ISOLASI BAKTERI ENDOFIT DAN UJI AKTIVITAS ANTIKANKER

DARI DAUN PEPAYA (Carica papaya L) TERHADAP

SEL KANKER PAYUDARA T47D

OUTLINE PENELITIAN TUGAS RISET

Disusun oleh :
Qisthy Hanifati Hazrina
NIM 24030111130066

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA
UNIVERSITAS DIPONEGORO SEMARANG
November, 2014
HALAMAN PENGESAHAN OUTLINE PENELITIAN
1

a. Judul Penelitian

Isolasi

Bakteri

Endofit

dan

Uji

Aktivitas

Antikanker dari Daun Pepaya (Carica Papaya L)

terhadap Sel Kanker Payudara T47D
b. Bidang Ilmu
Pelaksana Penelitian
a Nama Lengkap
b Jenis Kelamin
c NIM
d Fakultas/Jurusan
3 Lokasi Penelitian
4 Lama Penelitian
5 Tanggal Seminar

Biokimia

:
:
:
:
:
:
:

Qisthy Hanifati Hazrina

Perempuan
24030111130066
Sains dan Matematika/Kimia
Laboratorium Terpadu
6 Bulan
28 November 2014
Semarang, 15 Desember 2014

Menyetujui,
Pembimbing I

Pembimbing II,

Purbowatiningrum Ria S., M.Si

NIP 197303141999032002

Dra. Nies S. Mulyani, M.S

NIP 195705181986022001

Mengetahui,
Koordinator TR Jurusan,

Kepala Laboratorium,

Didik Setiyo Widodo, M.Si

NIP 197005211999031001

Dra. Wuryanti, M.Si

NIP 195705111987032001

I.
1.1.

PENDAHULUAN
Latar belakang
Setiap tahun terdapat 100 penderita kanker baru dari 100.000 penduduk di

Indonesia. Kanker merupakan segolongan penyakit yang ditandai dengan

pembelahan sel yang tidak terkendali dan kemampuan sel-sel tersebut untuk
menyerang jaringan biologis lainnya yang bersebelahan (invasi) atau dengan
migrasi sel ke tempat yang jauh (metastasis) (Krishna dan Hayasi, 2000).
Manajemen kanker umumnya menggabungkan pembedahan dan radiasi dengan
pengobatan kemoterapi (Katzung,1995).
Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber obat-obatan kemoterapi
yang potensial. Banyak tanaman Indonesia yang saat ini telah digunakan secara
luas untuk berbagai tujuan pengobatan, selain dikonsumsi sebagai sayur. Salah
satunya adalah daun pepaya (Carica papaya L) yang termasuk ke dalam suku
Caricaceae dan marga Carica. Ekstrak akuades dari daun pepaya menunjukkan
kemampuan aktivitas antikanker dan menghambat perkembangbiakan sel pada
kanker (Moritomo, 2008). Daun pepaya mengandung metabolit sekunder jenis
alkaloid, pseudokarpen kolin, karposida, dan dehidrokarpen (Sheikh dan
Krishnamurthy, 2013). Penelitian Sukardiman 2000 menunjukkan bahwa ekstrak
metanol daun pepaya (Carica papaya L) memiliki aktivitas inhibisi terhadap
enzim DNA Topoisomerase II, yaitu suatu enzim yang berperan penting dalam
proses replikasi, transkripsi, rekombinasi DNA, dan poliferasi dari sel kanker.
Meningkatnya jumlah dan aktivitas enzim tersebut pada sel kanker maka proses
replikasi, transkripsi, dan poliferasi sel kanker juga

meningkat, kemudian

menghambat aktivitas enzim tersebut menyebabkan ikatan antara enzim dengan

DNA semakin lama sehingga terjadi Protein Linked DNA Brake (PLDB) dan
kematian secara apoptosis (Hsiag, 1998; Cotran, 1998).
Metabolit sekunder alkaloid dapat di isolasi dari tumbuhan maupun
mikroba endofit yang bersimbiosis dengan tumbuhan pepaya (Dian dkk, 2006).
Mikroba endofit adalah mikroba yang hidup dalam jaringan tanaman, diantara sel
tumbuhan dan bersimbiosis mutualisme dengan inangnya (Kumala dkk, 2006).
Kemampuan mikroba endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder sesuai
dengan tanaman inangnya merupakan peluang besar yang dapat diandalkan untuk
memproduksi metabolit sekunder skala besar. Pemanfaatan mikroba endofit dalam
memproduksi senyawa aktif memiliki beberapa kelebihan, antara lain (1) lebih
cepat menghasilkan senyawa dengan mutu yang seragam, (2) dapat diproduksi
dalam skala besar dan (3) kemungkinan diperoleh komponen bioaktif baru dengan
memberikan kondisi yang berbeda (Stierle et al, 1995). Penelitian ini diharapkan
dapat memperoleh data aktivitas antikanker dari metabolit sekunder yang
dihasilkan bakteri endofit asal daun pepaya (Carica papaya L) terhadap kanker
payudara T47D.
1.2.

Keaslian Penelitian
Beberapa peneliti sebelumnya telah melakukan uji aktivitas antikanker

dari daun pepaya (Carica Papaya L) diantaranya penelitian yang dilakukan oleh
Sukardiman pada tahun 2006 menguji ekstrak kloroform daun pepaya (Carica
Papaya L) menunjukkan bahwa ekstrak tersebut memiliki aktivitas antikanker
terhadap sel mieloma (Sukardiman, 2006).
Perbedaan penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah ekstrak
yang diuji menggunakan metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit yang di
isolasi dari daun pepaya, dilanjutkan menguji aktivitas antikankernya terhadap sel
kanker payudara T47D.
II.

Perumusan Masalah
Carica Papaya L merupakan tanaman yang memiliki banyak kegunaan.

Sukardiman et al, 2006 meneliti bahwa ekstrak kloroform daun pepaya

mempunyai aktivitas antikanker terhadap sel kanker mieloma. Oleh karena itu
pada penelitian ini akan dilakukan pengujian aktivitas antikanker menggunakan
metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit yang di isolasi dari daun pepaya
(Carica Papaya L) terhadap sel kanker payudara T47D.
III.

Tujuan Penelitian
III.1.
Memperoleh isolat bakteri endofit yang bersimbiosis dengan
tanaman pepaya (Carica Papaya L).
III.2.
Memperoleh metabolit sekunder dari isolat bakteri endofit.
III.3.
Memperoleh data kualitatif penapisan fitokimia senyawa metabolit
sekunder hasil produksi bakteri endofit daun pepaya (Carica Papaya L).
III.4.
Memperoleh data aktivitas antikanker dari metabolit sekunder hasil
produksi bakteri endofit daun pepaya (Carica Papaya L) terhadap sel
kanker payudara T47D melalui melalui metode apoptosis (Staining
Double).

IV.Metode Penelitian
Pada penelitian ini bahan yang dibutuhkan adalah sampel daun pepaya
(Carica Papaya L). Media miikrobiologi yang digunakan adalah media PDA
(Potato Dextrose Agar). Bahan sterilisasi yang digunakan adalah alkohol 70% dan
Kaporit teknis. Pewarna gram yang digunakan adalah kristal violet, lugol, iodin,
alkohol aseton, safranin. Reagen dan bahan kimia untuk uji fitokimia yang
digunakan adalah amonia 25%, kloroform, asam klorida, amil-alkohol, natrium
hidroksida, FeCl 1%, eter, asam sulfat, asam asetat anhidrat, reagen dragendorff,
pereaksi mayer, serbuk Mg. Bahan yang digunakan untuk uji BSLT adalah telur
udang, air laut, DMSO. Bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antikanker
adalah larutan baku sel kanker payudara T47D, MK (DMEM/RPMI), PBS, tripsin
EDTA dan DMSO.
Alat yang digunakan adalah sumuran-24, inkubator, shaker, inkas,
Spektrofotometer UV, sentrifuge, autoklaf dan alat-alat standar laboratorium.
Tahapan yang dilakukan pada penelitian ini yaitu, antara lain

Preparasi dan Sterilisasi Sampel : Sampel disterilisasi permukaannya dengan

cara direndam dalam akuades steril, alkohol 70%, dicuci dengan akuades steril
kemudian direndam dalam CaOCl 5,25% dan dibilas dengan akuades steril. Daun
pepaya yang telah steril kemudian ditumbuk untuk mendapatkan ekstraknya.
Isolasi Bakteri Endofit : Ekstrak daun pepaya ditanam pada permukaan media
PDA secara aseptik dan diiinkubasi pada suhu ruang selama tiga hari. Koloni
bakteri yang umbuh kemudian dipisahkan menurut kenampakan morfologisnya
dengan pewarnaan gram.
Pewarnaan Gram : Isolat bakteri endofit di suspensi ke dalam akuades steril,
dioleskan pada kaca steril dan ditetesi pewarana kristal violet, lugol iodin, alkohol
aseton dan safranin. Isolat bakteri yang telah dipisahkan selanjutnya di ukur
pertumbuhannya untuk menentukann waktu panennya.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan : Isolat bakteri di inokulasi ke dalam akuades
steril, kemudian dipindahkan dalam Nutrient Brooth (NB), dibagi ke dalam
beberapa botol vial dan disimpan dalam inkubator suhu kamar. Jumlah sel bakteri
dihitung setiap beberapa jam per satu botol vial dengan mengamati kekeruhannya
menggunakan alat spektrofotometer. Jumlah sel kemudian dibuat kurva
pertumbuhan bakteri untuk dipanen pada saat fase akhir stasionernya.
Produksi Metabolit Sekunder : Isolat bakteri endofit diinokulasi pada Nutrient
Brooth (NB) dan di vibrate incubation pada suhu ruang dengan kecepatan 75 rpm
selama 7 hari. Setelah didapatkan kultur isolat bakteri endofit, di sentrifuge pada
suhu 40C selama 15 menit dengan kecepatan 4000 rpm. Setelah didapatkan
supernatan, di freeze dry dan diperoleh metabolit sekunder padat.
Penapisan Fitokimia : Uji kualitatif senyawa Alkaloid, Saponin, Flavonoid,
Kuinon,

Tanin

dan

Steroid/Triterpenoid

dilakukan

sesuai

prosedur

di

Laboratorium Terpadu Undip.

Uji BSLT : Metode yang digunakan adalah metode Meyer. Air laut dituangkan
dalam plat, kemudian dimasukkan telur udang dan diletakkan dibawah lampu UV.
Setelah 48 jam telur menetas menjadi larva. Larva dimasukkan ke dalam larutan
baku sampel dan ditentukan konsentrasi letalitas terbaiknya. Ekstrak aktif dengan
nilai LC50 terbaik siap digunakan untuk uji antikanker.

Uji Aktivitas Antikanker : Kultur sel hasil pembiakan di panen kemudian di

inkubasi dalam sumuran-24. Sel yang tertanam dalam sumuran di cuci dengan
PBS dan dimasukkan sampel stok metabolit sekunder dengan beberapa variasi
konsentrasi, penambahan media, DMSO, dan diinkubasi pada suhu ruang. Setelah
10 jam, sel dicuci dengan PBS pada masing-masing cover slip dan ditetesi etidium
bromida-etidin orange. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop dengan uji
positif sel kanker berwarna hijau dan sel apoptosis berwarna orange.
V.DAFTAR PUSTAKA
Cotran RS, Kumar V, Collin T. 1999. Neoplasia in Robbins Pathologic Basic of
Disease, Sixth Edition, Philadelphia : W.B.Saunders Company, pp 260325.
Dian, N., Ruth, M., Apridah, C., Harmastini, S., 2006. Pengkajian Bakteri Endofit
Penghasil Senyawa Bioaktif untuk Proteksi Tanaman. Biodiversitas. Vol.
7, No. 3. Hal 221-224.
Hsiang, Y.H. 1989. Arrest of Replication Fork by Drug-stabilized Topoisomerase
I-DNA Cleavable Complexes as a Mechanism of Cell Killing by
Campthothecin, Cancer Research, 49, 5077-5082.
Katzung, B.G., 1995. Basic and Clinical Pharmacology, 7 th edition, Prentice Hall
International, pp. 881.
Krishna, G., Hayasi, M., 2000. In Vivo Rodent Micronucleus Assay : Protocol,
Conduct and Data Interpretation. Journal of Elsevier Science. Vol. 455.
Pages 155-166.
Kumala, S., Utji R., Sudarmono P., Kardono L., B.S., 2006. Isolation of Endophye
from Brucea Javanica L (Merr) and Cytotoxic Evaluation of their nbutanol from Fermentation Broth. Pakistan Journal of Biologycal Science
Vol. 9, No.5, 825-832.
Moritomo, C., Dang, N. H., Dang, N., 2008. Cancer Prevention and Treating
Composition for Preventing, Ameliorating, or Treating Solid Cancers, e.g.
Lung, or Blood ancer, e.g. Lymphoma, Comprises Components Extracted
from Brewing Papaya, YS Therapeutic Co Ltd .

Sukardiman, Poernomo H., 2000. Penapisan Senyawa Antikanker dari Tanaman

Obat Indonesia dengan Molekul Target Enzim Topoisomerase, Penelitian
DCRG, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Surabaya.
Sukardiman, Wiwied, E., Putri, P., 2006. Aktivitas Antikanker dan Induksi Fraksi
Kloroform Daun Pepaya (Carica Papaya L) terhadap Kultur Sel Kanker
Mieloma. Media Kedokteran hewan. Fakultas Farmasi Universitas
Airlangga, Surabaya, Vol.22, No.2.
Tietze, H.W., 2002. Terapi Pepaya, PT. Prestasi Pustaka Raya, Jakarta.
LAMPIRAN
Skema Penelitian
5.1. Preparasi dan Sterilisasi Sampel
Daun Pepaya
-

Pencucian dengan akuades steril

Perendaman dalam alkohol 70% selama 1 menit
Pembilasan dengan akuades steril
Perendaman dengan CaOCl 5,25% selama 5 menit
Pembilasan dengan akuades steril
Perendaman dalam alkohol 70% selama 1 menit
Pembilasan dengan akuades steril

Sampel daun pepaya steril

- Penggerusan dengan mortar aseptik
- Penambahan akuades steril 1 ml
- Penggerusan sampai halus
Endapan

Filtrat (ekstrak)

5.2. Isolasi Endofit

Ekstrak daun pepaya
- Penanaman pada media padat PDA
- Inokulasi pada media padat PBA
- Inkubasi 3 hari pada suhu ruang dan pengamatan
- Inkubasi 8 hari pada suhu ruang dan pengamatan
Koloni Endofit
- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan morfologis
- Pemisahan koloni berdasarkan kenampakan fisik

Isolat bakteri Endofit tunggal

5.3. Pewarnaan Gram Isolat

Isolat Bakteri Endofit tunggal
- Pensuspensian pada akuades steril
- Pengolesan pada kaca preparat
- Penambahan 2-3 tetes pewarna kristal violet dan
pendiaman 1 menit
Perubahan warna isolat (ungu)
- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir
- Pengeringan
- Penambahan 2-3 tetes pewarna iodin dan pendiaman 1
menit
Perubahan warna isolat (ungu)
-

Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir

Pengeringan
Pencucian isolat dengan alkohol aseton
Pendiaman 30 detik

Perubahan warna (-) bening (+) ungu

-

Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir

Pengeringan
Penambahan safranin
Pendiaman 2 menit

Perubahan warna (-) merah (+) ungu

- Pencucian zat warna berlebih dengan air mengalir
- Pengeringan
Preparat
- Pengamatan melalui mikroskop dengan perbesaran 1000x

Penampakan mikroskopik isolat

Bakteri gram negatif

(Merah)

Bakteri gram positif

(Ungu)

5.4. Kurva Pertumbuhan Endofit

Isolat Endofit Tunggal
Media PDA
- Penanaman pada media cair NB
- Penginkubasian pada suhu ruang dengan shaker kecepatan
75 rpm selama 2 hari
Isolat endofit tunggal
- Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang
maksimum setiap 2 hingga 4 jam selama 48 jam
Data Kurva Pertumbuhan

5.5. Produksi Metabolit sekunder

Isolat Endofit Tunggal
Tabung reaksi
- Penginokulasian pada media cair
- Penginkubasian dengan inkubator shaker pada
kecepatan 75 rpm selama 7 hari pada suhu 30oC
Ekstrak kasar
- Sentrifugasi 4000 rpm pada 4oC selama 15 menit
- Pengukuran panjang gelombang maksimum
Endapan

Filtrat
- Pengeringan dengan freeze dryer
Padatan metabolit sekunder

5.6. Penapisan Fitokimia Metabolit Sekunder

5.6.1. Uji Alkaloid
Padatan Metabolit Sekunder
Mortar
-

Pelembaban dengan 5 ml NH3 25%

Penggerusan
Penambahan 20 ml Kloroform
Penggerusan
Penyaringan

Endapan

10 ml Filtrat
- Pengekstrasian dengan HCl 2N
sebanyak 2 kali
Lapisan HCl

Lapisan Kloroform

5 ml Lapisan HCl

5 ml Lapisan HCl

Tabung reaksi

Tabung reaksi

- Penambahan reagen
Dragendorff
Perubahan warna (merah bata)
5.6.2. Uji Saponin
Padatan Metabolit Sekunder
Tabung reaksi

- Penambahan pereaksi
Mayer
Perubahan warna (putih)

- Pendidihan dalam 100 ml air selama 5 menit

- Penyaringan dalam air panas
Endapan

10 ml Filtrat
- Pengocokan
- Pengamatan busa
- Penambahan 1 tetes HCl 2N
Sampel Busa

5.6.3. Uji Flavonoid

5 ml filtrat dari saponin
Tabung reaksi
-

Penambahan serbuk Mg
Penambahan 1 mL HCl pekat dan 2 ml amilalkohol
Pengocokan kuat
Pendiaman
Pengamatan

Perubahan warna (merah)

5.6.4. Uji Tanin

Padatan Metabolit Sekunder
Tabung reaksi
- Pendidihan dalam 10 ml air selama 5 menit
- Pendinginan dan penyaringan

Endapan

Filtrat
- Penambahan FeCl3 1%
Perubahan warna (hijau kehitaman)

5.6.5. Uji Kuinon

Padatan Metabolit Sekunder
Tabung reaksi

- Pendidihan dalam 10 ml air selama 5 menit

- Pendinginan dan penyaringan

Endapan

Filtrat
- Penambahan NaOH 1M
Perubahan warna (merah)

5.6.6.Uji Triterpenoid/Steroid
Padatan Metabolit Sekunder
- Maserasi dengan 20 ml eter selama 2 jam
- Penyaringan
5 mL Filtrat

Endapan

- Penguapan hingga kering

Endapan
- Penambahan 2 tetes CH3COOH anhidrat
- Penambahan 1 tetes H2SO4
- Pengamatan warna
Steroid membentuk
warna (ungu-biru)

Triterpenoid membentuk
warna (merah)

5.7. Uji BSLT

100 mL Air Laut

Metabolit Sekunder

Metanol
- Penambahan 10 butir telur udang - Pengenceran konsentrasi 20,
10 dan 2 g/mL
- Peletakkan di bawah lampu UV
- Penambahan DMSO
- Pendiaman 48 jam
- Pendiaman
48 jam
Pengamatan
Larva- Udang
Larutan
Uji
- Pengamatan
Plat

Larva dan metabolit sekunder

Botol- Vial
- Perubahan
Perubahan konsentrasi
konsentrasi menjadi
menjadi 10,
10, 55
dan
dan 11 g/mL
g/mL
-- Inkubasi
Inkubasi 24
24 jam
jam dan
dan pengamatan
pengamatan

Larva Mati dan Hidup

- Perhitungan LC50
Nilai LC50
5.8. Uji Aktivitas Antikanker
5.8.1. Pembuatan Larutan Stok
5 mg ekstrak kasar
Eppendorf
- Penambahan 50ml DMSO
- Pengocokan dengan vortex mixer
Isolat homogen
- Pengenceran bertingkat hingga mendapatkan satu seri larutan
uji dengan konsentrasi 25, 50, 100, 15, 200 dan 300 mg/ml
Larutan stok

5.8.2. Preparasi sel kanker payudara T47D

Sel kanker payudara T47D
Tabung reaksi
- Penambahan tripsin EDTA dan inkubasi 3 menit
- Penambahan media
- Pemindahan ke plat cover slip
Sel kanker terpanen
Plat cover slip
- Perhitungan sel dengan mikroskop cahaya
- Penambahan media
- Pemindahan ke Conical
Sel kanker terpanen
Conical
- Pemindahan sel ke atas cover slip secara merata ke dalam
sumuran
- Inkubasi 30 menit
- Penambahan MK / RPMI ke dalam sumuran

Sel tertanam pada cover slip

5.8.3. Pengamatan aktivitas antikanker dengan metode staining double

Sel tertanam
Cover slip sumuran
-

Pembuangan MK dari sumuran

Pencucian dengan PBS
Pemasukan larutan stok sampel
Pemasukan kontrol media DMSO
Inkubasi pada inkubator 5% CO2 selama 10 jam pada suhu
37oC dan pH 7,4 7,7
- Panen sel
Apoptisis sel kanker
-

Pembuangan MK dari sumuran

Pencucian dengan PBS
Pengangkatan cover slip
Penetesan etidiumbromida-etidin orange
Pengamatan mikroskop

Perubahan warna hijau menjadi orange