Universitatea Al.

Ioan Cuza IAI

Facultata de Biologie
Specializarea: Biotehnologii microbiene i celulare

Regenerarea in vitro i mbuntirea pomilor

fructiferi tropicali

Student: Brldeanu Oana-Silvia

Grupa A

Cuprins
I.

Regenerarea in vitro a pomilor fructiferi tropicali.................................................1

I.1

Regenerarea prin organogenez....................................................................1

I.2

Regenerarea prin embriogeneza somatic....................................................2

I.3

Cultura de antere........................................................................................... 4

II.

Variaia somaclonal............................................................................................ 5

III.

Semine sintetice.............................................................................................. 5

IV.

Plante transgenice............................................................................................ 6

Concluzii..................................................................................................................... 7

I.

Regenerarea in vitro a pomilor fructiferi tropicali

Una dintre cele mai vechi ncercri de regenerare prin tehnica de cultur in vitro a
pomilor fructiferi tropicali, a fost realizat de ctre Maheshwari i Rangaswamy. Ulterior mai
multe specii de fructe tropicale au fost regenerate prin procesul de organogenez, precum i prin
embriogenez somatic.
Organogeneza implic producerea adventiv i axilar de muguri (lstari). Producerea de
muguri adventivi compromite formarea meristematic de novo, de la calus sau direct de la
esuturile organizate, precum celulele epidermice sau cele subepidermice. Producerea de muguri
axilari implic formarea din mugurii axiliari i meristeme. Mugurii regenerai sunt exciza i i
folosii pentru producerea mugurilor suplimentari.
Producerea de muguri axilari este metoda direct ce implic multiplicarea mugurilor
preformai. Se produce cel mai mic numr de plante, deoarece numrul de muguri produi este
limitat de numrul mugurilor axilari plasai n cultur. Dei rata de multiplicare este sczut,
crete n primele subculturi i atinge o stare de echilibru n cele din urm, ce poate fi men inut
prin numeroase subculturi.
Embriogeneza somatic este procesul n care fiecare structur format, conine un
mugure i o rdcin conectat printr-un sistem vascular nchis.

I.1

Regenerarea prin organogenez

Principalii factori care influeniaz modul i viteza de regenerare in vitro sunt de natur

explant: compoziia mediului i condiiile fizice n care culturile cresc. Organogeneza a fost
indus in vitro, att de la rsaduri ct i de la explantele copacilor maturi.
Mugurii adventivi au aprut direct din segmentele internodale fr faze ale calusului, la
Citrus. Mugurii organogenezei directe i regenerarea plantelor au fost de asemenea raportate de
la frunzele explantelor de Annona squamosa i Garcinia mangostana i din hipocotilul i peiolul

de A. Cherimola. Mugurii adventivi s-au difereniat dup iniierea calusului i proliferare la

Citrus.
La guava, noua cretere vegetativ ce apare la baza tulpinii principale, servete drept
surs de mugur. Organogeneza speciilor de fructe tropicale a fost n general bazat pe mediul MS
(Murashige i Skoog)- cu o concentraie ridicat de sruri. n cele mai multe studii, ini ierea
calusului i inducia mugurelui au fost raportate pe acelai mediu ce conine citochinine, BA (6benzilamino purine) sau o citochinin mpreun cu o auxin. O concentraie mare de citochinin
n raport cu o concentraie mic de auxin favorizeaz caulogeneza. Ocazional, formarea
mugurilor poate s apar n urma subculturii de calus iniiat pe un mediu fie cu o cantitate mare
de auxin n raport cu o citochinin, fie cu o cantitate mare de citochinin n raport cu o auxin
sau cu o singur citochinin. De obicei auxina ANA (acidul -naftalinacetic) a fost preferat
pentru efectul ei sinergetic asupra induciei mugurilor.

I.2

Regenerarea prin embriogeneza somatic

Embriogeneza somatic prezint mai multe avantaje n comparaie cu organogeneza. La

speciile lemnoase, aceasta se realizeaz mai puin frecvent dect alte metode de regenerare. Cu
toate acestea, cei mai muli pomi fructiferi tropicali au fost regenerai prin embriogeneza
somatic. Prima dat embriogeneza somatic a fost raportat la Citrus. Prima tentativ privind
inducerea embriogenezei somatice la Citrus a fost realizat de Stevenson, mai trziu de
Maheshwari i Rangaswamy.
Dintre diferitele explante folosite pentru a induce embriogeneza somatic n pomii
fructiferi tropicali, nucela a fost cea mai potrivit. Astfel c embriogeneza somatic a fost indus
direct n nucela culturilor de Citrus i indirect la mango i papaya.
Embrionul zigotic imatur s-a dovedit a fi de asemenea un esut regenerabil pentru multe alte
specii. Cultura embrionului zigotic fiind relativ uoar n procedura in vitro. Aceast cultur a
fost folosit n multiplicarea de Litchi, care este una dintre cele mai recalcitrante specii de fructe
tropicale.

Embriogeneza somatic urmrete 2 modele diferite. n primul rnd, embriogeneza

provenit din celule i n al doilea rnd, embriogeneza indus n esuturi diferen iate, cum ar fi
frunzele, tulpina, nucela i inflorescena. Embriogeneza din celulele determinate proembriogenic
(PEDC) necesit doar mediul in vitro pentru a putea urma modelul de diviziune celular
necesar.
ntruct esuturile mature sunt diferite de cele determinate proembriogenic, embriogeneza
fostele esuturi are loc prin intermediul unei alte ci descrise de Sharp, adic prin inducerea
celulelor determinate embriogenic (IEDC). Aceste esuturi extrem de difereniate trebuie s
sufere importante modificri epigenice pentru a iniia embriogeneza somatic. Prin urmare,
IEDC necesit un mediu in vitro, mai nti pentru a dediferenia i mai apoi pentru a rediferenia
celulele pasive i a ajunge la o stare embriogenetic. Embriogeneza direct i indirect, sunt doi
termeni folosii pentru a descrie PEDC si IEDC.
Efectul compoziiei mediului i rezistena la inducerea embriogenezei somatice a fost
demonstrat la unele specii, ca de exmeplu Citrus, papaya i mango. n general calusul
embriogenic a fost obinut n urma explanting-ului pe un mediu ce conine 2,4-D (2,4diclorofenoxi acid acetic) sau alte auxine precum dicamba. Cerina auxinei exogene pentru
inducerea embriogenezei somatice, depinde de natura explantului utilizat. Dei citochininele au
fost uneori ncorporate n mediul de inducie, ele nu sunt critice pentru inducie. Dar n unele
cazuri, de exemplu n longan, inducia calusului embriogenic a fost dovedit a fi citochinindependent.
Azotul sub form de glutamin s-a dovedit a fi esenial pentru embriogeneza somatic la
mango. Adugarea de poliamine la mediul de cultur promoveaz embriogeneza somatic la
nuca de cocos i papaya. Complexul de nutrieni organici precum, apa de cocos, hidrolizatul de
cazein, extractul de mal, de asemenea au fost utilizate n mediul de induc ie pentru unele specii
de plante tropicale. Zaharoza este utilizat n mod obinuit ca surs de carbon i o concentra ie
de zaharoz relativ ridicat (5-6%) este optim pentru embriogeneza somatic la guava, Citrus,
mango i longan.
n plus fa de mediul de cultur i explante, genotipurile diferite ale speciilor pot
influena capacitatea de producere a embriogenezei somatice. Printre pomii fructiferi tropicali,
regenerarea plantulelor viabile din embrionii somatici este o problem mai des ntlnit dect
3

producerea embrionilor somatici din embriogeneza somatic. Aceast problem poate aprea n
orice stadiu de dezvoltare ca maturarea, germinarea, alungirea apexului mugurelui sau
aclimatizarea.
Dei embriogeneza somatic a fost raportat la multe specii de arbori fructiferi tropicali,
calitatea de embrioni somatici n ceea ce privete germinabilitatea sau comunicarea ntre plante a
fost slab. Acest lucru se datoreaz apariiei embrionului somatic care de fapt este incomplet
dezvoltat. Spre deosebire de embrionii seminelor, embrionii somatici, n mod normal, nu trec
prin faza final a embriogenezei numit maturizarea embrionului, care este caracterizat de
acumularea de rezerve specifice de embrioni i proteine ce confer toleran la deshidratarea
embrionului.
Acidul abscisic (ABA) care previne germinrile precoce i promoveaz dezvoltarea
normal a embrionilor prin suprimarea embriogenezei secundare i pluricotiledonarea, este
raportat pentru a ncuraja maturarea embrionar la cteva specii. Ali factori precum temperatura,
ocurile, stresul osmotic, lipsa nutrienilor i inocularea la densiti mari pot nlocui ABA,
probabil pentru a induce embrioni ce vor sintetiza hormoni. Citochininele pot fi importante
pentru maturarea embrionilor somatici i a fost demonstrat influena dezvoltrii cotiledonului i
a apexului mugurilor.
Organogeneza

Embriogeneza somatic

 Multiplicarea celulelor explantului pe

medii adecvate cu formare de calus
Calusul trebuie meninut ca atare o
perioad de timp ndelungat prin
subcultivarea la intervale de 4-10
sptmni;
Sau prin modificarea componentei
hormonale din mediu poate fi fcut s
parcurg un proces de difereniere
genernd mugur;
Diferenierea mugurilor este indus
de concentraii mari de citokinin;
Lstarul care se dezvolt din mugure
n situ se separ i se transfer pe
mediu nou pentru nrdcinare;
La unele specii este posibil
diferenierea mugurilor adventivi
direct pe explant fr a fi necesar
etapa de caulogenez.

I.3

Iniierea
formrii
de
embrioizii din calus, din
celule izolate, din agregate
celulare n suspensie;
Embrioizii astfel formai (dei
provin din celule somatice)
parcurg aceleai etape de
dezvoltare ca i embrionii
normali;
Pe medii de cultur adecvate,
embrioizii genereaz noi
plante.

Cultura de antere
Androgeneza in vitro a fost descris ca fiind un proces de deviere a dezvoltrii de la

gametofitul normal ctre sporofit. Aceast deviere conduce n general la formarea de calus sau
formarea de embrioni. Ulterior, plantele pot fi obinute fiecare prin organogenez sau
embriogenez prin calusul androgenic sau direct prin intermediul germinrii embrionului
androgenic. n pomii fructiferi tropicali, androgeneza i regenerarea plantelor au fost raportate la
Citrus, n zahrul merelor, papaya, longan i Litchi. Formaiunile calusului androgenic de la
culturile in vitro ale anterelor pot fi gsite n guava i Feijoa. Cultura de antere dup depozitarea
polenului are potenial pentru conservare.

II.

Variaia somaclonal
5

Termenul de variaie somaclonal se refer la variaia fenotipic i genotipic observat

la plantele regenerate de la orice form de cultur celular. S-a demonstrat c gradul de varia ie
depinde de esuturile ce au fost cultivate i de asemenea de durata de timp n care celulele sau
esuturile au fost meninute in vitro. Variaia somaclonal poate fi o abordare pentru a obine
caracteristici horticole utile la pomii fructiferi tropicali.
Prin utilizarea acestei tehnici pe unele specii de fructe s-a ob inut rezisten a la boli,
tolerana la sare i rezistena la toxine. ns, cercetri suplimentare trebuie efectuate pentru a
evalua stabilitatea fenotipic i genotipic a acestor trsturi.

III.

Semine sintetice

Tehnologia seminelor sintetice sau artificiale este un domeniu interesant i n

cretere rapid a cercetrii fcute asupra celulelor plantelor i culturilor de esut. Producerea de
semine artificiale a artat noi perspective n rspndirea plantelor. Reprezint o tehnic
excelent n propagarea hibrizilor rari, germoplasmei i plantelor modificate genetic.
Germoplasmele pot fi stocate n mod eficient sub form de semin e sintetice. Ele servesc ca fiind
cel mai frecvent sistem de transport.
Seminele sintetice au fost produse folosindu-se oricare din cele dou sisteme : un sistem
hidratat sau unul deshidratat. La pomii fructiferi tropicali, tehnologia seminelor artificiale este
ntr-un continuu progres. ncapsularea embrionilor somatici i regenerarea plantelor au fost
descrise la guava, mango, papaya i banane.

IV.

Plante transgenice

Dezvoltarea tehnologiei ADN-ului recombinant i eficiena sistemelor de control al

morfogenezei culturilor celulelor i esuturilor, a creat oportunitatea pentru manipularea genetic
a plantelor la nivel celular.
Scopul tehnicii transferului de gene este de a produce mbuntiri prin ncorporarea
genelor importante n horticultur (precum: rezistena la pesticide i boli, toleran la uscciune

i temperaturi joase, rezistena la erbicide, mbuntirea calitii fructelor, reducerea

juvenilitii- nanism) n soiurile existente.
Metode existente pentru transformarea plantelor sunt clasificate n 3 grupe:
Acelea care utilizeaz vectori biologici (virus, Agrobacterium)
Tehnici de transfet direct de ADN (chimic, electric, microlaser- induce permeabilitatea n
protoplast sau celule)
Sistem de vector non-biologic (microproiectile, microinjecii sau fuziune de liposomi)
O analiz complet asupra metodelor de transformare a fost realizat de Potrykus.
Transformarea pe baz de Agrobacterium prezint un avantaj n faa altor metode din
moment ce aceasta intete transgenele ctre nuclee i le integreaz n ADN. Astfel de
transformri pe baz de Agrobacterium au fost evideniate la Citrus, papaya i mango.
Regenerarea plantelor transgenice este n special dependent de frecvena introducerii genelor i
de abilitatea celulelor transformate de a se distinge de plante.
Pang i Sanford au fost primii care au demonstrat trasnformarea cu A. tumefaciens la
papaya prin co-cultivarea frunzelor, tulpinilor i peiolului. Dei transformarea a fost confirmat
de ctre testele nopaline, ele nu au fost n msur s regenereze calusul ntr-o plant. Fitch a
demonstrat primul c papaya mpreun cu neomicina-fosfotransferaza II i -glucuronidaza
(GUS) utilizeaz embrioni imaturi ai explantelor prin bombardament cu microproiectile. La
Citrus transformrile reuite sunt raportate folosindu-se metode diferite, ns frecvena
transformrilor a fost foarte sczut.
Diferite metode pot transporta ADN n celule, dar compartimentele genetice, organitele
i nucleele nu sunt controlate iar integrarea genetic a ADN-ului extern se face la ntmplare.
Cteva transformri independente cu o construcie de gene specifice sunt necesare n gsirea unei
plante transgenice dup modelul propus. Pn acum biotehnologia plantelor s-a axat mai ales pe
o singur strategie de gene.

Concluzii

Progresul considerabil a fost realizat n trecut asupra regenerrii in vitro prin intermediul
organogenezei i a embriogenezei somatice la pomii fructiferi tropicali prin manipularea mediei
de cretere i a condiiilor culturilor. Pentru a mbunti sistemul de propagare i pentru a trece
peste principalele blocaje, n special frecvena maturrii i a germinrii sczute, cunotinele
dezvoltrii au nevoie de mbuntiri.
Numeroase caracteristici ale pomilor fructiferi tropicali care nu pot fi mbunt ite prin
intermediul culturilor convenionale, au nevoie de intervenie biotehnologic.

Bibliografie
1. Madhulika Singh,

Uma Jaiswal,V.S. Jaiswal,

2004,

In

Vitro Regeneration

and

Improvement in Tropical Fruit Trees: An Assessment, Anamaya Publishers,

New Delhi, India, pp 228-243
2. J. W. Grosser, 1994, In vitro Culture of Tropical Fruits, Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, pp 475-496
3. Nasim Akhtar, Nishi Kumari, Shashi Pandey, Hussain Ara, Shri. M. Jain, 2000, Somatic
Embryogenesis in Tropical Fruit Trees, Kluwer Academic Publishers,
Volume 67 of the series Forestry Sciences pp 93-131