un tubo capilar con la muestra de suero
3) Complete la otra mitad del tubo capilar, llenando por capilaridad con la suspensin
antignica
4) Invierta varias veces el tubo capilar cuidadosamente, soportndolo en ambos
extremos con la yema de los dedos
5) Coloque el tubo capilar sobre un soporte de plastilina de tal manera que la
suspensin antignica quede sobre el suero conteniendo los anticuerpos
6) Repita los pasos 2 4 pero enfrentando al suero sanguneo y a la suspensin
antignica con el suero fisiolgico. Cada uno por separado
7) Incubar en la estufa durante una hora a 37C
8) Observar la precipitacin que se har evidente por la aparicin de pequeos
precipitados blanquecinos en los tubos capilares donde se enfrentaron los
antgenos con los anticuerpos

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C) Inmunodifusin doble (A partir de los sueros de conejos inmunizados)


1. Disolver mediante calentamiento 1 gr de agar noble, en 100 ml de solucin tampn
fosfato pH 7.4, 0.15 M.
2. Sobre una lmina portaobjeto aada 5 ml de agar noble. Dejar que se gelifique
3. Forme los pocillos sobre agar empleando un sacabocado
4. Llene el pocillo central con la muestra de suero conteniendo los anticuerpos
5. Llene los pocillos de alrededor con diferentes suspensiones antignicas
6. Incube a temperatura ambiente por 24 horas
7. Realice la lectura observando las bandas de precipitacin y determinando la
ausencia o presencia total o parcial de identidad de los antgenos evaluados.

Figura 6.2. Evaluacin de identidad inmunoqumica en la inmunodifusin doble o de Ouchterlony.

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III. Informe de la prctica


Ttulo de la prctica:
Seccin:

Mesa:

Fecha:

Integrantes:

tems a desarrollar:
Introduccin (Breve marco terico)
Metodologa
Resultados y discusin
Conclusiones
Referencias bibliogrficas (Estilo Vancouver)
Cuestionario:
1. Cul es la diferencia entre una precipitacin y una aglutinacin?
2. Qu es el fenmeno de prozona?
3. Cules son las principales ventajas y desventajas de la prueba Rosa de
Bengala en el diagnstico de brucelosis?

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Alzamora L, Colona E, Galvn P, Aliaga M. Manual de prcticas de inmunoserologa.


Facultad de ciencias biolgicas. UNMSM, Lima Per, 2007.
2. Arce AY, Rosas AG, Rodrguez LE. Prcticas de inmunologa general aplicada y
veterinaria. Manual Moderno; Mxico, 2007.
3. Crdova F, Estrada-Parra S. Fundamentos de inmunologa e inmunoqumica. Serie
de biologa. Monografa N 11. Programa Regional Cientfico y Tecnolgico del
Departamento de Asuntos Cientficos de la OEA. Mxico, 1973.
4. Gmez-Luca E, Blanco M, Domnech A. Manual de Inmunologa Veterinaria.
Pearson Prentice Hall; Madrid, 2007.
5. Martinez, A, Ortega, J. Manual de laboratorio de inmunologia bsica y clnica Libro
electrnico. Suplemento de REDVET. 2011
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n040411/041108.pdf
6. Mouquet H. Les techniques en immunologie. Fiche technique N 1. Universit Sidi
Mohammed Ben Abdellah. Marruecos.
http://www.fmp-usmba.ac.ma/umvf/UMVFmiroir/campus-numeriques/campusimmunologie/www.assim.refer.org/techniq.pdf
7. Sam R, Manchego A. Gua de Prcticas del curso Inmunologa veterinaria.
Laboratorio de Microbiologa y Parasitologa Veterinaria. UNMSM, Lima Per,
2009.
8. Tizard I. Inmunologa veterinaria. 8va edicin. Editorial Interamericana Mac GrawHill; Espaa, 2009.
9. Universidad de Buenos Aires (UBA) Gua de talleres y trabajos prcticos de
inmunologa veterinaria. Argentina, 2008.

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