Universidad San Francisco de Quito

Laboratorio de Bioqumica
Jorge Alvarez Santana. 00112073
26/11/2014
Carlos Vintimilla. 00112180
Extraccin de protena a partir del suero sanguneo y
electroforesis SDS-PAGE
La electroforesis se ha desarrollado para la separacin de molculas
complejas en una matriz porosa sumergida en una solucin que permite la
corriente elctrica para que las molculas migren segn su peso
molecular o punto isoelctrico. Esta tcnica es muy eficiente en cuanto a
la deteccin, purificacin y cuantificacin de molculas. La electroforesis
en gel de poliacrilamida (PAGE) permite la separacin de protenas. Para la
migracin de las protenas se las debe desnaturalizar, las molculas ms
grandes migran ms lento mientras que las ms pequeas lo hacen de
manera ms rpida. Debido a que las protenas no tienen una carga
definida, como lo es el ADN, se emplea el dodecilsulfato sdico (SDS) que
elimina los plegamientos de los aminocidos y le da la carga negativa a
las molculas. La adicin de B-mercaptoetanol brinda una completa
desnaturalizacin de las protenas rompiendo los puentes di sulfuro. Al
momento de emplear la corriente elctrica las molculas van a migrar
hacia el polo positivo. Para la visualizacin de las protenas separadas se
utiliza Azul de Coomasie o Solucin de nitrato de plata. Para conocer el
peso molecular de las bandas que se revelen se utiliza un estndar de
tamaos de fragmentos conocidos, la unidad de tamao en las protenas
son kilo Dalton (kDa).
Objetivos de la prctica
Extraccin de protenas del suero sanguneo a partir de sangre humana y
realizar electroforesis de protenas del suero mediante la SDS-PAGE.
Materiales

Tubos de ensayo
Micropipetas
Vasos de precipitacin
Guantes desechables
Recipiente profundo
Funda plstica
Sellador de fundas plsticas
Esptula
Mandil

Reactivos

Suero sanguneo de humanos, Agua destilada, Buffer de carga 2X

(0.125M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% Glicerol, 10% 2-Bmercaptoetanol, 50ul azul de bromo fenol 1%), Acrilamida, Bisacrilamida, Persulfato de amonio (N2H8S2O8), TEMED (N,N,N1,N1tetrametiletildiamina), Tank Buffer 1X.
Gel resolutivo (12%): 1.7ml agua destilada, 2ml monmero
(acrilamida y bis-acrilamida) 30%, 1.25ml buffer de resolucin (1.5M
Tris, pH 8.8), 50ul SDS 10%, 50ul persulfato de amonio 10%, 5ul
TEMED.
Gel Pre resolutivo (5%): 1.5ml agua destilada, 325ul monmero
(acrilamida y bis-acrilamida) 30%, 625ul buffer pre resolutivo (1.0M
Tris, pH 6.8), 25ul SDS 10%, 75ul persulfato de amonio 10%, 5ul
TEMED.
Azul de Coomasie: 0.006% de Azul de Coomasie, 10% cido actico,
90% dd agua.

Se debe tener especial cuidado con la acrilamida ya que es un

neurotoxina y se debe manejar con cuidado .

Equipos

Centrifuga.
Cmara de electroforesis para SDS-PAGE.
Balanza de precisin.

Mtodo

Tomar 5ml de sangre y centrifugar por 5min a 2500rpm.

Aadir 65.7ul agua destilada, 1ul de suero y 33ul de buffer de carga
2X.
Armar la cmara de electroforesis de SDS-PAGE.
Ubicar el gel resolutivo 12%.
Colocar los vidrios inmediatamente.
Colocar una capa de agua sobre la solucin del gel resolutivo y dejar
que se polimerice.
Retirar la capa de agua y ubicar el gel pre-resolutivo y dejar que se
polimerice. Ubicar la peinilla en el gel.
Ensamblar el equipo de electroforesis y ubicar tank buffer 1X.
Retirar la peinilla y ubicar las muestras en las ranuras del gel.
Colocar el estndar de protenas.
Correr el gel a 225V por 50Ma por 1h.
Desconectar el equipo de electroforesis y retirar los vidrios para
sacar el gel.
Ubicar el gel en el envase profundo con el Azul de Coomasie por
15min con agitacin.
Retirar el gel del envase y hervir el gel por 5 min con agua
destilada.
Sacar el gel y ubicar en la funda y sellarlo para su conserva.

 Bibliografa

Andrade, P. e Intriago, D. (2013). Laboratorio de Biologa Molecular.

4ta Edicin. USFQ. Quito, Ecuador

Sino Biological Inc. (2013). SDS-PAGE. Recuperado el 20 de

noviembre del 2014 desde http://www.assayprotocol.com/molecular-biology/electrophoresis/denaturing-page