B.

TITULACION DE LA ALANINA
1. Disociación del grupo carboxilo:
La curva de titulación de un aminoácido puede ser analizada de la misma manera
descrita para el ácido acético. Por
ejemplo considere a la alanina, la cual contiene ambos, un grupo carboxilo y un
grupo amino. A un pH bajo (ácido ), ambos de
estos grupos son protonados (ver figura 1.9 en el libro ). A medida que el pH de la
solución se eleva el grupo COOH de la
forma I puede disociarse donando un protón al medio. La liberación de un protón
lleva a la formación de un grupo
carboxilato, COO-. Ésta estructura es mostrada como forma II la cual es la forma
dipolar de la molécula. Ver figura en el libro
2.9. (nota: esta forma es también llamada un zwitterion y esta forma es la forma de
la alanina esto es que tiene una carga neta
de 0 ).
2. Aplicación de la ecuación de Henderson-Hasselbalch:
La constante de disociación de un grupo carboxilo es llamada K1, no Ka, porque la
molécula contiene un segundo grupo
titulable. La ecuación de Henderson-Hasselbalch puede ser usada para analizar la
disociación del grupo carboxilo de la
alanina de igual manera como se describió para el ácido acético.
K1= [H+] [II]
[I]
donde I (ver figura 1.9 en el libro) es la forma totalmente protonada de la alanina, y
II es la forma isoeléctrica de la alanina.
Esta ecuación puede ser reorganizada a:
pH = pK1 + log [II]
[I]
3. Disociación del grupo amino:
El segundo grupo titulable de la alanina es el grupo amino ( -NH3 ) .Ver libro figura
1.9. este en un ácido mucho más
débil que el grupo COOH y por tanto tiene una constante de disociación más
pequeña (K2). Nota: su pKa es, por tanto, más
grande. La liberación de un protón a partir de un grupo amino protonado de la
forma II resulta en la forma totalmente
deprotonada de la alanina, la cual es la forma III. Ver figura 1.9 del libro.
4. pKs de la alanina:
Las disociaciones secuenciales de protones a partir de los grupos amino y carboxilo
de la alanina están resumidos en la
figura 1.9. Cada uno de los grupos titulables tiene un pKa que es numéricamente
igual al pH al cual exactamente la mitad de
los protones han sido removidos de ese grupo. El pKa para el grupo más ácido
COOH es el pK1, el pKa para el grupo
siguiente más ácido (NH3+) es el pK2.
5. Curva de titulación de la alanina:
Aplicando la ecuación de Henderson Hasselbalch a cada grupo ácido disociable, es
posible calcular la curva de titulación
completa del ácido débil. La figura 1.10 (ver libro) muestra el cambio en el pH que
ocurre durante la adición de una base a la
forma totalmente protonada de la alanina (I) para producir la forma completamente
deprotonada (III). Note lo siguiente:
a. par buffer: el par COOH/COO- puede servir como un buffer en la región de pH
cerca del pK1 y el par NH3+/NH2
puede amortiguar en la región cerca del pK2.
b. Cuando el pH es igual al pK: cuando el pH es igual al pK1 (2.3) iguales cantidades
de las formas I y II de la alanina existen
en la solución. Cuando el pH es igual al pK2 (9.1), iguales cantidades de las formas II
y III están presentes en la solución.
c. Punto isoeléctrico: a pH neutro, la alanina existe predominantemente en la forma
dipolar II en la cual los grupos amino y
carboxilo están ionizados, pero la carga neta es cero. El punto isoeléctrico (pl) es el
pH al cual un aminoácido es
eléctricamente neutro, esto es, donde la suma de las cargas positivas iguala la
suma de las cargas negativas. Nota: para un
aminoácido como la alanina el cual sólo tiene dos hidrógenos disociables (uno del
grupo carboxilo alfa y otro del grupo
amino alfa), el pl es el promedio de pK1 y pK2: pl= [2.3 + 9.1 /2 =5.7. ver figura
1.9. El pl es el punto medio entre pK1
(2.3) y pK2 (9.1). este punto corresponde al pH donde la estructura II (carga neta de
cero ) predomina, y en donde
existen también iguales cantidades de la forma I (carga neta de +1) y de la forma III
(carga neta de –1).
6. CARGA NETA DE LOS AMINOACIDOS EN PH NEUTRO:
A pH fisiológico, todos los aminoácidos tienen un grupo cargado negativo COO- y un
grupo positivamente cargado
NH3+. Ellos son entonces iones bipolares (zwitterion ). Nota: las sustancias como los
aminoácidos que pueden actuar tanto
como un ácido o como base son definidos como anfotéricos y son referidas como
anfolitos (electrolitos anfotéricos).
C. TITULACION DE LAS HISTIDINA
La histidina es un ejemplo de un aminoácido que contiene 3 grupos químicos los
cuales pueden reversiblemente
ganar o perder un protón : el grupo carboxilo, el grupo imidazol de la cadena
lateral, y el grupo alfa amino. Ver figura 1.11 en
el libro. Nota: el grupo R o sustituyente de la histidina tiene un pK2 de 6.0 y puede
servir como un buffer a pH fisiológico.
1. Curva de titulación de la histidina:
La adición sostenida de una base a la histidina totalmente protonada resulta en la
liberación secuencial de protones del
grupo carboxilo (pK1= 1.8), el grupo imidazol (pK2= 6.0), y el grupo amino
(pK3=9.2). La curva de titulación es mostrada en
la figura 1.2.
2. Punto isoeléctrico de la histidina:
El punto isoeléctrico (pl) para la histidina es calculado primero identificando la
forma isoeléctrica ( la cual tiene una carga
neta de cero) del aminoácido ( forma III de la figura 1.11) y luego promediando los
valores de los pKs más cercanos.
Pl= (pK2 +pK3) = (6.0 + 9.2) = 7.6
22
Este cálculo requiere que la forma isoeléctrica sea identificada. Esto depende en
conocer el orden en el cual los protones se
pierden a partir de un aminoácido en particular, porque este orden determina los
cambios de las formas intermediarias. Los
valores de pKa para los grupos sustituyentes de algunos de los 20 aminoácidos más
comúnmente encontrados son mostrados
en la figura 1.2 y 1.5.

PAtron electroforetico: ELECTROFORESIS EN ACETATO DE

CELULOSA

Se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras

moléculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de
celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita
la formación de colas y los solutos pueden ser separados en bandas
bien definidas. Otras ventajas son:

1) La separación es muy rápida

2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas

3) Las tiras pueden hacerse transparentes

4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes

separados

5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos

radiactivos

Entre sus desventajas figuran que captan poca agua y son más
susceptibles a la evaporación que el papel. Son también más
susceptibles al flujo electro-endosmótico.

Las proteínas de suero se pueden separar mediante esta

técnica. Sus puntos isoeléctricos están entre 4,9 (Albúmina) y 7,4
(Gamma-globulinas). Al realizar la electroforesis con un tampón de

pH = 8,6, todas las proteínas del suero tendrán carga negativa. La

albúmina, al tener el punto isoeléctrico más alejado del pH, tiene más
carga negativa y avanza más rápido, quedando más cerca del polo
positivo que las gamma-globulinas, que migran muy poco por ser el
pH próximo a su pI. Las restantes proteínas séricas quedan situadas
entre estas dos.

En suero humano la composición normal es:

Albúmina ........... 54-62%

α - globulinas ....... 9-15%

β - globulinas ....... 8-13%

γ - globulinas ....... 14-19%

En el suero de rata la distribución de bandas es diferente,

separándose sólo las β - y γ -globulinas, la albúmina y una banda
proteica de mayor movilidad electroforética que la albúmina,
denominada prealbúmina.

La disminución de la proteína total puede indicar:

• Desnutrición
• Síndrome nefrótico
 • Enteropatía por pérdida de proteínas gastrointestinal

El aumento de las proteínas alpha-1 globulina puede indicar:

• Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)

• Enfermedad inflamatoria aguda
• Malignidad

La disminución de las proteínas alfa-1 globulinas pueden indicar:

• Deficiencia de alfa-1 antitripsina

El aumento de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:

• Inflamación aguda
• Inflamación crónica

La disminución de las proteínas alfa-2 globulinas puede indicar:

• Hemólisis

El aumento de las proteínas beta globulinas puede indicar:

• Hiperlipoproteinemia (por ejemplo, hipercolesterolemia familiar)

• Terapia de estrógenos

La disminución de las proteínas beta globulinas puede indicar:

• Trastorno de coagulación congénito

• Coagulopatía de consumo
• Coagulación intravascular diseminada

El aumento de las proteínas gama globulinas puede indicar:

• Mieloma múltiple
• Enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo artritis reumatoidea, LES)
• Hiperinmunización
• Infección aguda
• Macroglobulinemia de Waldenstrom
• Enfermedad hepática crónica