Test Primers

Quando arrivano dei nuovi primers o dei nuovi campioni si esegue una curva standard.
Si prepara una diluizione seriale di un campione(un controllo) con 5 diluizioni: 1:1,
1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000. Si prepara poi una PCR eseguendo, per ciascuno dei
primers da controllare o per ciascuno dei geni, la reazione in triplo per ciascuna
diluizione. I valori cos ottenuti sono messi in un foglio excel e con essi si calcola una
retta(con R2 il pi vicino possibile a 1) per ciascuna delle diluizioni. Quando si faranno
poi le PCR con i campioni, le rette dei campioni non dovranno mai incrociare le rette
dello standard, senn vuol dire che c qualcosa che non va nei primers. Bisogna fare
una nuova retta di standard ogni volta che si cambiano le condizioni
dellesperimento(primers, cellule, animali, geni, trattamenti, ecc).

RT-PCR
Preparazione Mix(tutto in ghiaccio):
-

5 l Taqman
0,5 l Primers (Fw+Rev)
27 l per campione)
3,5 l Acqua

Totale 9 l per eppendorf da PCR(in triplo, quindi

In primo luogo si prepara 1 Eppendorf da 1,5 ml per ciascun gene (normalmente 2:

18s come housekeeping e 1 gene di interesse) considerando un paio di campioni in pi
di quelli effettivi, per evitare di rimanere senza materiale( normalmente si hanno 6
campioni in triplo per 18 totali, approssimato a 20). Questa Mix viene divisa in 1
Ependorf da 1,5 ml separata per ciascun campione (27 l per Eppendorf) a cui va
aggiunto 1 l di cDNA per ciascuna eppendorf da PCR (ogni campione va preparato in
triplo, quindi 3 l di cDNA per campione per arrivare ad un volume totale di 30 l).
Quando poi va trasferito tutto nelle 3 eppendorf da PCR si trasferiscono 9,5 l invece
di 10, per essere sicuri di avere abbastanza materiale. Dai valori che verranno poi dati
dalla PCR si otterr una retta per ciascun campione, con i 3 valori(con R 2 il pi vicino
possibile a 1); questa non deve incrociare la retta degli standard.
Per le successive PCR verr quindi normalizzato il risultato della real time direttamente
sulla standard ottenuta la prima volta, senza doverla rifare.