FUNCIONAMIENTO DE UN CROMATGRAFO (FASE ESTACIONARIA Y FASE

MOVIL)
ELECCIN DE LA COLUMNA Y DE LA FASE MVIL
La eleccin del sistema cromatogrfico debe realizarse en funcin de la naturaleza de las
substancias a separar.
El conocimiento de la naturaleza de la substancia va a permitir, a priori, orientar al cromatografista
sobre qu mecanismo de separacin puede ser el mas apropiado o, dicho de otro modo, cul es la
propiedad para la que existen diferencias ms notables entre las substancias a separar (tamao,
carga, polaridad, etc.), lo que dar una idea de la fase estacionaria que puede ser apropiada (Figura
24).
Es necesario, por lo tanto, conocer los mecanismos de separacin ms generales utilizados en
cromatografa de lquidos. Bsicamente stos se pueden dividir en:
- Adsorcin. Cromatografa lquido-slido (CLS).
- Adsorcin/reparto. Cromatografa con fases ligadas (CFL).
Cromatografa de fase normal (CFL).
Cromatografa de fase reversa (CFR).
- Intercambio inico. Cromatografa de intercambio inico (CII).
Cromatografa de cambio catinico.
Cromatografa de cambio aninico.
- Tamao molecular. Cromatografa de exclusin molecular (CEM).
Cromatografa de filtracin en gel (CFG).

CROMATOGRAFA DE ADSORCIN
Fundamentalmente, se tiene este mecanismo de separacin cuando la fase estacionaria es un slido,
con una superficie que contiene grupos funcionales cuyas caractersticas les permiten interaccionar
con los compuestos a separar y con la fase mvil. La cromatografa slido-lquido se fundamenta en
este mecanismo y los slidos utilizados habitualmente como fase estacionaria son almina o slice.
Este tipo de cromatografa es el ms antiguo de todos (es el usado por Tswett en 1903).
La teora ms aceptada por los cromatografistas para explicar las interacciones que se producen en
cromatografa de adsorcin, es el denominado mecanismo de desplazamiento, que permite
comprender el comportamiento de los diferentes sistemas de cromatografa de adsorcin.
Esta teora, propone la existencia de una competencia, entre soluto y fase mvil, por los puntos
activos de la superficie de la fase estacionaria. As, cuando el eluyente puro pasa a travs de la
columna, se llega a un equilibrio en el que molculas de la fase mvil quedan adsorbidas sobre la
superficie del slido formando una monocapa que es llamada fase adsorbida. Cuando el soluto es
introducido en la columna, ste compite por los puntos activos de la superficie de la fase
estacionaria ocupados por la monocapa de fase mvil, llegndose a nuevos equilibrios de adsorcindesorcin entre fase mvil, fase estacionaria y soluto (figura 25); en estos equilibrios influyen:
- Cantidad de puntos activos sobre la superficie de la fase estacionaria.
- La fuerza eleuotrpica (,o) de la fase movil (fuerza de adsorcin del eluyente sobre la fase movil).
- Relacin de fases. Fase movil adsorbida/ fase movil sin adsorber.
- El soluto.

Por lo tanto, se puede intuir el comportamiento del soluto en la columna teniendo en cuenta los
factores anteriormente indicados, y se puede estudiar la forma en que los distintos componentes del
sistema cromatogrfico influyen en la separacin.
La fase estacionaria
La fases estacionarias ms utilizadas en cromatografa de adsorcin son la slice y la almina, cuya
principal caracterstica comn reside en la elevada actividad superficial. Los parmetros que
permiten orientar sobre la actividad de estas fases estacionarias son:
. La superficie especfica
. El tamao de poro de la partcula
Ambos datos dan una orientacin de cuantos puntos activos existen en la superficie del relleno y
sobre si estos puntos activos estn al alcance de las molculas de soluto (una superficie especifica

alta con un tamao de poro pequeo da lugar a que gran parte de los puntos activos se encuentren
en zonas del poro inaccesibles para el soluto).
Tambin es importante tener en cuenta el estado en que se encuentran los puntos activos de la
superficie del adsorbente, ya que pueden estar desactivados por la presencia de molculas que se
adsorban fuertemente sobre ellos. As, por ejemplo, la presencia de molculas de agua en la fase
mvil conduce a una desactivacin de la superficie de la fase estacionaria (el agua es un compuesto
de alta polaridad que se adsorber fuertemente sobre la superficie, evitando la adsorcin de los
solutos, por lo que stos no se retendrn). En algunos casos, la desactivacin parcial y controlada
del adsorbente puede ser de utilidad para algn tipo concreto de anlisis.
La fase mvil
La fase mvil juega un papel principal en la cromatografa lquida, ya que es la variable del sistema
que permite mayor variacin y que, por otra parte, permite efectuar los pequeos retoques
necesarios para lograr una perfecta separacin.
En cromatografa de adsorcin, se utilizan como fase mvil disolventes orgnicos de polaridad baja
o media (la polaridad est en relacin directa con la fuerza eluotrpica ,o), pudindose utilizar un
rango muy variado de fuerza eluotrpica, bien por cambios de disolvente, bien por mezclas de dos o
ms disolventes de diferentes polaridades.
La seleccin de la fase mvil en cromatografa lquida de adsorcin se efecta convenientemente
con la ayuda de la llamada escala de Hildebrand, que clasifica a los diferentes disolventes utilizados
como fase mvil de acuerdo con la fuerza eluotrpica (,o), que indica su fuerza como eluyente con
relacin al pentano, al que se le asigna convencionalmente el valor cero.
Los eluyentes generalmente utilizados son: n-hexano, iso-octano, acetonitrilo, metanol, cloruro de
butilo, cloroformo, cloruro de metileno, tetrahidrofurano y 2-propanol. Los tres primeros
disolventes, pueden obtenerse muy puros y con una gran transparencia frente a la radiacin
ultravioleta de bajas longitud de onda, lo que los hace muy aptos para su utilizacin con el detector
de U.V., ampliamente utilizado en cromatografa lquida.
Es muy frecuente la utilizacin como eluyente de mezclas de dos o ms disolventes de diferente
polaridad. En general, al disolvente de mayor polaridad se le denomina modificador, y suele ir en
pequeas proporciones. De este modo se puede conseguir una amplia gama de polaridades (fuerzas
eluotrpicas) y, por lo tanto, aumentar la selectividad del sistema cromatogrfico. Una regla general
para elegir el disolvente a utilizar como fase mvil, es que la variacin de 0.05 unidades de ,o hace
variar el factor de capacidad (k') en 2 - 4 unidades. En la figura 26, se recogen las equivalencias en
fuerza eluotrpica de mezclas de disolventes de uso frecuente.