CAPTULO 2.1.

18

TULAREMIA

RESUMEN
La tularemia es una zoonosis causada por Francisella tularensis. La bacteria causal es un
cocobacilo Gram negativo, de 0,20,5 m 0,71,0 m, inmvil y que no forma endosporas,
aerobio estricto y con una temperatura ptima de crecimiento de 37C. Es oxidasa negativa,
catalasa dbilmente positiva y requiere cistena para su cultivo. Se encuentra de manera natural en
los lagomorfos (conejos y liebres) y en los roedores, especialmente en los roedores microtinos
(tales como los ratones y ratas de campo y las ratas almizcladas) y los castores. Asimismo, se ha
descrito que se pueden infectar una amplia gama de mamferos y diversas especies de aves. Entre
los animales domsticos, parece que los gatos pueden actuar como transmisores de la bacteria.
Se reconocen dos tipos de F. tularensis teniendo en cuenta las caractersticas de cultivo,
epidemiolgicas y de virulencia en algunos hospedadores. La tularemia est muy confinada al
Hemisferio norte y normalmente no se encuentra en los trpicos o el Hemisferio sur. Francisella
tularensis subsp. tularensis (Tipo A) se asocia a los lagomorfos en Norteamrica. Se transmite
principalmente mediante las garrapatas y las moscas picadoras, es muy virulenta para el hombre y
los conejos domsticos, y la mayora de los aislamientos fermentan el glicerol. Francisella
tularensis subs. palaearctica (Tipo B) aparece sobre todo en los roedores acuticos (castores,
ratas almizcladas) del norte de Norteamrica, y en las liebres y los pequeos roedores de Eurasia.
Se puede transmitir mediante artrpodos o por el agua, es menos virulenta para el hombre y los
roedores, y no fermenta el glicerol. Adems de la transmisin por vectores, la tularemia se puede
propagar mediante el contacto con los animales infectados o fomites ambientales a travs de la
inhalacin, o por la ingestin de carnes poco cocidas de animales infectados o agua contaminada.
La enfermedad se caracteriza por fiebre, depresin y septicemia. En el hombre, puede producir
lceras o abscesos en el lugar de la inoculacin (raramente se observa en los animales), e
inflamacin de los ganglios linfticos regionales. En el examen post mrtem, entre las lesiones
puede haber necrosis caseosa de los ganglios linfticos y mltiples focos de necrosis blancogriscea en el bazo, hgado, mdula sea y pulmones. Habitualmente produce esplecnomegalia.
Es importante tener en cuenta que existe un riesgo elevado de infeccin directa del hombre por
contacto directo con el microorganismo. Por lo tanto, se recomienda que, para manipular los
materiales infectados, se tomen precauciones especiales como llevar guantes, mascarilla y
protectores oculares. La instalacin debera cumplir los requisitos de Contencin del Grupo 3 de
patgenos (vase el captulo 1.1.2. Bioproteccin y seguridad humana en los laboratorios
veterinarios de microbiologa y en las instalaciones de los animales).
Identificacin del agente: Se puede demostrar la presencia de la bacteria mediante impresin o
en muestras fijadas de los rganos, tales como el hgado, el bazo, la mdula sea, el rin o el
pulmn, as como en los frotis de sangre. Los mtodos inmunolgicos, como la prueba de
inmunofluorescencia (FAT), son la forma ms fiable para identificar la bacteria. Cuando se realiza
una tincin Gram, la bacteria aparece como bacilos Gram negativos muy pequeos y puntiformes,
que con frecuencia son difciles de distinguir como bacterias. Tambin se pueden teir con la
tincin MayGrunwaldGiemsa y con tionina fenlica.
El microorganismo presenta unos requisitos nutricionales complejos. Para cultivarlo, es necesario
utilizar el medio Francis, el medio McCoy y Chapin o el agar Thayer-Martin modificado. Las
colonias son pequeas, redondas y transparentes y no se aprecian antes de 48 horas de
incubacin a 37C. En el medio Francis, las colonias pueden confluir y presentar un aspecto
lechoso. Si se necesita transportar las muestras, se deberan inocular en caldo nutritivo estril y

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conservar a 410C si se trata de unas pocas horas o a 70C si es probable que se prolongue el
tiempo de transporte.
Para facilitar el diagnstico de la tularemia, se utilizaron en el pasado cobayas como animales de
experimentacin, inoculndoles material procedente de tejidos infectados o de cultivos. Para
identificar F. tularensis, se ha remplazado la inoculacin de los animales por los protocolos de la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La prueba FAT permite demostrar la presencia de F.
tularensis en muestras patolgicas.
Pruebas serolgicas: Las pruebas serolgicas son herramientas tiles en el diagnstico de la
infeccin humana, pero tienen un valor limitado en las especies animales ms susceptibles que,
normalmente, mueren antes de desarrollar anticuerpos. Las determinaciones epidemiolgicas se
pueden realizar con animales domsticos, pero de especies relativamente resistentes, que
sobreviven a la infeccin, tales como ovejas, vacas, cerdos, perros o ungulados salvajes, debido a
que estas especies desarrollan anticuerpos. Se pueden emplear as mismo, especies de roedores
y lagomorfos de resistencia relativa. En los ensayos serolgicos se pueden utilizar varias especies
de vida salvaje, como el alce americano, que estn expuestas a F. tularensis.
Requisitos para las vacunas y el material de diagnstico: Se dispone de una cepa viva
atenuada para vacunar a las personas que tengan un riesgo elevado de exposicin a F. tularensis
virulenta. Sin embargo, esta vacuna solo tiene una aplicacin restringida. Se puede estimar el
resultado de la vacunacin demostrando la presencia de anticuerpos especficos y la capacidad de
proliferacin de los linfocitos en presencia del antgeno de F. tularensis.

A. INTRODUCCIN
La tularemia es una zoonosis causada por Francisella tularensis. Se encuentra de forma natural en los
lagomorfos (conejos y liebres), especialmente en los roedores microtinos como los ratones de campo, las ratas
de campo y las ratas almizcladas, as como en los castores. Adems, se ha descrito que se pueden infectar una
amplia gama de otros mamferos, aves, anfibios e invertebrados (19, 20). La tularemia se presenta de forma
endmica en el Hemisferio norte. La enfermedad puede ocurrir como brotes epizoticos en muchos pases de
Norteamrica y Europa, mientras que nicamente se presenta en casos espordicos en algunos otros pases de
Europa y Asia. En raras ocasiones se ha descrito su presencia en los trpicos o en el Hemisferio sur. Algunos
brotes epizoticos han surgido como resultado de la importacin de lagomorfos infectados con una manifestacin
subclnica.
Se reconocen los dos tipos de F. tularensis ms relevantes desde el punto de vista clnico teniendo en cuenta las
caractersticas de cultivo, epidemiolgicas y de virulencia. Francisella tularensis subesp. tularensis (Tipo A) se
relaciona sobre todo con los lagomorfos en Norteamrica. Se transmite fundamentalmente por las garrapatas o
las moscas picadoras, o mediante el contacto directo con los lagomorfos infectados. Es muy virulenta para el
hombre y los conejos domsticos, y la mayor parte de los aislamientos fermenta el glicerol. Francisella tularensis
subesp. palaearctica (Tipo B) se presenta principalmente en los roedores acuticos (castores, ratas almizcladas)
y ratones de campo en Norteamrica, y en los lagomorfos (liebres) y roedores en Eurasia. Se transmite
fundamentalmente por contacto directo o por mosquitos, pero se puede transmitir por inhalacin o a travs de
agua o comida infectada. Es menos virulenta para el hombre y los conejos domsticos, y no fermenta el glicerol
(7, 14,15, 17, 22).
En animales susceptibles, a los sntomas de depresin grave les sigue una septicemia mortal. En estas especies
el curso de la enfermedad es aproximadamente de 210 das y es habitual que estos animales estn ya muertos
cuando se les vaya a realizar el diagnstico. Normalmente, la mayora de las especies domsticas no manifiestan
signos de tularemia, pero, despus de la infeccin, desarrollan anticuerpos especficos frente al microorganismo.
Han surgido brotes en las ovejas con niveles elevados de mortalidad causados por el organismo del Tipo A (1,
17). Se ha informado de que, entre los animales domsticos, los gatos pueden actuar como transmisores de la
bacteria (46) y la enfermedad se extiende ocasionalmente desde los gatos a los humanos (8).
En la necropsia, los animales que mueren por la tularemia aguda habitualmente se encuentran habitualmente en
buena condicin fsica. Se presentan signos de septicemia caracterizada por focos blanquecinos de necrosis
distribuidos al azar en el hgado, la mdula sea y el bazo. Adems, suele haber esplecnomegalia. Los focos
necrticos varan en tamao y, en algunos casos, puede que apenas se vean a simple vista. Normalmente los
pulmones estn congestivos y edematosos y pueden aparecer reas de consolidacin y neumona fibrinosa y
pleuritis. La fibrina puede estar presente en la cavidad abdominal. Con frecuencia existen focos de necrosis
caseosa en uno o varios ganglios linfticos. Los ganglios linfticos que ms a menudo estn afectados son los de
las cavidades abdominal y pleural y los que drenan las extremidades. En las especies menos susceptibles, la

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imagen histolgica puede parecerse a la de la tuberculosis con granulomas crnicos en el hgado, el bazo, los
pulmones y los riones.
Existe un riesgo elevado de infeccin humana por F. tularensis, ya que la dosis infectiva es extremadamente baja
y los animales infectados eliminan la bacteria a travs de la orina y las heces. La infeccin puede producirse por
un simple contacto. Para evitar la infeccin humana deben tomarse las debidas precauciones, tales como llevar
guantes, mascarilla y protectores oculares, durante la manipulacin de las muestras y los cultivos patolgicos. La
instalacin debera cumplir los requisitos de Contencin del Grupo 3 de patgenos como se recoge en el captulo
1.1.2 Bioprooteccin y seguridad humana en los laboratorios veterinarios de microbiologa y en las instalaciones
de los animales. Los pases que carezcan de este tipo de laboratorios especializados, bien sea regionales o
nacionales, deberan enviar las muestras al laboratorio de referencia de la OIE. Los animales utilizados para la
inoculacin experimental y sus residuos son especialmente peligrosos para el hombre.

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.

Identificacin del agente

La presencia de Francisella tularensis se puede demostrar mediante frotis o cortes histolgicos. Asimismo, se
puede identificar mediante el cultivo o la inoculacin de los animales. Sin embargo, F. tularensis puede resultar
difcil de aislar a partir de los animales muertos o de las canales debido al desarrollo de otras bacterias. Como el
aspecto post mrtem es variable, en ocasiones el diagnstico no resulta fcil y se prefieren los mtodos
inmunolgicos o inmunohistoqumicos, aunque sea difcil obtener los reactivos. Por tanto, a veces se recomienda
que las muestras fijadas se analicen en laboratorios equipados con los reactivos y mtodos apropiados, tales
como el laboratorio de referencia de la OIE (vase la parte 3 de este Manual de animales terrestres).

a)

Frotis
Las preparaciones se realizan en portas y consisten en impresiones de rganos tales como el hgado, bazo,
mdula sea, rin, pulmn o sangre. Las bacterias son abundantes en tales frotis, pero pueden pasar por
alto debido a su tamao muy pequeo (0,20,7 m). Se puede demostrar la presencia de la bacteria
mediante la inmunofluorescencia directa o indirecta. Esta es una herramienta de diagnstico segura, rpida
y especfica (13, 16, 18).
La tincin Gram de los frotis revela una dispersin de bacterias Gram negativas pequeas y puntiformes,
cerca del lmite de resolucin. La utilizacin del microscopio con el objetivo de inmersin en aceite
incrementa la capacidad de resolucin de la bacteria. Puede ser difcil distinguirla de los precipitados de
colorante.

b)

Cortes histolgicos
Se puede demostrar la presencia de la bacteria a travs de cortes empleando mtodos
inmunohistoqumicos, tales como una prueba de inmunofluorescencia (FAT) (16). Normalmente se realiza la
prueba con muestras de hgado, bazo o mdula sea, fijadas con formalina tamponada neutra e incluidas
en parafina. Los portas se tratan con suero de conejo anti-tularemia, se lavan y posteriormente se tratan con
suero de oveja anti-conejo conjugado a isotiocianato de fluorescena. Las muestras se examinan con un
microscopio de florescencia. En las lesiones necrticas y en la sangre se pueden observar grandes
cantidades de bacterias.

c)

Cultivo
Francisella tularensis no crece en los medios convencionales, aunque en ocasiones algunas cepas pueden,
durante el aislamiento inicial, crecer en agar sangre. La incubacin se realiza a 37C a temperatura
ambiente o 5% de CO2. Para el cultivo se debera utilizar sangre de corazn, hgado, bazo o mdula sea
procedente de animales moribundos. Es necesario emplear medios de cultivo especiales, tales como:
i)

Medio Francis: Agar peptona que contiene cistena al 0,1% y glucosa al 1%, al que se le aade, antes
de solidificar, sangre desfibrinada humana o de conejo o caballo al 810%.

ii)

Medio McCoy y Chapin: Este medio consiste en 60 g de yema de huevo y 40 ml de solucin salina
normal, cuidadosamente mezclada y coagulada por calor a 75C.

iii)

Agar modificado de ThayerMartin: Medio base de agar glucosa cistena (GCA) suplementado con
hemoglobina e Iso VitaleX.

Los medios se pueden conservar hasta 810 das a 4C. Las colonias que forma en medio McCoy son
pequeas, prominentes, redondas y transparentes. Se obtiene un desarrollo superior en el medio Francis y

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en el agar modificado de ThayerMartin, en los que las colonias confluyen y muestran una apariencia
lechosa y una consistencia mucoide. En cualquiera de los medios, las colonias no se apreciarn hasta
transcurridas 48 horas de incubacin a 37C.
iv)

Agar GCA con tiamina (BBL): Cuando se le aade sangre, el medio se denomina comnmente GBCA
y se puede sustituir por el medio original no comercial descrito por Down et al. (5). Se suspenden 58 g
de material seco en 1 litro de agua destilada o desmineralizada y se mezcla a fondo. Se calienta con
agitacin frecuente y se hierve durante 1 minuto. Se distribuye en tubos y se esteriliza en autoclave a
118121C durante 15 minutos.

Para volmenes mayores (hasta de varios litros) de medio de cultivo, se autoclava a las mismas
temperaturas, pero durante 30 minutos. Se enfra hasta 4548C. Manteniendo condiciones aspticas, se le
aaden 25 ml de clulas sanguneas concentradas o 50 ml de sangre de oveja o conejo desfibrinada. Se
mezcla a fondo y se vierte en placas. Se incuban a 37C durante 24 horas antes de utilizar con el fin de
reducir la humedad de la superficie y comprobar que estn estriles (5).
Se puede emplear el siguiente medio selectivo adems de medios no selectivos: Agar corazn cistena
(DIFCO) con sangre de conejo al 5%, y penicilina (100.000 unidades), polimixina B sulfato
(100.000 unidades), y cicloheximida (0, 1 ml de una solucin base al 1%) por litro.
Entre los criterios diferenciales para la identificacin de F. tularensis cabe destacar la ausencia de
crecimiento en los medios convencionales, la morfologa celular distintiva y las reacciones de aglutinacin
en porta e inmunofluorescentes especficas. Las bacterias son inmviles, no esporuladas, con tincin bipolar
y de apariencia uniforme en los cultivos de 24 horas, pero pleomrficas en los cultivos de ms tiempo de
incubacin.
Francisella tularensis se puede identificar mediante frotis teidos, mediante aglutinacin con antisuero
hiperinmune a la tularemia o inoculacin en animales. En las zonas de Norteamrica en las que pueden
existir ambos tipos de F. tularensis, el Tipo A se puede diferenciar del Tipo B por el hecho de que la mayor
parte de las bacterias adscritas al Tipo A fermentan el glicerol.
La bacteria tambin se puede identificar mediante ensayos de hibridacin con sondas especficas que
hibridan con el ARNr 16S de F. tularensis, F. tularensis Tipo A, y F. tularensis Tipo B (10), o mediante la
reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) con cebadores diseados para complementar regiones
especficas de las molculas del ADNr 16S. El ensayo de PCR permitir la identificacin a nivel de gnero,
especie y subespecie (11).

d)

Prueba de la precipitacin en tubo capilar de muestras patolgicas

Los tejidos, tales como el bazo, hgado o mdula sea, se cubren con arena estril en una cantidad de tres
a cinco veces su volumen de solucin salina normal. Se transfiere la suspensin a un tubo y se aaden dos
volmenes de ter etlico. Despus de agitar, la mezcla, esta se deja esttica durante 45 horas a
temperatura ambiente. Se agita de nuevo y a continuacin se deja esttica toda la noche.
Se extrae la fase acuosa y se centrifuga a 2.000 g durante 30 minutos. El sobrenadante, que contiene el
antgeno, se extrae y distribuye en tubos capilares a los que se les aade un antisuero anti-tularemia.
Los tubos se incuban a 37C durante 3 horas, y posteriormente se mantienen a 4C toda la noche. La
formacin de un anillo de precipitado indicar un resultado positivo.

e)

Inoculacin de animales
La inoculacin de animales es extremadamente peligrosa y slo se recomienda para la identificacin del
agente en los casos en los que el cultivo sea negativo y la identificacin del agente se necesita por razones
de tipo epidemiolgico. nicamente se debera establecer donde se disponga de jaulas e instalaciones de
bioseguridad apropiadas (vase el captulo 1.1.2). Para la identificacin de F. tularensis , deben utilizarse
pruebas de PCR.
Los animales de laboratorio (preferiblemente ratones) se inoculan con material de cultivo para confirmar la
naturaleza del aislamiento. Se pueden inocular las muestras patolgicas para la deteccin directa de
F. tularensis. Habitualmente los ratones inoculados mueren antes de que se puedan formar las lesiones.
La inyeccin Intraperitoneal es suficiente para los pases de cultivos puros. En los ratones todas las vas de
administracin, tales como la subcutnea, la percutnea o la intravenosa, conducirn a la infeccin, que es
invariablemente mortal en unos 210 das.

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f)

Tcnicas moleculares
En los ltimos aos se ha elaborado la PCR como un excelente mtodo de identificacin de F. tularensis y
se ha evaluado su utilidad para detectar F. tularensis en ejemplares de las heridas de los humanos
afectados por tularemia (12).
Se ha demostrado que la PCR en tiempo real es una prueba muy sensible y especfica, que ha supuesto un
gran avance en el diagnstico, dado que el resto de las pruebas utilizadas en la identificacin especfica de
F. tularensis subesp. tularensis requieren mucho ms tiempo para su aplicacin (23).
Tambin se ha elaborado un chip de ADN con el que se pueden identificar y diferenciar cepas de la
subespecie de virulencia moderada F. tularensis subesp. tularensis (3).

2.

Pruebas serolgicas

En la actualidad se llevan a cabo pruebas serolgicas para realizar el diagnstico de la tularemia en el hombre,
pero son de valor limitado en las especies animales susceptibles, que suelen morir antes de poder producir
anticuerpos especficos. Las pruebas serolgicas se pueden emplear, tanto en sueros como en extractos de
pulmn (18), en los estudios epidemiolgicos de animales que son resistentes a la infeccin, tales como las
ovejas, las vacas, los cerdos, los ratones, los perros o las aves (18, 20). Al no existir diferencias antignicas entre
el Tipo A y el Tipo B, se podra utilizar la bacteria menos virulenta F. tularensis palaearctica como antgeno en
todas las pruebas serolgicas.

a)

Aglutinacin en tubo
La prueba serolgica que ms se utiliza es la de aglutinacin en tubo. El antgeno consiste en un cultivo de
F. tularensis en medio Francis. Las clulas del cultivo se recogen tras 56 das de incubacin. Los cultivos
ms jvenes producen un antgeno ms pobre. Las colonias se suspenden en alcohol al 96%, con lo que se
consigue una suspensin que se puede conservar durante 17 das a temperatura ambiente. El sedimento
se lava con solucin salina normal y se resuspende en un volumen igual de solucin salina normal. Se
aade cristal violeta en polvo hasta una concentracin final de 0,25%. Las bacterias se tien con el cristal
violeta y se incuban a 37C durante al menos 24 horas y, como mucho, 7 das.
Despus de eliminar el sobrenadante, el sedimento se suspende en solucin salina normal con o sin
timerosal (mertiolato) a una concentracin final de 1/10.000, o formaldehdo a una concentracin final de
0,5%. La suspensin se calibra con sueros positivos y negativos, y se ajusta con solucin salina hasta
conseguir un antgeno, que cuando se ensaye en un porta, produzca reacciones de aglutinacin teidas,
fcilmente visibles, contrastndolas con un fondo lquido claro.
La prueba se realiza en tubos que contienen una cantidad fija de antgeno (0,9 ml) y diferentes diluciones de
suero comenzando con 1/10, 1/20, 1/40, etc. Los resultados se leen despus de 20 minutos de agitacin, o
despus de 1 hora en un bao Mara a 37C y a continuacin se deja toda la noche a temperatura
ambiente. El sedimento aglutinado se puede ver a simple vista o, preferiblemente, con una lupa manual. Los
tubos positivos son aquellos que muestran un sobrenadante claro. Hay que tener en cuenta posibles
reacciones cruzadas con Brucella abortus, B. melitensis y Legionella sp.

b)

Enzimoinmunoensayo
Otra prueba serolgica, el enzimoinmunoensayo (ELISA), tambin permite un diagnstico precoz de la
tularemia (4). Esta tcnica se emplea mucho hoy en da con fines clnicos. Se utilizan diferentes antgenos,
bacterias enteras y componentes subcelulares (9), como los antgenos de refuerzo contra las
inmunoglobulinas IgA, IgM y IgG; 2 semanas despus del inicio de la tularemia, se pueden detectar
anticuerpos especficos en el suero. La IgM se mantiene durante un largo periodo de tiempo y no se puede
utilizar como indicativo de una infeccin reciente (2). Para el diagnstico rutinario, se puede emplear como
antgeno la bacteria inactivada por calor (65C durante 30 minutos). La bacteria se puede utilizar para cubrir
placas de plstico, utilizando los procedimientos usuales (4) y posteriormente se aade la dilucin seriada
del suero que se va a probar. Las reacciones positivas se pueden visualizar mediante anti-anticuerpos
marcados con un enzima. Asimismo, la prueba se debera leer en un fotmetro, utilizando como controles
sueros positivos y negativos.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y EL MATERIAL DE DIAGNSTICO

Se han preparado vacunas con la intencin de proteger al hombre, pero como sucede en cualquier otro
desarrollo de vacunas, la realizacin de ensayos con animales, implica que alguna de las vacunas se podra

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utilizar para proteger a los animales. No obstante, en la mayora de los pases no existe una vacuna autorizada
para su uso en los animales. Tampoco est disponible en el mercado ninguna vacuna contra la turalemia.
Antes de 1940, los intentos por desarrollar una vacuna contra la tularemia se llevaron a cabo utilizando bacterias
enteras muertas o extractos bacterianos. Ninguna de estas vacunas indujo una proteccin frente a las cepas ms
virulentas de F. tularensis. Mejores resultados tuvieron las vacunas vivas atenuadas. La atenuacin se consigui
mediante el pase de cultivos de la bacteria a travs de diversos medios con o sin antisuero. Estas vacunas vivas
atenuadas se han utilizado en las vacunaciones en masa de personas en la antigua Unin Sovitica desde 1946,
bien como monocultivos o bien en forma de mezcla de cepas.
Se dispone de una vacuna viva atenuada de la cepa de F. tularensis, biovariedad palaearctica para la vacunacin
restringida de individuos con un riesgo elevado de exposicin a la bacteria (21).

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23. TOMASO H., SCHOLZ H.C., NEUBAUER H., DAHOUK A.L., SEIBOLD E., LANDT O., FORSMAN M.& SPLETTSTOESSER
W.D. (2007). Real-time PCR using hybridization probes for the rapid specific identification of Francisella
tularenis subspecies tularensis. Mol. Cell. Probes, 21 (1), 1216.

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NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la tularemia (vase el cuadro en la parte 3 de este Manual
de animales terrestres o consltese la lista ms actualizada en la pgina web de la OIE: www.oie.int).

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2008