Universidad Andrs Bello

Facultad de Ciencias de la Salud

Departamento de Ciencias Biolgicas
Laboratorio de Biologa Celular BIO 035

Trabajo prctico N6:

Fraccionamiento subcelular

Alumnos:
Fabin Escobar.
Luis Alarcn.
Alondra Barraza.
Catalina Negri.
Seccin:
3
Profesores:
Agustina Undabarrena
Fernanda
Rodriguez

Introduccin

Hace millones de aos se generaron las clulas, las cuales son la unidad principal de los
seres vivos y se encuentran tanto como clula procarionte (bacterias) y eucariontes (seres
humanos, animales, etc.) estas estn presentes tanto en animales (clula animal) y plantas
(clula vegetal) y adems est compuesta por diferentes organelos, los cuales cumples
variadas funciones (1). En primer lugar est la membrana plasmtica encargada de darle
proteccin a la clula y adems regular lo que ingresa y sale de esta y la pared celular
(presente solo en la clula de tipo vegetal) encargada de darle proteccin a esta ltima. En
el interior de la clula nos encontramos con los siguientes organelos: Mitocondria,
encargada de la reserva energtica, produccin de ATP y la respiracin celular, Cloroplasto
(presente nicamente en clulas vegetales), encargado del proceso de fotosntesis,
Lisosoma, cuya funcin es la digestin celular, Peroxisoma, responsabilizado de la
decodificacin celular, Aparato de Golgi, encargado del movimiento celular, tanto de los
organelos en si como de la clula completa, Ncleo, el cual lleva en su interior la
informacin gentica o DNA, Retculo Endoplasmatico liso encargado de la sntesis de
lpidos, el Retculo Endoplasmatico Rugoso, responsable de la sntesis de protenas y los
ribosomas, encargados de la traduccin de sntesis de protenas. (2)
Para lograr el estudio de un organelo en especfico de la clula, existen diferentes mtodos,
es decir, procesos para separar sus componentes, aislarlos y de esta forma estudiarlos para
comprender su funcionamiento. Para realizar algunas de estas tcnicas de separacin se
utiliza la centrifuga, la cual consiste en un sistema de rotores con cavidades para colocar los
tubos que contienen la muestra y hacerlos girar a diferentes velocidades para finalmente
lograr la separacin. Uno de los procesos ms utilizados es el fraccionamiento celular. Este
ltimo consiste en 2 etapas, la primera consiste en homogeneizar la muestra, a travs de
procesos como el shock osmtico o el simple rompimiento de las clulas en
homogeneizadores mecnicos. Estas ltimas que han sido homogenizadas reciben el
nombre de lisados. El resto de los componentes contina intacto (3). La segunda etapa
consiste en una serie de centrifugaciones, realizada con la centrifuga antes mencionada, a
diferentes velocidades, y en cada una de estas se obtienen 2 porciones, el pellet, el cual
queda depositado en el fondo, y el sobrenadante que queda por encima (4). Este ltimo es
re-utilizada para las centrifugaciones posteriores para as poder ir obteniendo el resto de los
componentes celulares.
Para la identificacin ms clara de los organelos, se utilizan marcadores subcelulares como
como el DNA y enzima, las cuales son marcadores de la presencia de ncleos y
mitocondrias respectivamente. Estos marcadores pueden ser identificados con colorantes,
los cuales, se unen a ella cuando esta ionizada, como por ejemplo: el azul de tripan, azul de
toluidina, etc. (5)
Dado la siguiente, se ha planteado la siguiente interrogante: Este mtodo es efectivo para
poder visualizar claramente los organelos por separado?

Objetivos:

1. Aprender el uso correcto del mtodo de fraccionamiento celular

2. Identificar los organelos mediante el uso de marcadores subcelulares

Materiales y Mtodos.
Actividad N1: Fraccionamiento subcelular
Fraccionamiento Subcelular del Hgado:
Se tom un trozo de hgado de pollo frio de 10 gramos aprox., para luego picarlo en trozos
pequeos, utilizando una tijera (trituracin). Dichos trozos se colocaron en un tubo de 15
ml, en el cual le echaron un buffer, en este caso NaCl al 0,9% de suero fisiolgico, con el
fin de sacar el exceso de sangre. sta muestra se llev al Ultraturrax, el cual busca romper
a nivel celular la membrana plasmtica, por lo que quedan sus organelos suspendidos en el
buffer. sta muestra estuvo 5 minutos expuesto a las diferentes capacidades del
Ultraturrax, en una cubeta de hielo a 4 C aproximadamente, ya que, se minimiza la
activacin de dao generado por fosfolipasas y proteasas. La muestra se lleva a un proceso
llamado fraccionamiento, el cual consiste en colocar la muestra en tubos Falcon de
polipropileno para centrifugar, previo a esto, se filtr la muestra utilizando una gasa
dispuesta
en
un
embudo
de
vidrio
para
luego
rotularlos.
Para este proceso de fraccionamiento, se llev el tubo Falcon a la centrifuga, dejndolo por
10 minutos a 2500 RPM (revoluciones por minutos). Finalizado este tiempo se sac el
tubo, en el cual se observaron dos fracciones de sustancias diferentes y retirndose 1 ml de
sobrenadante; el pellet, en la parte inferior del tubo, y el sobrenadante en la parte superior.
Obtenindose as la fraccin nuclear en el sedimento y la mitocondrial en el sobrenadante.
Consiguientemente se re suspende en otro tubo Falcon el sobrenadante correspondiente al
ml retirado con la ayuda de una pipeta, para una posterior centrifugacin, pero por 5 min a
13000 RPM. En este proceso el sedimento corresponde a la fraccin mitocondrial y el
sobrenadante a la porcin restante de material subcelular.
Evaluacin del Fraccionamiento Subcelular mediante marcadores moleculares:
Se dispuso del Pellet 1 ms 5 ml de suero fisiolgico, se mezcl el contenido y se aplic
1 gota de sta muestra expuesta a tincin de azul de tripn en un portaobjeto con el
correspondiente cubre objeto, y se llev al microscopio a un objetivo 40X. Luego se realiz
el mismo procedimiento y mtodo con la muestra que contena el sobrenadante de Pellet
2 para ser observada en microscopio bajo tincin de azul de tripn.
Finalmente se dispuso de 5 tubos de ensayo los cuales fueron rotulados de la siguiente
manera: Pellet 1, pellet 2, sobrenadante 1, sobrenadante 2, homogenizado crudo
los cuales contenan las muestras correspondientes, a los cuales se le aplico 1 ml de
succinato 0,1 M, 1 ml de azul de metileno, 1 ml de agua destilada y 1 ml de vaselina liquida
(a modo de aislar la muestra del oxgeno). En ltimo lugar los tubos de ensayo fueron
dispuestos en una gradilla metlica apta para la exposicin de un bao termorregulador a
una temperatura aprox. de 37C por un tiempo cronometrado de 30 minutos para observar
la correspondiente reaccin.

Resultados.
Actividad n1:
a)
Muestra.

Pellet 1 (Fraccin Nuclear).

Tincin.

Azul de Tripn.

Aumento Total.

400x.
Se
logra observar subestructuras
celulares esfricas azuladas que segn el
procedimiento realizado pertenecen al
ncleo celular.

Observacin.

b)
Muestra.

Pellet 2 (Fraccin Mitocondrial).

Tincin.

Azul de Tripn.

Aumento Total.

400x.
Se
logra
observar
subestructuras
celulares esfricas azuladas las cuales
segn el procedimiento realizado debera
ser una mezcla rica en membrana
plasmtica,
mitocondrias
y
otros
organelos, aunque, no se puede ser
determinante y se requiere.

Observacin.

Actividad n2:
Resultados iniciales obtenidos sin ser colocados en bao termorregulador.

Tubo

Cantida
d
de
Agua
Muestr Succinat Azul de destila
a
o 0,1 M Metileno da

Resultado
Colorimtrico
Inicial

Homogenizad
o crudo
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Sobrenadante
1
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Calipso opaco

1 ml

1 ml

1 ml

Calipso traslucido

Pellet 1
1 ml
Sobrenadante
2
1 ml

Turquesa
Verde esmeralda

Pellet 2

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Celeste traslucido

Resultados obtenidos luego de colocar las muestras en el bao termorregulador a 37C.

Tubo

Cantida
d
de
Agua
Muestr Succinat Azul de destila
a
o 0,1 M Metileno da

Homogenizad
o crudo
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Sobrenadante
1
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Pellet 1

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Sobrenadante
2
1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Pellet 2

1 ml

1 ml

1 ml

1 ml

Resultado
Colorimtrico Final
Verde agua muy
claro
y
poco
traslucido.
Verde esmeralda.
No se registran
cambios
Color
medio
verdoso con restos
de pellet en fondo
de
coloracin
rojiza clara.
Calipso traslucido.
No se registran
cambios
Celeste traslucido.
No se registran
cambios.

Conclusin.
Podemos concluir en primer lugar que la utilizacin de mtodos como el fraccionamiento
celular permite determinar la presencia de organelos especficos, en conjunto con el uso de
marcadores moleculares los cuales determinan tal presencia mediante tinciones o la accin
enzimtica que caracteriza a estas molculas debido a su especificidad, siendo as, que en
consecuencia se puede determinar no solo la presencia sino que tambin la funcin de los
ya determinados organelos. Finalmente podemos decir que la interrogante planteada es
respondida de manera positiva, ya que, aunque no se puede ser altamente especifico si se
pueden diferenciar organelos mediante los mtodos utilizados.

Bibliografa:
1. Alberts - Bray - Hopkin - Johnson - Lewis - Raff - Roberts - Walter, Introduccin a
la biologa celular, 2011, panamericana, 2da edicin, Mxico, pg. 1
2. Alberts - Bray - Hopkin - Johnson - Lewis - Raff - Roberts - Walter, Introduccin a
la biologa celular, 2011, panamericana, 2da edicin, Mexica, pg. 16 25
3. Universidad Andrs Bello, Gua de laboratorio n5:Organizacin Subcelular, curso
Bio035, Laboratorio Biologa Celular, 2015
4. Universidad Andrs Bello, Gua de laboratorio n5:Organizacin Subcelular, curso
Bio035, Laboratorio Biologa Celular, 2015
5. Universidad Andrs Bello, Gua de laboratorio n5:Organizacin Subcelular, curso
Bio035, Laboratorio Biologa Celular, 2015
6. Universidad Andrs Bello, Gua de laboratorio n5:Organizacin Subcelular, curso
Bio035, Laboratorio Biologa Celular, 2015
7.