Tincion Con Alizarina

ELABORACIN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TCNICA DE
DIAFANIZACIN PARA LA ENSEANZA DE LA MORFOGNESIS SEA.
JONATHAN CORONADO CASALLAS
Trabajo de grado para optar al

Ttulo de magister en Morfologa Humana
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA
MAESTRA DE MORFOLOGIA HUMANA
BOGOT CUNDINAMARCA
2014
ELABORACIN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TCNICA DE

DIAFANIZACIN PARA LA ENSEANZA DE LA MORFOGNESIS SEA
JONATHAN CORONADO CASALLAS
Trabajo de grado
Director
DR. JAIME BELTRN GUERRA
Codirectora
DR. ZOILA EMILIA CASTAEDA MURCIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA
MAESTRIA DE MORFOLOGIA HUMANA
BOGOTA CUNDINAMARCA
2014
DEDICATORIA
A Dios, por su sabidura y discernimiento durante cada instante; a m hijo Esteban por sus
grandes bendiciones desde el momento que llego a nuestras vidas; a mi esposa Jessica y a
mi familia por su apoyo incondicional.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Zoila Emilia Castaeda Murcia, Profesora pensionada e invitada de la Maestra

de Morfologa Humana de la Unidad de Biologa Celular por su continuo respaldo,
paciencia, motivacin, inters constante, acompaamiento y sus consejos cientficos para
la elaboracin de este trabajo.
Al Dr Jaime Alfonso Beltrn Guerra, Profesor asociado de la Unidad de Anatoma y

Embriologa del Departamento de Morfologa Humana y director de la Maestra en
Morfologa Humana de la Universidad Nacional de Colombia, por sus valiosos aportes y
su acompaamiento en el desarrollo de la investigacin.
RESUMEN.
El proyecto de investigacin busca exponer la obtencin de piezas anatmicas diafanizadas

con tincin de centros de osificacin en ratones, la elaboracin de los modelos y lograr
estandarizar la tcnica de preservacin anatmica de diafanizacin. Segn la propuesta, el
proyecto de investigacin requiri de siete fases, las cuales se desarrollaron en la
Universidad Nacional de Colombia. En la primera fase se realiz una prueba preliminar en
un cerdo. En la segunda y tercera fase, se implement el protocolo de una universidad local
y latinoamericana. La cuarta fase se bas en las experiencia de las primeras tres fases, y se
realiz una fusin de tcnicas que result en una adecuada diafanizacin. La quinta fase se
hizo en fetos ratones de 17 das despus de la copulacin. La sexta y sptima fase, basadas
en las anteriores realiz un protocolo de diafanizacin estandarizado que se implement
en 4 ratones con resultados satisfactorios en diafanizacin.
Palabras clave: Diafanizacin, centros de osificacin, fases, ratn y estandarizacin.
ABSTRACT
This paper present in a clear the way how getting pieces anatomical diaphanizations with
staining centers of ossification in mice. The development of pieces and help standardize
the technique of anatomical preservation of diafanization according to the proposal made
by the author of the research project required seven phases which were developed at
Universidad Nacional de Colombia. The first step was done in a pig, the second and the
third phase was use not only the protocol from a local university but also from a Latin
American college. The fourth step of the project was perform a fusion of the thecniques
than provide a successful result in the diafanization. The fifth step was done the process in
mice fetuses of 17 days since the coupling. The sixth and seventh stage of the project was
perform a standardized protocol of diaphanization that was implemented in four mice with
satisfactory results.
Keywords: Diaphanization, ossification centers, stages, mouse and standardization.
ndice.
INTRODUCCIN. ............................................................................................................. 12
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................................................ 13
2. OBJETIVOS.................................................................................................................... 14
2.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................................ 14
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS: ....................................................................................... 14
3. JUSTIFICACIN............................................................................................................ 15
4. MARCO DE REFERENCIA .......................................................................................... 16
4.1. ANTECEDENTES MUNDIALES .............................................................................. 16
4.2 ANTECEDENTES LATINOAMERICANOS ............................................................. 17
4.3. ANTECEDENTES NACIONALES ............................................................................ 18
4.4. ANTECEDENTES DE INVESTIGACION ASOCIADOS AL ESTUDIO EN LA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA ............................................................... 20
5. MARCO CONCEPTUAL. .............................................................................................. 21
5.1. DIAFANIZAICIN. .................................................................................................... 21
5.1.1. PROCEDIMIENTOS DE DIAFANIZACIN ......................................................... 21
5.1.1.1. TECNICA DE MACERACION DE DAWSON // SCHULTZ. ............................ 22
5.1.1.2. METODO DE DIAFANIZACION EN PECES..................................................... 23
5.2. REACTIVOS A IMPLEMENTAR EN LA INVESTIGACION ................................. 23
5.2.1 HIDROXIDO DE POTASIO. ................................................................................... 24
5.2.2 GLICERINA ............................................................................................................. 24
5.2.3 ACETONA ................................................................................................................. 24
6. BIOQUIMICA DE COLORANTES EN TEJIDO OSEO Y CARTILAGO A
IMPLEMENTAR EN TECNICA DE DIAFANIZACIN. ............................................... 27
6.1 ROJO DE ALIZARINA ................................................................................................ 27
6.2 AZUL DE ALCIAN. ..................................................................................................... 27
6.3 Embriologia del tejido oseo........................................................................................... 28
6.3.1. Desarrollo del mesodermo lateral. ............................................................................ 28
6.3.2. rganos derivados del mesodermo paraxial (sistema esqueltico) ........................... 29
6.3.3. Histogenia del cartlago ............................................................................................. 30
6.3.4 Histogenia de hueso. .................................................................................................. 30
6.3.5 Osificacion Intramembranosa. ................................................................................... 31
6.3.6 Osificacin intracartilaginosa o endocondral. ............................................................ 31
6.3.7 Desarrollo del esqueleto axial. ................................................................................... 34
6.3.8 Desarrollo del crneo ................................................................................................. 35
6.3.8.1 Neurocrneo cartilaginoso....................................................................................... 35
6.3.8.2 Neurocrneo membranoso....................................................................................... 35
6.3.8.3 Desarrollo de la cabeza sea a partir de arcos faringeos. ........................................ 36
7
6.3.8.4 Desarrollo de la cara. ............................................................................................... 36

6.3.8.5 Crneo del recin nacido. ........................................................................................ 37
6.3.8.6 Crecimiento postnatal del crneo. ........................................................................... 37
6.3.9 Desarrollo de la columna vertebral. ........................................................................... 38
6.3.9.1 Etapa cartilaginosa del desarrollo vertebral. ........................................................... 38
6.3.9.2 Etapa sea del desarrollo vertebral.......................................................................... 39
6.3.10 Desarrollo de las costillas. ........................................................................................ 39
6.3.11 Desarrollo del esternn............................................................................................. 40
6.3.12 Desarrollo del esqueleto apendicular. ...................................................................... 40
7. CONSIDERACIONES TICAS..................................................................................... 42
8. DISEO METODOLOGICO PARA LA ELABORACION DE PIEZAS
ANATOMICAS DIAFANIZADAS. .................................................................................. 43
8.1. TIPO DE ESTUDIO..................................................................................................... 43
8.2. Especmenes utilizados. .............................................................................................. 43
8.3. Variables...................................................................................................................... 43
8.3.1. Variable cualitativa nominal. .................................................................................... 43
9. INSTRUMENTOS. ......................................................................................................... 44
9.1 Equipos .......................................................................................................................... 44
9.2 Materiales. ..................................................................................................................... 45
10. FASES PARA LA ELABORACION DEL MATERIAL ANATMICO. .................. 46
11. RESULTADOS OPTENIDOS DE LAS TECNICAS DE DIAFANIZACIN
DURANTE CADA FASE. .................................................................................................. 48
11.1. FASE UNO: PRUEBA PRELIMINAR.................................................................. 48
11.1.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: PRIMERA FASE. ...................... 57
11.1.2 CONCLUSIONES FASE UNO: PRUEBA PRELIMINAR. ................................... 62
11.2. FASE DOS: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE LOS ANDES . ....................... 63
11.2.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: SEGUNDA FASE ...................... 72
11.2.2 CONCLUSIONES DE LA FASE DOS: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE
LOS ANDES ....................................................................................................................... 74
11.3. FASE TRES: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE CHILE ................................. 74
11.3.1 CONCLUSION FASE TRES: PROTOCOLO UNIVERSIDAD SANTO TOMAS
DE CHILE. .......................................................................................................................... 76
11. 4. FASE CUATRO: EXPERIENCIAS POSITIVAS FASE UNO Y DOS. ............. 77
11.4.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: CUARTA FASE......................... 83
11.4.2 CONCLUSION FASE CUATRO: EXPERIENCIAS POSITIVAS FASE UNO
Y DOS. ................................................................................................................................ 85
11.5. FASE CINCO: FETOS RATONES. ...................................................................... 86
11.5.1 CONCLUSION FASE CINCO: FETOS RATONES. ............................................. 92
11.6 FASE SEIS: PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN EXPERIENCIAS

POSITIVAS DE FASES 1, 3, 4, 5 EN CUATRO RATONES DE 17 DIAS. ................. 92
11.6.1 FIJACION DE CENTROS DE OSIFICACION: SEXTA FASE. ........................... 96
11.6.2 CONCLUSION FASE SEIS: PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN
EXPERIENCIAS POSITIVAS DE FASES 1,2, 4, 5 EN CUATRO RATONES DE 17
DIAS.................................................................................................................................... 98
11.7. PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN EXPERIENCIA PRELIMINAR
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA . ............................................................. 99
11.8 ANLISIS GENERAL DE RESULTADOS DE CADA FASE, DURANTE LA
ELABORACIN DE LAS PIEZAS ANATMICAS DIAFANIZADAS.......100
12. CONFIABILIDAD Y VALIDEZ. .............................................................................. 101
13. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES. ......................................................... 102
14. CRONOGRAMA. ....................................................................................................... 104
15.PRESUPUESTO...106
ANEXOS. .......................................................................................................................... 110
16. Bibliografa.................................................................................................................. 114
ndice de tablas.
Tabla 1. Datos de seguridad de reactivos. ........................................................................... 25
Tabla 2. Principales centros de osificacin y edad en la que se fusionan33
Tabla 3. Registro de reactivos fase uno............................................................................... 48
Tabla 4. Registro de reactivos fase dos ............................................................................... 63
Tabla 5. Registro de reactivos fase tres. .............................................................................. 75
Tabla 6. Registro de reactivos fase cuatro........................................................................... 77
Tabla 7. Registro de reactivos fase cinco ............................................................................ 86
Tabla 8. Registro de reactivos fase seis...92
Tabla 9. Resumen de reactivos y resultados fases 1,2 y 3 durante las tcnicas de
diafanizacin..........100
Tabla 10. Resumen de reactivos y resultado fases 4,5,6 y 7 durante las tcnicas de
diafanizacin.....100
Tabla 11: CRONOGRAMA SEGUNDO SEMESTRE 2013 ........................................... 104
Tabla 12: CRONOGRAMA PRIMER SEMESTRE 2014 ............................................... 104
Tabla 13: CRONOGRAMA SEGUNDO SEMESTRE 2014 ........................................... 105
Tabla 14: Presupuesto. ...................................................................................................... 106
Tabla 15: presupuesto detallado. ....................................................................................... 107
Tabla 16: Presupuesto reactivos qumicos.109
ndice de fotografas.
Fotografa 1 y Fotografa 2.................................................................................................. 42
Fotografa 3. Inmersin en KOH y fijacin con alcohol 70% ............................................ 50
Fotografa 4. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 0,2% .................................... 51
Fotografa 5. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 0,25% .................................. 51
Fotografa 6. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 0,35% y 0,45% ................... 52
Fotografa 7. Inmersin en Glicerina pura .......................................................................... 53
Fotografa 8. Inmersin por 15 das y recambio cada 7 das de Glicerina pura. ................. 54
Fotografa 9. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 0,2% .................................... 55
Fotografa 10. Inmersin en Glicerina pura ........................................................................ 56
Fotografa 11. Marcacin de centros de osificacin con rojo de alizarina primer, tercer,
quinto y sptimo da. .......................................................................................................... 59
Fotografa 12. Aspecto final de marcacin de centros de osificacin. ................................ 59
Fotografa 13. Desmanchado con alcohol al 70% e inmersin en solucin de hidrxido de
potasio. ................................................................................................................................ 59
Fotografa 14. Inmersiones en glicerina pura, alcohol y hidrxido de potasio. .................. 60
Fotografa 16. Inmersin y recambio de glicerina pura. ..................................................... 62
Fotografa 17. Fijacin en formol al 10% e inmersin en solucin de hidrxido de potasio
10%...................................................................................................................................... 65
Fotografa 18. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 10%. .................................. 66
Fotografa 19. Prdida y retiro de pelo. ............................................................................... 66
Fotografa 20. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 2%. .................................... 67
Fotografa 24. Primera inmersin en glicerina pura. ........................................................... 69
Fotografa 25. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,2% . ................................ 70
Fotografa 26. Segunda inmersin en glicerina pura. .......................................................... 70
Fotografa 28. Tercera inmersin en glicerina pura. ........................................................... 71
Fotografa 29. Pos-marcacin de centros de osificacin. .................................................... 72
Fotografa 30. Inmersion y desmanchado en solucion de hidroxido de potasio 0,45% y
0,5%..................................................................................................................................... 73
Fotografa 31. Inmersion en glicerina pura 10%. ................................................................ 73
Fotografa 32. Fijacion en formol al 10%............75
Fotografa 33. Cinco dias de inmersion en solucion de hidroxido de potasio 2% sin
glicerina. .............................................................................................................................. 76
10

10%.......79
Fotografa 36. Prdida y retiro de pelo. ............................................................................... 81
Fotografa 37. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 2% con glicerina. .............. 81
Fotografa 38. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,3% .................................. 82
Fotografa 39. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,35%. ............................... 82
Fotografa 40. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,4% .................................. 83
Fotografa 42. Inmersin y desmanchado en solucin de hidrxido de potasio 0,45%. ..... 84
Fotografa 43. Inmersin en glicerina pura. ........................................................................ 84
0,05%................................................................................................................................... 87
Fotografa 45. Aumento de concentracin de 0,05% a 0,1% de solucin de hidrxido de
potasio. ................................................................................................................................ 88
Fotografa 46. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio a 0,15% y fijacin con
alcohol al 70%. .................................................................................................................... 88
Fotografa 47. Solucin de hidrxido de potasio 0,2%. ...................................................... 89
Fotografa 48. Solucin de hidrxido de potasio superior a la permitida para obtener una
diafanizacin adecuada. ...................................................................................................... 89
Fotografa 49. Solucin de hidrxido de potasio a 0,1%. ................................................... 90
Fotografa 50. Solucin de hidrxido de potasio a 0,1%. ................................................... 90
Fotografa 52. Septimo dia de inmersion y recambio de la glicerina. ................................. 91
10%...................................................................................................................................... 94
Fotografa 55. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,2% y 0,3%. .................. 95
Fotografa 56. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,3% y 0,35%. ................ 96
11
INTRODUCCIN.
Las tcnicas de preservacin anatmicas son actualmente elementos pedaggicos y
cientficos de evidencia real, cientfica y verificable que permiten a la educacin de las
ciencias de la salud incorporar de manera temprana al estudiante al laboratorio y hacia
enfoques de investigacin que contribuyan a trasformar al estudiante pasivo-receptor en
activo-constructor que permita mejorar la calidad del proceso de enseanza del docente
trasmisor, en un mediador del proceso con el fin de lograr un aprendizaje significativo en
ciencias morfolgicas de seres humanos y otras especies.
La tcnica de diafanizacion la que permite corroborar la secuencia anatmica del proceso

de osificacin de mamferos (humanos, ratones) mediante el uso de sustancias corrosivas
(hidrxido de potasio) las cuales transparentan los tejidos a excepcin del tejido seo
brindan informacin importante para determinar la edad sea de un feto normal,
malformado o la relacin y comparacin sea evolutiva entre especies, desde una mirada
docente no existe en la Universidad Nacional una relacin directa de estudio verificable en
piezas anatmicas de la teora de la morfognesis sea por parte del estudiante. El proceso
de conservacin anatmica mediante diafanizacin otorga posibilidades investigativas en
el desarrollo de protocolos aplicables, sostenibles y reproductibles en el tiempo no solo en
sistema seo tambin en cardiovascular, digestivo y nervioso por las diferentes alternativas
para el procesamiento de especmenes mediante la tcnica de diafanizacin, el reto es
explorar el procedimiento de diafanizacin desde sus principios tcnicos, cientificos y
conocer las sustancias qumicas empleadas y lograr un ptimo resultado de manera costoefectiva. De una u otra manera, lograr especmenes diafanizados de excelente calidad con
poco deterioro en tiempo, ofrece la alternativa de la tcnica de diafanizacion como lnea de
profundizacin e investigacin de correlacin terico-prctica de morfognesis sea,
anatoma comparada y embriologa que permita el fortalecimiento y posicionamiento de la
Maestra de Morfologa Humana a nivel nacional e internacional.
12
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

Actualmente, hay disponibles tcnicas de preservacin anatmica protocolizadas
(plastinacin, inyeccin corrosin), con importancia y enfoque anatmico estructural. Entre
ellas, la tcnica de la diafanizacin, que consiste en transparentar tejido, con la intencin de
visualizar el sistema seo sin alterar su estructura macroscpica. Debido a la falta de
modelos de preservacin anatmica diferentes a inyeccin corrosin y plastinacin, no se
encuentran actualmente material de profundizacin y correlacin terico-prctica del
aprendizaje embriolgico de la morfognesis sea, que ayude a la formacin de los
estudiantes del departamento de morfologa de la facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia. La ausencia de investigaciones publicadas en diafanizacin en la
universidad (ver repositorio institucional de la biblioteca), y en la nica maestra de
morfologa humana de nuestro pas, constituye uno de los principales aportes de esta
investigacin. No obstante, en las mltiples tcnicas de diafanizacin (ver marco terico)
no se relacionan detalles de concentraciones, tiempos, purezas y calidad de los reactivos,
por lo tanto, el presente proyecto parte de la siguiente pregunta:
Cul es la tcnica de diafanizacin que puede ser implementada por docentes para la
enseanza de la morfologa y en la elaboracin de piezas anatmicas de morfognesis sea
de mamferos por parte del estudiante como estudio de correlacin terico-prctico en el
departamento de morfologa de la Universidad Nacional de Colombia?
13
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL
Establecer protocolo y piezas anatmicas de conservacin con la tcnica de

diafanizacin como material de enseanza a los estudiantes de pregrado y posgrado
del departamento de morfologa de la Universidad Nacional de Colombia.
2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:
Desarrollar un protocolo de diafanizacin que pueda ser implementado por docentes

y estudiantes en el departamento de morfologa de la Universidad Nacional de
Colombia.
Realizar la revisin terica de la tcnica de diafanizacin que permita su

implementacin.
Validar la tcnica, segn revisin terica, con el fin de obtener resultados de

diafanizacin en la elaboracin de piezas anatmicas.
14
3. JUSTIFICACIN.
La preservacin de cadveres y especmenes anatmicos es un proceso descrito desde la
antigedad; los egipcios aportaron al conocimiento mdico y de la industria funeraria
usando sustancias qumicas y tcnicas de embalsamar. Actualmente, hay muchas tcnicas
de preservacin anatmica, protocolizadas y con enfoque anatmico estructural.
Particularmente, entre ellas encontramos la tcnica de la diafanizacin, descrita en la
literatura de manera sencilla y puntual que busca explicar cmo transparentar tejidos con
base en la igualacin de los ndices de refraccin de la luz dentro y fuera del tejido, con la
intencin de permitir la visualizacin del tejido seo. Por tal razn, el presente proyecto
tiene como objetivo la generacin de piezas anatmicas preservadas con la tcnica de
diafanizacin, que sirvan como modelo pedaggico claro y costo-efectivo en la
morfognesis sea de mamferos. En el momento, no existen piezas diafanizadas para sus
estudios en el departamento de morfologa de la Facultad de Medicina y la maestra de
morfologa, que permitan la comprensin de la formacin sea en mamferos, que ayuden a
la determinacin de centros de osificacin membranosa y cartilaginosa, permitiendo el
anlisis de la anatoma comparada entre vertebrados y sus implicaciones evolutivas.
(Concha, 2006)
Al finalizar el desarrollo del proyecto de investigacin, se construirn piezas anatmicas
diafanizadas, con base en una tcnica implementada, que dar respuesta a la pregunta del
proyecto de investigacin.
15
4. MARCO DE REFERENCIA
4.1. Antecedentes mundiales

Tilotta Franoise, Lazaroo Bernard, Laujac M y Gaudy J, del Instituto de anatoma de la
Universidad de Saints-Pres, y la Universidad Descartes de Pars-Francia, realizaron la
investigacin titulada: Estudio de la vascularizacin de la aurcula mediante diseccin y
diafanizacin, en la que parten de afirmar que el proceso de vascularizacin de la oreja
est mal documentado, a pesar de los avances en la auriculoterapia y ciruga reconstructiva;
el objetivo fue describir la distribucin arterial, usando dos tcnicas: diafanizacin y la
diseccin anatmica. El estudio fue llevado a cabo despus de la inyeccin intravascular de
ocho pabellones auriculares diafanizados y diez que fueron disecados y diseccionados. La
conclusin mostr que la oreja es irrigada por una rama auricular anterior, que surge en la
arteria temporal superficial y una rama posterior que nace de la arteria auricular posterior
en ocho de cada diez casos, y los restantes dos casos, en la arteria occipital. En relacin a la
diafanizacin, se revel que la distribucin arterial tridimensional en los especmenes
conservados, a travs de la tcnica mencionada, tiene un uso didctico para complementar
la diseccin anatmica (Tilotta F, 2009).
Rodriguez Baeza en colaboracin con M. Rodriguez Palos de la Universidad Autonoma de

Barcelona realizaron un estudio de revisin titulado Determinacin mediante tcnicas de
corrosin, diafanizacin y microscopa electrnica de barrido de los territorios vasculares
arteriales, con especial referencia a la irrigacin de la medula espinal el objetivo fue
mediante tcnicas anatmicas estudiar la variacin de vascularizacin en rganos del
cuerpo humano para concluir con la medula espinal, una de estas tcnica anatmicas fue la
diafanizacion, denominada de Spalteholz donde se transparento utilizando xilol o derivados
y mantenimiento en solucin de benzoato de benzilo y salicilato de metilo (Rodrguez
Baeza, 2004).
Pedro Henrique Duarte Frana De Castro, J. V realizaron el estudio titulado Evaluacin
de la filtracin marginal de diferentes materiales restauradores temporales en Endodoncia
16
El objetivo es evaluar la filtracin marginal coronal de tres materiales restauradores

temporales utilizados para el sellado del conducto radicular despus del tratamiento
endodntico. La metodologa del estudio cosiste en un total de 88 dientes unirradiculares
fueron sometidos a preparacin biomecnica y se llen por la tcnica de condensacin
lateral. Despus de proceso de obturacin, los dientes fueron separados al azar en cuatro
grupos, siendo dos dientes de cada grupo utilizado como control positivo y negativo. A
continuacin, las muestras se sumergieron en tinta china durante 30 y 60- das, siendo 10
muestras para cada intervalo de tiempo y luego sometidos al proceso de diafanizacin en el
cual las races se sumergieron en un receptculo que contiene 5% de cido clorhdrico.
Despus de descalcificacin, las races se lavaron con agua corriente y se colocan en escala
ascendente de alcohol (70%, 80%, 92% y 100%) durante 1 h en cada escala, seguido por
inmersin en salicilato de metilo para el proceso de clarificacin. Despus de diafanizacin,
las muestras se colocaron en un portaobjetos de vidrio y se llevaron al microscopio
ptico para evaluar la profundidad de fuga coronal. La conclusin principal del estudio fue
que ninguno de los materiales fue capaz de prevenir la filtracin marginal en el plazo de 30
y 60 das. (Pedro Henrique Duarte Frana De Castro, 2013)
4.2 Antecedentes latinoamericanos

Vanesa del Carmen Reyes Rios, Agustn Alfredo Valiente Schipani, entre otros,
desarrollaron la investigacin Diafanizacin de embriones de Codorniz como experiencia
didctica, con el objetivo de mostrar los resultados obtenidos mediante la diafanizacin
aplicada en embriones de codorniz, realizada por estudiantes del segundo ao de la carrera
de medicina de la Facultad de Ciencias Mdicas de Universidad Nacional de Crdoba,
Argentina. Como experiencia didctica, la metodologa consisti en que grupos de tres
alumnos trabajaron con ejemplares de embriones de codorniz, que fueron fijados en formol
por 30 das. La transparencia de las piezas anatmicas se realiz con una solucin de
hidrxido de potasio. Luego se utiliz el colorante Rojo de alizarina para el tejido seo;
dicha actividad permiti la observacin del tejido en cuestin. Los alumnos realizaron
diversas experiencias, introduciendo modificaciones de la tcnica de diafanizacin, segn el
tamao de la pieza, permeabilidad tisular y tiempo de exposicin de las soluciones
17
utilizadas. En conclusin, la tcnica de diafanizacin posibilita corroborar la secuencia

anatmica del proceso de osificacin en diferentes localizaciones y permite tambin
determinar la edad sea de un gestante normal. (Reyes Rios & Vanesa del Carmen, 2012)
Bulfon, M; Carabajal, M; Porcari,C. en la Universidad Nacional de Crdoba, Argentina,

realizaron el trabajo titulado Diafanizacin y tincin diferencial de hueso y cartlago en
embriones y pequeos vertebrados
que tiene como objetivo la capacitacin para la
ejecucin de las tcnicas de tincin diferencial en vertebrados , fueron utilizados un total de

cinco ejemplares representantes de distintos vertebrados (un pez, una rana, un reptil, una
ave y una comadreja ) El material empleado fue fijado previamente en formol 4% y
conservado en alcohol 70%. La preparacin de las piezas se realiz de acuerdo al siguiente
protocolo: 1) Identificacin del espcimen, 2) Morfometra, 3) Extraccin del tegumento,
evisceracin y remocin de ojos. 4) Lavado con agua corriente, 5) Blanqueamiento en
Perxido de Hidrgeno al 10 %, 6) tincin de cartlago, los especmenes se sumergieron en
una solucin de Azul de alcian y luego se post-fijaron en alcohol 100%, 7) Para teir hueso
se embebieron en una solucin de KOH al 3% por 24 hs. Luego se agregaron 8 gotas de
solucin acuosa de alizarina roja por cada 100 ml, la solucin fue controlada hasta lograr la
transparencia y el color deseado. 8) Posteriormente se transfirieron a soluciones de
glicerina al 50 y 75% por 24 hs y se conservaron en glicerina anhidra pura. (Bulfon,
Carabajal, & Porcari, 2012)
4.3. Antecedentes nacionales.

Lynda Tamayo Arango, Paula Suarez Avendao, entre otros, realizaron el estudio titulado:
Modelo didctico del desarrollo del embrin de pollo con diafanizacin modificada de
Dawson y tcnica de tincin, publicado en la revista Colombiana de Ciencias Pecuarias en
el 2012. El objetivo del trabajo fue la creacin de un modelo didctico, que mostrara el
desarrollo del embrin de pollo, usando la tcnica modificada de diafanizacin de Dawson
y la tcnica de tincin, que permite a los centros de osificacin ser vistos. La metodologa,
consisti en utilizar embriones de pollo desde el da 5 al da 21, que fueron diafanizados
con KOH; despus se tieron con rojo de alizarina, y luego fueron almacenados en glicerol.
18
Los resultados de crecimiento de los centros de osificacin primarios durante el desarrollo

embrionario, fueron fciles de visualizar, y se pudo concluir que este es el primer informe
que muestra un modelo anatmico de todas las etapas embrionarias del desarrollo del pollo.
(Tamayo LJ, 2012)
Ana Claudia Villegas, Mara De Los ngeles Quiroga y Daniela Cleves de la Universidad
de los Andes, realizaron el proyecto titulado; Diafanizacin: visualizacin del desarrollo
seo en fetos. En l, se muestra cmo la visualizacin del sistema seo, se llev a cabo por
medio de exploracin de dos tcnicas o procedimientos de diafanizacin; la primera fue
tcnica Modificada de Dawson, la cual no tuvo resultados satisfactorios en la obtencin de
transparentacin y result ms costosa y menos efectiva en la transparentacin del
espcimen y visualizacin del sistema seo. La segunda tcnica de diafanizacin fue por
maceracin de Dawson/Schultz, y evidenci resultados en los que se observ cierto grado
del progreso de transparentacin, pero qued inconclusa en lo referente a los centros de
osificacin del sistema seo del embrin. En conclusin, el proyecto muestra que la
diafanizacin es una tcnica morfolgica que se usa en conjunto con la tincin para poder
exponer, visualizar y analizar los centros de osificacin en un feto, antes de llevar a cabo el
proceso y se debe hacer un estudio previo exhaustivo de la tcnica, el procedimiento,
materiales y las condiciones ambientales, para asegurar que el experimento sea exitoso.
(Villegas, Quiroga, & Cleves, 2012)
Carlo Meja realizo diafanizacion e informe titulado Secuencia de aparicin de centros de
osificacin en embriones y fetos bovinos mediante la tcnica de diafanizacin y tincin
sea con alizarina el objetivo general es determinar la secuencia de aparicin de centros de
osificacin en embriones y fetos bovinos mediante la tcnica modificada de Dawson que se
realizo en etapas: fijacin con formol al 5%, deshidratacin con hidrxido de potasio y
etano al 70%, tincin con rojo de alizarina y diafanizacin con hidrxido de potasio diluido
en glicerina, los resultados fueron registrados en tablas que determinan estructuras sea,
edad, longitud y tipo se osificacin (ejemplo: clavcula, 37 das, longitud 2,2 cm y
osificacin membranosa) (Meja, 2013)
19
4.4. Antecedentes de investigacin asociados al estudio en la Universidad

Nacional de Colombia.
Actualmente, no hay investigaciones en diafanizacin publicadas en el repositorio de la
biblioteca de la Universidad Nacional de Colombia que se encuentren aprobadas y
establecidas para optar por un ttulo de posgrado.
20
5. MARCO CONCEPTUAL.
5.1. Diafanizacin.
La visualizacin del desarrollo seo en animales o fetos humanos por diafanizacin es una
tcnica conservacin anatmica de los tejidos de un espcimen que se someten a una
despigmentacin, con el fin de estudiar su anatoma del sistema seo. Independientemente
del tipo de mtodo, todos tienen el mismo fundamento, y siguen los siguientes pasos:
primero, se realiza una fijacin del espcimen, con el fin de mantener las clulas con las
propiedades intactas. Esto se logra al estimular la formacin de enlaces cruzados entre las
protenas e inactivar enzimas celulares, para impedir que se presente una autolisis y por
tanto, una degradacin post mortem de los fetos o del espcimen. En segunda instancia,
para poder visualizar y analizar el sistema seo, se transparenta todo el tejido a excepcin
del sistema seo en desarrollo; a este proceso, por el cual una muestra se hace difana o
transparente, mediante tcnicas que igualan los ndices de refraccin de la luz del interior
del rgano con el medio que lo contiene (Concha, 2006), se le conoce como diafanizacin,
sumergindolo en una solucin de hidrxido de potasio (KOH), el cual es miscible, tanto en
alcohol como con el medio de inclusin, y a la vez es bastante corrosivo, ya que realiza una
reaccin de xido-reduccin, deshidratando todos los tejidos. Por ltimo, con el objetivo de
exponer los huesos en desarrollo, la edad del embrin y posibles anomalas seas, los
centros de osificacin se tien con un colorante especfico, comnmente rojo de alizarina.
5.1.1. Procedimientos de diafanizacin.
Actualmente, existen dos procedimientos diferentes de diafanizacion, la primera es la
Tcnica modificada de Dawson que consiste en someter al espcimen a deshidratacin
con alcohol al 70%, inmersin en hidrxido de potasio puro con aclaramiento en hidrxido
de amonio (NH4OH) junto con glicerina pero, segn literatura y antecedentes de
investigacin, no es muy satisfactoria la obtencin de resultados por medio de la tcnica
modificada de Dawson. Por tal razn, en este proyecto se utilizar la tcnica de
diafanizacin por maceracin, llamada Tcnica de Dawson // Schultz
21
5.1.1.1. Tcnica de maceracin de Dawson // Schultz.

La tcnica de Dawson/Schultz (Villegas, Quiroga, & Cleves, 2012) es mucho ms sencilla
que la tcnica de Dawson modificada; sin embargo, tarda ms tiempo en generar resultados.
Es fcil obviar lo anterior debido a que no incluye los pasos de fijacin, ni de dilucin de
las grasas; pero la concentracin del hidrxido de potasio es menor, por lo que la
diafanizacin toma ms tiempo.
El espcimen se encuentra sumergido glicerina, y
en una solucin de KOH, en
concentraciones menores al 15%. En el transcurso de cuatro semanas aproximadamente, se

evidencian cambios notorios en la composicin fsica y la transparentacin del tejido. El
proceso, segn el protocolo de la Universidad de los Andes es el siguiente:
1. Fijacin de la muestra en formol 10%

2. Tcnica de tincin de centros de osificacin.
3. Diafanizacin siguiendo el esquema:
a) Solucin de Hidrxido de potasio + H2O al 75 % (KOH 10%,) + 25% de

glicerina tcnica. (5 das).
b) Solucin de 65% de (KOH 10%)+ 35% de glicerina tcnica
c) Solucin de 50% de (KOH 2%)+ 50% de glicerina tcnica
d) Solucin de 100% de glicerina tcnica. Si en esta etapa la muestra no se torna
transparente, se puede volver a los dos pasos anteriores. (Por lo general se
requiere cambiar varias veces la solucin en glicerina pura hasta obtener una
transparencia adecuada).
En la universidad Santo Tomas de Chile (Concha, 2006) se desarrolla as:

1. Fijacin de la muestra en formol 10%
2. Tcnica de tincin de centros de osificacin.
3. Diafanizacin siguiendo del esquema:
a. Solucin de hidrxido de potasio de (KOH 2% o 3%). Esta solucin se puede
renovar varias veces segn el espesor de la muestra.
22
b. Solucin de 75% de (KOH 2%)+25%glicerina de tcnica.

c. Solucin de 50% de (KOH 2%)+50%glicerina de tcnica.
d. Solucin de 25% de (KOH 2%)+75%glicerina de tcnica.
e. Solucin de glicerina tcnica. Si en esta etapa la muestra no se torna
transparente, se pueden volver a los pasos C o D. Por lo general, se requiere
cambiar varias veces la solucin en glicerina pura hasta obtener una
transparencia adecuada
5.1.1.2. Mtodo de diafanizacin en peces (Mikolji, 2010)

1. Fijacin con formol.
2. Deshidratacin con alcohol etlico al 90% por 24h aproximadamente.
3. Coloracin de cartlago con azul de alcian; se recomienda de horas hasta uno (1) o
dos (2) das.
4. Transparentacin preparando una mezcla de KOH, (no especifica la concentracin)
y perxido de hidrogeno. El tiempo varia de una (1h) a varias horas segn
resultados.
5. Digestin de la musculatura con tripsina en una base de tretraborato.
6. Coloracin de tejido seo con rojo de alizarina recomienda aproximadamente por
24h.
5.2. Reactivos a implementar en la investigacin.

La informacin suministrada en esta investigacin, en relacin a reactivos qumicos que se
utilizaron, fue tomada del Chemical Abstracts Service (CAS), una divisin de American
Chemical Society (ACS), que proporciona la mayor base de datos de evidencia revelada,
ordenada (numero CAS) pblicamente sobre reactivos qumicos, con el objeto de que
garantice la seguridad de la salud humana y el medio ambiente. As, se genera por
elaboracin propia un cuadro de seguridad de cada uno de los reactivos utilizados y se hace
una definicin breve, concisa de los reactivos utilizados:
23
5.2.1 Hidrxido de potasio.

El hidrxido de potasio (KOH) es un slido a temperatura ambiente y se fabrica a partir de
cloruro de potasio por procesos electroqumicos. El hidrxido de potasio puro es una
sustancia fuertemente alcalina (pH alto) que se disocia completamente en el agua en el ion
potasio (K +) e iones de hidrxido (OH-). La disolucin en agua genera calor, por lo que
puede ocurrir una vigorosa reaccin cuando al hidrxido de potasio se aade al agua y por
lo tanto, es sumamente corrosivo, por lo dicho anteriormente este reactivo se empleara para
tal fin en los tejidos durante la elaboracin de las piezas anatmicas del presente proyecto
de investigacin. (Euro Chlor, 2014).
5.2.2 Glicerina.
El glicerol o glicerina, tambin conocido como glicerina o 1, 2,3 propanotriol, es un
compuesto alcohlico con tres grupos OH (hidroxilos). La palabra glicerol, procede del
griego Glykos, que significa dulce. Posee un aspecto de lquido viscoso, no tiene color,
pero si un caracterstico olor, adems de un sabor dulce. Adems el glicerol es un
compuesto higroscpico, lo que quiere decir que tiene la capacidad de ceder o absorber la
humedad presente en el medio ambiente que lo rodea. Adems es fcilmente soluble en
agua, y se descompone en ebullicin, en la cual entra a una temperatura de 290C. Es un
compuesto lquido si se encuentra a temperatura ambiente (La Gua, 2010). Dentro de la
industria farmacutica, la glicerina USP tiene un papel importante en la produccin de los
siguientes medicamentos: anestsicos, pastillas, grageas, cpsulas, supositorios, productos
para combatir la infeccin de odo, jarabes (como excipiente), disolvente (para iodo, timol,
bromo, cloruro de mercurio, alcaloides, entre otros), antispticos, inhibidores de cambios
enzimticos en procesos de fermentacin de cremas, ungentos y pastas (QuimiNet, 2011).
5.2.3 Acetona
La acetona o propanona es un compuesto qumico de frmula qumica CH3(CO)CH3 del
grupo de las cetonas que se encuentra naturalmente en el medio ambiente a temperatura
ambiente, se presenta como un lquido incoloro de olor caracterstico. Se evapora
24
fcilmente, es altamente inflamable y es soluble en agua. Es utilizada como disolvente

general ms empleada en tcnicas industriales debido a sus excelentes propiedades
disolventes de grasas, aceites, ceras, hules, plsticos, lacas y barnices. Se usa en la
manufactura de algunos explosivos, rayn, pelculas fotogrficas, elaboracin de
removedores de pinturas y barnices, purificacin de parafinas, en la deshidratacin y
endurecimiento de tejidos, en la extraccin de algunos productos vegetales y animales y
como materia prima en una gran variedad de sntesis en qumica orgnica (IPCS INCHEM,
1999).
Tabla 1. Datos de seguridad de reactivos.
Reactivo(C
Peligro
Recomendaciones
AS N )
de Clasificacin
manipulacin
de riesgo
Almacenamien
to
Guantes de proteccin,
Recipiente
Hidrxido
mascarilla,
cerrado
no
de
ocular
y Sustancia
expuesto
al
peligrosa
ambiente
potasio
proteccin
(CASN:
Corrosivo
concentraciones
1310-58-3)
e irritante
superiores
a 2%
es
corrosivo.
temperatura
ambiente.
Recipiente
de Irritante
Rojo
No ingerir o inhalar el
alizarina
cutneo,
(CAS
ocular
N:58005)
respiratori
polvo, uso guantes de Sustancia no expuesto

y proteccin, mascarilla y peligrosa
protector ocular.
o.
de Sustancia
alcian (CAS no
N:
99-2)
33864- peligrosa
ambiente
temperatura
ambiente.
No se precisan medidas
Azul
cerrado
especiales, en caso de
inhalacin
suministrar Sustancia no
aire fresco y en caso de peligrosa

contacto con la piel
aclarar con abundante
25
no
al
y
agua.
Se
descompo
Glicerol
ne al arder
En
(CAS N:56- e irritante No ingerir o inhalar.

81-5)
cutneo,
ocular
Sustancia no cerrado
peligrosa
recipiente
temperatura
menor a 60C.
respiratori
o.
Fuente: Elaboracin propia, Septiembre de 2014
26
6. BIOQUIMCA DE COLORANTES EN TEJIDO OSEO Y CARTILAGO A

IMPLEMENTAR EN TCNICA DE DIAFANIZACIN.
6.1 Rojo de alizarina.
La
Alizarina
1,2-dihidroxiantraquinona,
es
uno
de
los
diez
ismeros
dihidroxiantraquinona. Su estructura molecular puede ser vista como derivado de

antraquinona por sustitucin de dos tomos de hidrgeno por grupos hidroxilos vecinos,
cuya frmula es C14H8O4 generado de la planta de rubia. Es soluble en hexano y
cloroformo, y se puede obtener a partir de este ltimo en forma de cristales de color rojo
prpura. La alizarina cambia de color en funcin del pH de la solucin que se encuentra,
por lo que es un indicador de pH.
El rojo de alizarina es utilizado en ensayos bioqumicos para determinar, cuantitativamente

por colorimetra, la presencia de deposicin calcificada por las clulas de un linaje
osteognico, los depsitos de calcio en el sistema vascular, crecimiento y edad del hueso.
En la prctica clnica, se utiliza para teir lquido sinovial, y evaluar la presencia de
cristales de fosfato de calcio. En otras disciplinas como la geologa, se utiliza como
marcador para indicar los minerales de carbonato de calcio, calcita y aragonita. En este
proyecto de investigacin se utilizara como un marcador de fase inicial hacia la
mineralizacin de la matriz sea calcificada en proceso de formacin de centros de
osificacin y tincin de matriz sea mineralizada en el hueso ya formado o maduro. (Ecentro, 2013)
6.2 Azul de alcian.

Los Azules alcian, son una familia de colorantes bsicos polivalentes, de los cuales, el azul
de alcian 8G ha sido histricamente el ms comn y el miembro ms fiable. Es un colorante
bsico tetravalente con un ncleo de ftalocianina de cobre, con tres o cuatro cadenas
laterales de isotiouronio independientes, que imparten su volumen y cargas positivas. Se
utilizara en este proyecto de investigacin para teir polisacridos cidos, tales como
glucosaminoglicanos en los cartlagos y otras estructuras del cuerpo, algunos tipos de
mucopolisacridos, glicoclix sialilado de clulas etc. Las partes de tejido que se tien
27
especficamente por este medio de contraste se vuelven azules o azul-verde despus de la

tincin y se llaman "Alcianophilic (E-centro, 2013)
6.3. Embriologa del tejido seo.

Inicialmente para hablar de sistema esqueltico se debe partir de que este se desarrolla de
clulas mesenquimtosas que son de origen del mesodermo y de la cresta neural que son de
origen del ectodermo (Moore, Persaud, & Torcha, 2013). Hacia el decimosptimo da las
clulas cercanas a la lnea media proliferan y forman una placa gruesa de tejido conocida
como mesodermo paraxial. Ms hacia los lados, la capa mesodrmica contina siendo
delgada y se conoce como placa lateral. Con la aparicin y la coalescencia de cavidades
intercelulares en la placa lateral, este tejido se divide en dos capas: una (1) capa que se
contina con el mesodermo que recubre el amnios, llamada capa mesodrmica somtica o
parietal. Y una segunda capa que se contina con el mesodermo que recubre el saco
vitelino, llamada capa mesodrmica esplcnica o visceral. Juntas, estas capas delimitan una
nueva cavidad acabada de formar, la cavidad intraembrionaria, que se contina con la
cavidad extraembrionaria de cada lado del embrin. El mesodermo intermedio conecta el
mesodermo de la placa paraxial con el mesodermo de la placa lateral (Sadler & Langman,
2011).
6.3.1. Desarrollo del mesodermo lateral.

El mesodermo lateral es separado longitudinalmente en dos sectores por el desarrollo de un
espacio embrionario llamado celoma intraembrionario. As, el sector dorsal es llamado
ahora hoja parietal o somtica del mesodermo lateral y se ubica bajo el ectodermo,
formando la pared corporal del embrin; en cambio el sector ventral es llamado hoja
visceral o esplcnica del mesodermo lateral y se ubica sobre el endodermo. La hoja parietal
dar origen a las serosas: pleura, pericardio y peritoneo; y la hoja visceral formar la pared
muscular del tubo digestivo y de la va respiratoria baja. (Sadler & Langman, 2011)
28
6.3.2. rganos derivados del mesodermo paraxial (sistema esqueltico)

En este prrafo se describe el desarrollo del sistema esqueltico que se origina de las
clulas mesenquimatosas del mesodermo paraxial (esqueleto axial) principalmente
aclarando que el esqueleto apendicular se origina del mesodermo de la placa lateral. A
medida que se forman la notocorda y el tubo neural, el mesodermo intraembrionario lateral
a estas estructuras sufre un engrosamiento y forma dos columnas longitudinales de
mesodermo paraxial. Hacia finales de la tercera semana, estas columnas muestran
segmentacion en bloques de mesodermo denominadas los somitas. La formacin de los
somitas a partir del mesodermo paraaxial implica la expresin de genes de la va Notch (va
de sealizacin Notch), genes Hox y otros factores sealizadores. Estos somitas, que
corresponden a engrosamientos del mesodermo paraxial, presentan una secuencia de
aparicin precisa, de manera que es posible determinar la edad del embrin conociendo el
nmero de somitas (Moore, Persaud, & Torcha, 2013). Los primeros pares de somitas
aparecen el da 20 en la regin cervical del embrin y continan apareciendo de a tres a
cuatro pares por da hasta alcanzar un nmero de 42 a 44 pares. Los pares de somitas se
denominan segn su ubicacin: 4 occipitales (de los cuales el primer par involuciona), 8
cervicales, 12 torcicos, 5 lumbares, 5 sacros y 8 a 10 coxgeos (de los cuales involucionan
los ms caudales). Cada somita hacia el comienzo de la cuarta semana se diferencia en dos
porciones:
La parte dorso-lateral es el dermomiotoma; las clulas de la regin del miotomo forman
mioblastos (clulas musculares primitivas dorsales) y las de la regin del dermatomo
constituyen la dermis.
La parte ventro-medial, es el esclerotoma, cuyas clulas toman un polimorfismo y forma un
tejido laxo llamado mesenquima que es un tejido embrionario que migra y se puede
convertir en fibroblastos, condroblastos u osteoblastos que originan las vrtebras, costillas y
tejido conectivo (Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
Todo el tejido esqueltico se origina en clulas de morfologa mesenquimatosa como
moldes cartilaginosos de los huesos que despus se forman, pero el origen del mesnquima
vara en las diferentes regiones del cuerpo. En el tronco el mesnquima a partir del cual se
desarrolla el esqueleto axial segmentario (es decir, la columna vertebral, las costillas y el
esternn), se origina de la porcin esclerotmica (ventromedial) de los somitas
29
mesodrmicos, en tanto, que el esqueleto apendicular (los huesos de las extremidades con
sus respectivas cinturas) se deriva de la mesnquima del mesodermo de la placa lateral
(somatopleura).
6.3.3. Histogenia del cartlago.

El cartlago se desarrolla a partir del mesnquima en reas destinadas a condrificacin y
aparece por primera vez en el embrin a lo largo de la quinta semana. Las clulas
mesenquimatosas proliferan y se redondean. Las clulas formadoras de cartlago o
condroblastos secretan fibrillas de colgeno y la sustancia fundamental de la matriz.
Despus se depositan fibras de colgeno o elsticas en la sustancia intercelular o matriz. Se
pueden distinguir tres tipos de cartlago en funcin del tipo de matriz formada (Moore,
Persaud, & Torcha, 2013):
Cartlago hialino: el tipo de distribucin ms amplia en articulaciones(cartlagos

costales).
Fibrocartlago: como en los discos intervertebrales.
Cartlago elstico: (por ejemplo en el pabelln auditivo)
6.3.4 Histogenia del hueso.

Los huesos aparecen como condensaciones de clulas mesenquimales que constituyen
modelos seos. La condensacin delimita el inicio de la actividad gnica selectiva que
precede a la diferenciacin celular. Los miembros de la familia del factor de crecimiento
transformante BETA (TGF-B) estn implicados en varias etapas de la formacin del hueso.
La mayora de los huesos planos se desarrollan en el mesnquima en el interior de vainas
membranosas pre-existentes; este tipo de osteogenia se denomina formacin sea
intramembranosa. Los modelos mesenquimales de la mayor parte de los huesos de las
extremidades se transforman en modelos seos de cartlago, que posteriormente sufren
osificacin de tipo endocondral. Las protenas morfogenticas de hueso (BMP5 y BMP7),
el factor de crecimiento Gdf5, miembros de la superfamilia de TGF-B y otras molculas de
transmisin de seales participan como reguladores endgenos del desarrollo esqueltico
(Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
30
6.3.5 Osificacin intramembranosa.

Este tipo de formacin sea se produce en el mesnquima que ha originado una vaina
membranosa, de donde procede el trmino osificacin membranosa. El mesnquima se
condensa y aumenta su vascularizacin; algunas clulas se diferencian en osteoblastos
(clulas formadoras de hueso) y comienzan a depositar matriz o sustancias intercelulares, el
tejido osteoide o pre-hueso. Los osteoblastos estn casi totalmente separados entre s y se
mantienen en contacto por medio de unas pequeas prolongaciones. A continuacin, se
deposita fosfato clcico en el tejido osteoide conforme ste se organiza en hueso. Los
osteoblastos del hueso quedan atrapados en la matriz y se convierten en osteocitos. En un
principio, el hueso nuevo carece de un patrn de organizacin, pero pronto se organizan las
espculas de hueso en lminas o capas. Alrededor de los vasos sanguneos aparecen lminas
concntricas que constituyen sistemas haversianos. Algunos osteoblastos permanecen en la
periferia del hueso en desarrollo y continan depositando capas para dar lugar a placas de
hueso compacto. Este ambiente esponjoso se acenta, en cierta medida, por la accin de
unas clulas de distinto origen, los osteoclastos, que reabsorben hueso. En los espacios
intersticiales del hueso esponjoso el mesnquima se diferencia en la mdula sea. Durante
la vida fetal y posnatal tiene lugar una remodelacin continua de hueso debido a la
actividad simultnea de osteoclastos y osteoblastos. Los estudios sobre los sucesos
celulares y moleculares que acontecen a lo largo de la formacin sea embrionaria sugieren
que la osteogenia y la condrogenia se programan en las fases iniciales del desarrollo y
representan procesos independientes influidos por factores vasculares (Moore, Persaud, &
Torcha, 2013).
6.3.6 Osificacin intracartilaginosa o endocondral.

Este tipo de formacin sea ocurre sobre modelos cartilaginosos pre-existentes. Por
ejemplo, en un hueso largo, el centro primario de osificacin aparece en la difisis, que
forma el cuerpo del hueso, donde las clulas del cartlago aumentan de tamao
(hipertrofia), la matriz se calcifica y las clulas mueren. Al mismo tiempo se deposita una
delgada capa de hueso bajo el pericondrio que rodea a la difisis; de este modo, el
pericondrio se transforma en el periostio. La invasin de tejido conjuntivo vascular del
31
periostio degrada el cartlago. Algunas clulas invasoras se diferencian en las clulas

hematopoyticas responsables de la formacin de clulas sanguneas de la mdula sea.
Otras clulas invasoras se convierten en osteoblastos que depositan matriz sea en las
espculas del cartlago calcificado. El proceso contina hacia las epfisis o extremos del
hueso. Las espculas seas se remodelan por accin de los osteoclastos y los osteoblastos.
El alargamiento de los huesos largos se produce en la unin diafiso-epfisaria. El
alargamiento seo depende de las placas epifsarias de cartlago (placas de crecimiento),
cuyos condrocitos proliferan y participan en la formacin de hueso endocondral. Las
clulas cartilaginosas de la regin diafisoepifisaria proliferan mediante mitosis. Hacia la
difisis, las clulas cartilaginosas se hipertrofian y la matriz se calcifica y se rompe en
espculas por un tejido vascular originado en la mdula o cavidad medular. En esas
espculas se deposita hueso, cuya reabsorcin mantiene relativamente constante la longitud
de las masas seas esponjosas y hace crecer la cavidad medular.
La osificacin de los huesos de las extremidades se inicia hacia el final del perodo
embrionario y posteriormente supone una importante demanda de calcio y fsforo para la
madre. Por ello, se recomienda a las embarazadas que mantengan una ingesta adecuada de
estos elementos con el fin de mantener sanos sus huesos y dientes. La regin de formacin
sea en el centro del cuerpo de un hueso largo es el centro de osificacin primario.
Al nacer, los cuerpos o difisis se encuentran osificados en gran medida, pero la mayora de
los extremos o epfisis son an cartilaginosos. Casi todos los centros de osificacin
secundarios aparecen en las epfisis a lo largo de los primeros aos posteriores al
nacimiento. Las clulas cartilaginosas de la epfisis se hipertrofian y posteriormente quedan
invadidas por un tejido conjuntivo vascular. La osificacin se extiende en todas las
direcciones y solamente el cartlago articular y una placa transversal de cartlago, la placa
epifisara de cartlago, mantienen su naturaleza cartilaginosa. Tras finalizar el crecimiento,
esta placa es sustituida por hueso esponjoso; las epfisis y la difisis se fusionan y no se
produce ninguna elongacin posterior del hueso.
En la mayora de los huesos, las epfisis se han fusionado con la difisis alrededor de los 20
aos de edad, esta fusin de centros de osificacin ya identificados ha permitido generar
este indicador que presenta una variacin un poco mayor entre las edades biolgica y
cronolgica que la erupcin dental pero es una medida bastante certera de la edad.
32
Conociendo la edad precisa en que se fusiona cada epfisis con su difisis y observando el
grado en que lo haya hecho, podemos determinar la edad del individuo como se puede
observar en la tabla 2. El crecimiento del dimetro de un hueso es consecuencia del
depsito de hueso en el periostio, as como de la reabsorcin en la superficie medular. La
velocidad de depsito y reabsorcin estn equilibradas con el fin de regular el grosor del
hueso compacto y el tamao de la cavidad medular. La reorganizacin interna del hueso
contina toda la vida. El desarrollo de los huesos irregulares es semejante al de las epfisis
de los huesos largos. La osificacin comienza de forma central y se extiende en todas las
direcciones. Adems de la osificacin membranosa y endocondral, el tejido condroide
tambin se diferencia a partir del mesnquima y actualmente se acepta que constituye un
factor importante de crecimiento esqueltico (Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
Tabla 2. Principales centros de osificacin y edad en la que se fusionan.

EDAD
MUJERES
HOMBRES
Al nacer Extremo inferior del fmur

Entre 1 Falanges proximales de los cuatro ltimos dedos de la mano
y 2 aos
2 aos
Cuatro ltimos metacarpianos, primer metatarsiano, falanges
proximales de los dedos del pie, falange distal del primer dedo del pie.
3
Rotula, peron, segundo y tercer Falange proximal del pulgar.
metatarsianos; falange medial del Falanges medias del tercero y
segundo, tercer y cuarto dedos del cuarto dedos de la mano,
pie.
hueso navicular del tarso,
segundo cuneiforme y cuarto
metatarsiano.
4
Cabeza del radio y fusin de la Semilunar,
navicular
y
tuberosidad mayor de la cabeza del trocnter mayor.
humero
5 aos
Epfisis distal del cubito, semilunar. Cabeza del radio, proximal del
peron y fusin del tubrculo
mayor de la cabeza del
humero.
6 aos
7 aos
8 aos
9 aos
10 aos
Epicndilo medial y distal del cubito

Falange distal de meique, fusin del isquion y el pubis.
Olecranon
Apfisis del calcneo
Trclea y piciforme
Fusin de las ramas
isquion y pubis
Trclea y olecranon
33
del
11 aos
12 aos
13 aos
Epicndilo lateral
Piciforme
Epicndilo lateral
Fusin del leon, isquion y pubis
Fusin de la trclea con el
epicndilo lateral.
14 aos Acromion. Cresta iliaca y trocnter menor, fusin del olecranon,
epfisis superior del radio, cabeza del fmur, cabeza del fmur, distal
de la tibia y peron
16 aos
Fusin de la epfisis inferior
del humero, epicndilo medial,
olecranon y cabeza del radio.
17 aos Fusin de la cabeza del fmur, Fusin del acromion, epfisis
trocnter mayor de la tibia y distal superior del humero, distal del
del peron.
cubito, proximal del peron y
distal del fmur.
18 aos Fusin de la epfisis distal del radio
Fusin de la epfisis proximal
de la tibia.
19 aos
Fusin de la epfisis proximal
del humero, distal del radio y
el fmur, proximal del peron.
20 aos Fusin de la cresta iliaca
21 aos Clavcula, fusin de la tuberosidad Fusin de la tuberosidad
isquitica
isquiatica
Fuente: (Eternod Rodriguez, Osteologia infantil, 2010)
6.3.7 Desarrollo del esqueleto axial.

El esqueleto axial se compone de: crneo, columna vertebral, costillas, esternn. En el
proceso de formacin de esta parte del esqueleto, las clulas de los esclerotomos de los
somitas modifican su posicin. A lo largo de la cuarta semana, rodean al tubo neural y a la
notocorda, la estructura alrededor de la cual se desarrollan los rudimentos de las vrtebras.
Este cambio de posicin de dichas clulas se lleva a cabo por un crecimiento diferencial de
las estructuras circundantes y no por migracin activa de dichas clulas. EI gen Pax-1, que
se expresa en todas las futuras clulas esclerotomales de los somitas epiteliales en
embriones de pollo y de ratn, parece desempear una funcin esencial en el desarrollo de
la columna vertebral (Moore, Persaud, & Torcha, 2013, pg. 348).
34
6.3.8 Desarrollo del crneo

El crneo se forma a partir del mesnquima situado alrededor del cerebro en desarrollo y
est constituido el crneo por: el neurocrneo, los huesos del crneo que rodean el encfalo
(la cavidad craneana) y el viscerocrneo los huesos del esqueleto facial que proceden de los
arcos farngeos, por lo tanto se describir el desarrollo del neurocraneo y el viscerocraneo a
continuacin de manera independiente.
6.3.8.1 Neurocrneo cartilaginoso.

En un principio, el neurocrneo cartilaginoso o condrocrneo est compuesto por la base
cartilaginosa del crneo en desarrollo, que se forma por fusin de varios cartlagos.
Posteriormente, la osificacin endocondral del condrocrneo origina los huesos de la base
del crneo, El patrn de osificacin de esos huesos sigue una secuencia definida: comienza
en el hueso occipital, cuerpo del esfenoides y hueso etmoides. El cartlago paracordal, o
placa basal, se forma alrededor del extremo craneal de la notocorda y se fusiona con los
cartlagos derivados de las regiones del esclerotomo de los somitas occipitales. Esta masa
cartilaginosa participa en la formacin de la base del hueso occipital; despus crecen
extensiones alrededor del extremo craneal de la columna vertebral y constituyen los lmites
del agujero occipital. El cartlago hipofisiario se forma alrededor de la hipfisis en
desarrollo y se fusiona para dar lugar al cuerpo del hueso esfenoides. Las trabculas
craneales (trabeculae cranii) se unen y originan el cuerpo del hueso etmoides mientras que
el ala orbitaria (ala orbitalis), forma el ala menor del esfenoides. Las cpsulas ticas se
desarrollan alrededor del ala menor de las vesculas ticas, primordios de los odos
internos, y se convierten en las porciones petrosa y mastoidea del hueso temporal. Las
cpsulas nasales se desarrollan alrededor de los sacos nasales y participan en la formacin
del hueso etmoides (Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
6.3.8.2 Neurocrneo membranoso.

La osificacin intramembranosa ocurre en el mesnquima de la cabeza en las zonas
laterales y parte superior del encefalo, formando la bveda craneal. Durante la vida fetal,
los huesos planos de la bveda se encuentran separados por membranas de tejido
35
conjuntivo denso que forman unas articulaciones fibrosas, las suturas. Existen seis grandes
reas fibrosas en las zonas donde se unen varias suturas. La blandura de los huesos y sus
conexiones laxas en las suturas permiten a la bveda craneal sufrir cambios de forma
durante el nacimiento, denominados amoldamiento. En el amoldamiento del crneo fetal
(adaptacin de la cabeza fetal a la cavidad plvica durante el nacimiento), los huesos
frontales se aplanan, el occipital protruye y un parietal se superpone por encima del otro.
Unos pocos das despus de nacer, la forma de la bveda craneal se normaliza (Moore,
Persaud, & Torcha, 2013).
6.3.8.3 Desarrollo de la cabeza sea a partir de arcos farngeos.
El crneo fetal como por ejemplo la porcin escamosa del hueso temporal, el cigomtico y
maxilar, hueso cigomtico o malar derivan de la prolongacin maxilar del primer arco
farngeo asociado el mesenquima de la prominencia mandibular del primer arco se
condensa alrededor de su cartlago y experimenta osificacin intramembranosa y forma la
mandbula. El extremo dorsal del cartlago del primer arco forma dos huesos del odo
medio: el martillo y el yunque. El extremo dorsal del cartlago del segundo arco da lugar al
estribo del odo medio y a la apfisis estiloides del hueso temporal. Su extremo ventral se
osifica para formar el asta menor y la parte superior del cuerpo del hueso hioides.
Los cartlagos del tercero, cuarto y sexto arcos se forman nicamente en las porciones
ventrales de los arcos. Los cartlagos del tercer arco originan las astas mayores y parte
inferior del cuerpo del hueso hioides. Los cartlagos de los arcos cuarto y sexto se fusionan
para constituir los cartlagos larngeos, con excepcin de la epiglotis (Moore, Persaud, &
Torcha, 2013).
6.3.8.4 Desarrollo de la cara.

La cara se forma con la participacin de la prominencia frontonasal, las prominencias nasal
medial y nasal lateral, las prominencias maxilar y mandibular derivados del primer arco
farngeo. Estos elementos se desarrollan dando origen a las siguientes regiones de la cara:
regin frontal, que se forma a partir de la porcin ceflica de la prominencia frontonasal. La
regin nasal, que se forma por la unin de las prominencias nasal medial y nasal lateral; de
modo que el dorso de la nariz, el tabique y el pilar medial de la narina provienen de la
36
prominencia nasal medial mientras que las partes laterales de la nariz surgen de la
prominencias nasal lateral y la regin geniana o de la mejilla, que se forma por la unin en
las prominencias maxilar y mandibular; en la lnea de contacto entre las prominencias
maxilar y nasal lateral se forma el surco lacrimonasal y constituye el conducto
nasolacrimal. (Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
6.3.8.5 Crneo del recin nacido.

Cuando se ha recuperado del proceso de amoldamiento que es una forma anormal de la cabeza
del beb que resulta de la presin ejercida sobre sta durante el parto (MedlinePlus, 2014), el
crneo del recin nacido es redondeado y sus huesos son delgados. Al igual que el crneo
fetal, su tamao es grande en proporcin con el resto del esqueleto y la cara es
relativamente pequea en comparacin con la bveda craneal. El pequeo tamao facial se
debe a: el reducido tamao de las mandbulas, la ausencia prcticamente total de senos
paranasales (aire) y el infradesarrollo de los huesos faciales al nacer (Moore, Persaud, &
Torcha, 2013).
6.3.8.6 Crecimiento postnatal del crneo.
Las suturas fibrosas de la bveda craneal del recin nacido permiten el aumento de tamao
del encfalo durante la lactancia y la niez. Este aumento del tamao de la bveda craneal
es mayor durante los dos primeros aos de vida, el perodo de crecimiento posnatal ms
rpido del encfalo. La bveda craneal suele incrementar su capacidad hasta alrededor de
los 16 aos de edad. Despus slo suele aumentar ligeramente de tamao durante tres o
cuatro aos por el engrosamiento de sus huesos. Asimismo, se produce un rpido
crecimiento de la cara y los maxilares que coinciden con el brote de los dientes primarios
(deciduos). Estos cambios faciales son ms notables despus de la aparicin de la denticin
secundaria (permanente).
Existe un crecimiento simultneo de las regiones frontales y faciales asociadas al aumento
de tamao de los senos paranasales. La mayora de estos senos son rudimentarios o no estn
presentes al nacer. Su crecimiento es importante, ya que altera la forma de la cara y aade
resonancia a la voz (Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
37
6.3.9 Desarrollo de la columna vertebral.

Durante la fase pre-cartilaginosa o mesenquimal, las clulas mesenquimales de los
esclerotomos se localizan en tres regiones principales: alrededor de la notocorda, rodeando
al tubo neural y en la pared corporal. En un corte frontal de un embrin de cuatro semanas,
los esclerotomos aparecen como pares de condensaciones de clulas mesenquimales
alrededor de la notocorda. Cada esclerotomo est formado por clulas que se disponen
laxamente en la regin craneal y densamente empaquetadas en la regin caudal. Algunas de
estas ltimas se mueven en sentido craneal opuesto al centro del miotomo, donde forman el
disco intervertebral (IV). El resto de ellas se fusionan con las clulas de disposicin laxa del
esclerotomo inmediatamente caudal y dan lugar al centro(centrum) mesenquimal, el
primordio de cuerpo de la vrtebra. Por tanto, cada centrum se forma a partir de dos
esclerotomos adyacentes y se convierte en una estructura intersegmentaria. En este
momento, la relacin entre los nervios y los discos IV es estrecha, y las arterias
intersegmentarias se hallan a cada lado de los cuerpos vertebrales. En el trax, las arterias
intersegmentarias dorsales se convierten en las arterias intercostales.
La notocorda degenera y desaparece donde est rodeada por los cuerpos vertebrales en
desarrollo. Entre las vrtebras, la notocorda se expande y forma el centro gelatinoso del
disco intervertebral o el ncleo pulposo. Posteriormente, este ncleo se rodea de fibras en
disposicin circular que originan el anillo fibroso. En conjunto, el ncleo pulposo y el
anillo fibroso forman el disco IV. Las clulas mesenquimales que rodean al tubo neural dan
lugar al arco vertebral (neural), mientras que las de la pared corporal constituyen los
procesos costales que forman las costillas de la regin torcica (Moore, Persaud, & Torcha,
2013).
6.3.9.1 Etapa cartilaginosa del desarrollo vertebral.

A lo largo de la sexta semana aparecen centros de condrifcacin en cada vrtebra
mesenquimal. A finales del perodo embrionario, los dos centros de cada centrum se
fusionan y forman un centrum cartilaginoso. Al mismo tiempo, los centros de los arcos
vertebrales se unen entre s y con el centrum. Se desarrollan las apfisis espinosas y
transversales a partir de extensiones de los centros de condrificacin en el arco vertebral.
38
La condrificacin se extiende hasta que se forma una columna vertebral cartilaginosa

6.3.9.2 Etapa sea del desarrollo vertebral.

La osificacin de una vrtebra tpica se inicia durante el perodo embrionario y suele
finalizar a los 25 aos de edad. Existen dos centros de osificacin primarios, ventral y
dorsal para el centrum. Estos centros de osificacin primarios se fusionan en poco tiempo y
forman un centro. A finales del perodo embrionario existen tres centros primarios: uno (1)
en el centrum, uno en cada mitad del arco vertebral. La osificacin se hace evidente en los
arcos vertebrales durante la octava semana. Al nacer, cada vrtebra est formada por tres
porciones seas conectadas por cartlago. Por lo general, las mitades seas del arco
vertebral se suelen fusionar durante los primeros tres a cinco aos. En primer lugar, los
arcos se unen en la regin lumbar y el proceso de fusin avanza en sentido craneal. El arco
vertebral se articula con el centrum en las articulaciones neurocentrales cartilaginosas.
Estas articulaciones permiten el crecimiento de los arcos vertebrales a medida que se alarga
la mdula espinal y desaparecen cuando el arco vertebral se fusiona al centrum durante el
tercer a sexto aos de vida. Tras la pubertad aparecen seis centros de osificacin
secundarios en las vrtebras: uno (1) en la punta de la apfisis espinosa, uno (1) en la punta
de cada apfisis transversa y dos (2) epfisis anulares, una en el reborde superior y otra en
el inferior del cuerpo vertebral.
El cuerpo vertebral est compuesto por las epfisis anulares y una masa sea situada entre
ellas. El cuerpo vertebral incluye el centrum, partes del arco vertebral y las carillas
articulares para las cabezas de las costillas. Todos los centros secundarios se unen al resto
de la vrtebra alrededor de los 25 aos de edad. El atlas (C1), axis (C2), vrtebra lumbar
C7, sacro y coxis constituyen excepciones al modelo de osificacin tpica de las vrtebras
6.3.10 Desarrollo de las costillas.

Las costillas se desarrollan a partir de los procesos costales de las vrtebras torcicas. Se
tornan cartilaginosas durante el perodo embrionario y se osifican a lo largo del fetal. El
39
lugar original de unin de los procesos costales con las vrtebras es sustituido por
articulaciones costovertebrales, articulaciones planas de tipo sinovial (Moore, Persaud, &
Torcha, 2013).
.3.11
Desarrollo del esternn
Un par de bandas mesenquimales verticales, las barras esternales, aparecen en posicin

ventrolateral en la pared corporal. A medida que se desplazan en sentido medial, se produce
la condrificacin de las mismas. Se fusionan en sentido craneocaudal en el plano medio
para formar modelos cartilaginosos del manubrio, esternovrtebras (segmentos del cuerpo
esternal) y apfisis xifoides. A veces, la fusin en el extremo inferior del esternn es
incompleta; como con secuencia de ello, la apfisis xifoides de estos nios es bfida o
perforada. Antes del nacimiento aparecen centros de osificacin craneocaudalmente en el
esternn, excepto en la apfisis xifoides, donde aparecen durante la infancia (Moore,
Persaud, & Torcha, 2013).
6.3.12 Desarrollo del esqueleto apendicular.

El esqueleto apendicular est compuesto por las cinturas pectoral y plvica y los huesos de
las extremidades. Los huesos mesenquimales se forman a lo largo dc la quinta semana
como condensaciones de mesnquima que aparecen en las yemas de las extremidades. A lo
largo de la sexta semana del desarrollo, los moldes seos mesenquimales de las
extremidades se condrifican y forman modelos seos de cartlago hialino. La clavcula se
desarrolla inicialmente por osificacin intramembranosa y posteriormente da lugar a
cartlagos de crecimiento en ambos extremos. Los modelos de la cintura pectoral y de los
huesos de las extremidades superiores aparecen ligeramente antes de los de la cintura
plvica y las extremidades inferiores; los modelos seos se desarrollan siguiendo una
secuencia prximo-distal. El patrn de las extremidades en desarrollo est regulado por
genes homeocaja (Hox).
La osificacin comienza en los huesos largos durante la octava semana del desarrollo
embrionario y, en un principio, ocurre en las difisis de los huesos de los centros de
osificacin primarios. Hacia la semana 12 han aparecido centros de osificacin primarios
40
en casi todos los huesos de las extremidades. Las clavculas inician su osificacin antes que
el resto de los huesos del organismo. Los fmures son los siguientes huesos en mostrar
indicios de osificacin. La primera indicacin de este proceso en el modelo cartilaginoso de
un hueso largo se puede observar en la proximidad de la futura difisis, que constituye el
centro de osificacin primario. Los centros primarios aparecen en momentos distintos en
diferentes huesos, pero la mayora de ellos lo hace entre la semana sptima y duodcima del
desarrollo. Casi todos los centros de osificacin primarios estn presentes al nacimiento. La
parte de hueso que se osifica a partir de un centro primario es su difisis.
Los centros de osificacin secundarios de los huesos de la rodilla se forman en primer
lugar. Los centros del extremo distal del fmur y proximal de la tibia suelen aparecer
durante el ltimo mes de vida intrauterina (34 a 38 semanas despus de la fecundacin). Por
consiguiente, suelen estar presentes al nacer; sin embargo, la mayor parte de los centros de
osificacin secundarios aparecen despus del nacimiento. La parte del hueso osificada a
partir de un centro secundario se denomina epfisis. El hueso formado a partir del centro
primario de las difisis no se fusiona con el originado por los centros secundarios de las
epfisis hasta que el hueso ha alcanzado su longitud adulta. Este retraso permite que
contine el alargamiento del hueso hasta adquirir su tamao final. Durante el crecimiento
seo, una placa de cartlago conocida como placa (de cartlago) epifisiara se sita entre la
difisis y la epfisis.
Esta placa epifisiaria (placa de crecimiento) es sustituida finalmente por el desarrollo de
hueso en cada uno de sus lados, diafisiarios y epifisiarios. Cuando esto ocurre, se
interrumpe el crecimiento del hueso (Moore, Persaud, & Torcha, 2013).
41
7. CONSIDERACIONES TICAS.
El presente proyecto investigativo, tendr en cuenta las implicaciones ticas, con base en la
premisa del respeto por el animal, la vida, el dolor y el sufrimiento, teniendo claro qu se
quiere del animal. Tambin, ser riguroso y respetuoso con la reglamentacin que establece
normas cientficas, tcnicas y administrativas para investigaciones en salud y
experimentacin con animales, (Ministerio de Salud de la Repblica de Colombia., 2010)
con el fin de respetar las disposiciones de la resolucin nmero 8430 de 1993 en el titulo 5
Investigacin biomdicas con animales, y las disposiciones determinadas en la ley 84 de
1989 por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Proteccin de los Animales, se crean
contravenciones y se regula lo referente a su procedimiento y competencia. De lo anterior,
y en cumplimiento de las disposiciones, resoluciones y leyes establecidas en nuestro pas,
se obtendrn las ratas para la elaboracin del material docente por el laboratorio de
produccin animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad
Nacional de Colombia, el cual aplica la eutanasia al roedor(rata) utilizando cmara de CO2
(ver fotografa # 1 y 2), que es un gas seguro, no explosivo, inocuo para las vas
respiratorias, fcil de generar, que no provoca dolor ni estrs y que produce un efecto
anestsico con rpida prdida de conciencia seguido de un efecto eutansico en el animal
(Persia, Vera, Mariani, & Penissi, 2010). Por tanto se utilizar en el presente proyecto de
investigacin un (1) cerdo, siete (7) roedores (ratas) y una (1) rata copulada que ser
sacrificada para obtener de 2 a 3 neonatos aproximadamente. Todo lo anterior y el presente
proyecto de investigacin fue evaluado y aprobado por el comit de tica de la facultad de
medicina el da 26 de junio de 2014 mediante acta de evaluacin No. 076 de 2014 (ver
Anexo C)
Fotografa 1.
Fotografa 2.
Fuente: Elaboracin propia.
Fuente: Elaboracin propia.
42
8. DISEO METODOLGICO PARA LA ELABORACIN DE PIEZAS

ANATOMICAS DIAFANIZADAS.
8.1. Tipo de estudio.
Estudio de tipo cuasi-experimental donde a partir de la revisin terica de la tcnica
anatmica de preservacin denominada diafanizacin, se aplicar esta para consolidar la
teora existente. Se emplearn reactivos a distintas concentraciones, volmenes, tiempos de
duracin para obtener xito en el resultado de la diafanizacin como tcnica anatmica. Por
tanto, es un tipo de investigacin que comparte gran parte de las caractersticas de un
experimento, pero las comparaciones en la respuesta de los distintos reactivos se realiza
entre grupos no equivalentes, es decir, grupos que se pueden diferenciar en muchos otros
aspectos adems de la exposicin a reactivos tales como especie (ratn, cerdo), edad,
incubacin entre otras.
8.2. Especmenes utilizados.
Los especmenes del proyecto de investigacin son ratones (Mus Musculus) de la colonia
ICR 21, proporcionados por el laboratorio de produccin animal de la Facultad de Medicina
Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia y un (1) cerdo (Sus
scrofa domestica) sin cabeza como pieza anatmica de prueba preliminar.
8.3. Variables.
Se eligieron como variables caractersticas anatmicas susceptibles de ser observadas,
analizadas y controladas, que se clasificaron de la siguiente manera:
8.3.1. Variable cualitativa nominal.

Color: Cualidad del modelo anatmico, manifestada en cada fase del proceso de
diafanizacin. Observable mediante control fotogrfico de la muestra.
Diafanizacin de tejido: transparentacin de todo el tejido a excepcin del sistema
seo maduro y en desarrollo, el cual se expone y se tie con rojo de alizarina.
43
Friabilidad de tejido: cualidad manifestada en el tejido y expresada en no

aplastarse, fraccionarse o romperse con facilidad.
Centros de osificacin: exponer centros de osificacin en desarrollo teido con rojo
de alizarina.
Visualizacin sea: cualidad observable de tejido conectivo seo marcado con rojo
de alizarina.
Visualizacin de cartlago: cualidad observable de tejido conectivo (cartlago
hialino) marcado con azul de alcian.
9. INSTRUMENTOS.
Para la ejecucin del trabajo de grado se requiri el laboratorio de histo-tecnologia del
departamento de morfologa de la facultada de medicina y la utilizacin de equipos,
materiales e insumos relacionados a continuacin:
9.1 Equipos
Cmara fotogrfica marca Nikon coolpix L320 16 megapixeles zoom full Hd:
Instrumento utilizado para evidenciar el color de la pieza anatmica durante el proceso
de diafanizacin.
Balanza-Gramare marca ESCALTEC: instrumento utilizado para la medida de peso

exacto de reactivos y colorantes manejados.
Formato de registro fotogrfico: durante el proceso de las tcnicas de diafanizacin se

toma invidencia fotogrfica de resultados positivos y negativos de las tcnicas de
manera cronolgica (ver anexo B).
Formato para registro del procedimiento de cada una de las fases: en cada fase de la
tcnica se diligenci un formato que identific la tcnica utilizada, el reactivo
empleado, la cantidad de compuesto utilizado, el porcentaje de cada reactivo, la
duracin de cada fase, fecha de inicio y finalizacin del proceso. Durante el mismo se
lleva informe cronolgico escrito tipo diario durante cada semana hasta finalizar la
tcnica por parte del investigador (ver anexo A).
44
9.2 Materiales.
Cuatro (4) frascos de vidrio mayores a 1 litro.
Una (1) caja de guantes de ltex.
Batas desechables.
Protectores de va area.
Gafas de seguridad industrial.
Vaso precipitado x 1000cc.
Probeta graduada x 1000cc.
Papel higinico
Pipeta.
45
10. FASES PARA LA ELABORACIN DEL MATERIAL ANATMICO.
La implementacin de las tcnicas de diafanizacin se realiz con base en informacin

obtenida de antecedentes de investigacin nacional, latinoamericano, teora existente en
bases de datos, web y proyectos de exploracin en Universidades locales que trabajaron en
diafanizacin. Por consiguiente, se realizara la diafanizacin por maceracin, tcnicas de
Dawson // Schultz, en relacin a la revisin bibliogrfica y recomendaciones. Para la
elaboracin de las piezas anatmicas y del protocolo se implementaron en total siete (7)
fases.
En la primera (1) fase, encaminada a la implementacin de la tcnica de diafanizacin en

el espcimen, se realiz una prueba preliminar para lograr diafanizar tejido, exposicin y
tincin de sistema seo maduro con un cerdo eviscerado y sin cabeza, desconociendo la
edad del cerdo y fijado en formol al 10% con concentracin de KOH iniciales de 0,1%
(recomendacin de experto en diafanizacin Dra Zoila Emilia Castaeda Murcia).
La segunda (2) fase, implementacin de una tcnica en un ratn de 60 das de nacido, con
concentraciones iniciales de KOH al 10% diluido en glicerina tcnica (protocolo de
Universidad de los Andes).
Como tercera (3) fase, se inicia diafanizacin en un ratn de 21 das de nacido con
concentraciones iniciales de 2% segn protocolo chileno.
La cuarta (4) fase, se inicia diafanizacin de un ratn de 13 das de nacido, con base en
experiencias de fases anteriores y resultados positivos en diafanizacin.
La quinta (5) fase, se inicia diafanizacin en fetos ratones, con concentracin inicial de
solucin de hidrxido de potasio a 0.05%.
La sexta (6) fase, implementacin de la tcnica de diafanizacin con 4 ratones de 13 das

de nacidos, segn hallazgos encontrados en las fases uno, dos, tres, cuatro y cinco.
46
La sptima (7) fase, con base en la implementacin de tcnicas de diafanizacin, se elabora

y se construye protocolo de diafanizacin basado en la experiencia preliminar, resultados
obtenidos y recomendaciones para la implementacin de tcnicas de diafanizacin.
47
11.
RESULTADOS
OBTENIDOS
DIAFANIZACIN DURANTE CADA FASE.
DE
LAS
TCNICAS
DE
11. 1. FASE UNO: PRUEBA PRELIMINAR

En la primera (1) fase, encaminada a la implementacin de la tcnica de diafanizacin en el
espcimen, se realiz una prueba preliminar con un cerdo eviscerado y sin cabeza fijado en
formol al 10% con concentracin de hidrxido de potasio (KOH) iniciales de 0,1%
(recomendacin de experto en diafanizacin Dra Zoila Emilia Castaeda Murcia). Durante
la primera fase preliminar no se utiliz KOH diluido y mezclado con glicerina en ningn
momento, tan solo se realizaron cambios de solucin de hidrxido de potasio y se inici
con concentraciones muy bajas 0,1% y al finalizar se realiz coloracin de centros de
osificacin con rojo de alizarina por 7 das. Durante el proceso de la diafanizacin de la
primera fase se realiz y se especific la concentracin, pureza y tiempos de los reactivos,
evidenciado en la tabla No 3 que se encuentra a continuacin:
Tabla 3: Registro de reactivos fase uno.
MUESTRA
SEMANA
REACTIVO
CANTIDAD
EMPLEADO
REACTIVO
DEL
FECHA
FECHA
REACTI
INICIO
FINAL
VO
HORA
HORA
1
KOH
1gr
0,1%
1
2
KOH
KOH
1.5gr
O,15%
2,0GR
0,20%
06-05-14
13-05-14
12h
14h
13-05-14
21-05-14
14h
14h
21-05-14
29-05-14
10h
10h
KOH
2,0GR
0,20%
29-05-14
05-06-14
KOH
2,5GR
0,25%
05-06-14
13-06-14
KOH
2,5GR
0,25%
13-06-14
20-06-14
KOH
3,5GR
0,35%
20-06-14
27-06-14
KOH
3,5GR
0,35
27-06-14
04-07-14
48
KOH
4 GR
0,40
04-07-14
10-07-14
10
KOH
4 GR
0,40
10-07-14
22-07-14
11
Glicerina
500cc
100%
22-07-14
30-07-14
12
Glicerina
500cc
100%
30-07-14
04-08-14
13
Glicerina
500cc
100
04-08-14
11-08-14
14
KOH
2gr
0.2%
11-04-14
22-08-14
15
Glicerina
500cc
100%
22-08-14
25-08.14
16
Rojo
100%
25-08-14
02-09-14
de
alizarina..
Rojo
de
alizarina0.6
gr+1000cc
agua estril.
17
Glicerina pura
700cc
100%
02-09-14
05-09-14
18
Alcohol
1000cc
70%
05-09-14
08-09-14
18
KOH
2gr
0.2%
08-09-14
22-09-14
19
KOH
2gr
0.2%
08-09-14
22-09-14
20
Glicerina pura
500cc
100%
22-09-14
01-09-14
21
KOH
2gr
0.2%
01-09-14
15-09-14
22
KOH
2gr
0.2%
15-09-14
24-09-14
23
Glicerina
250
100%
24-09-14
26-09-14
Fuente: elaboracin propia.
Del anterior cuadro y para dar una evidencia real del resultado obtenido se gener un
control de registro semanal minucioso de acontecimientos relevantes captados
fotogrficamente en relacin con variables definidas durante el diseo metodolgico (color,
diafanizacin de tejido, friabilidad de tejido, centros de osificacin, visualizacin sea y
cartilaginosa) como se evidencia desde las fotografas 3 al 10:
49
Fotografa 3. Inmersin en KOH y fijacin con alcohol 70%
Fuente: Elaboracin propia. Semana 1,2 y 3. A) solucin de hidrxido de potasio 0,1%. B)

Perdida de integridad cutnea en dorso. C) Cambio de solucin de hidrxido de potasio. D.
Pos inmersin de 5 minutos de alcohol al 70% para mejorar fijacin.
50
Fotografa
4.
Inmersin
en
solucin
de
hidrxido
de
potasio
0,2%
Fuente: Elaboracin propia. Semana 4. Se visualiza diafanizacin de tejido en las patas del
espcimen.
Fotografa 5. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 0,25%
Fuente: Elaboracin propia. Semana 6 y 7. Se mejora visualizacin de diafanizacin de

tejido en las patas del espcimen y se insina trax.
51
Fotografa 6. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 0,35% y 0,45%
Fuente: Elaboracin propia. Semana 8 y 9. Se visualiza trax del espcimen.
52
Fotografa 7. Inmersin en Glicerina pura
Fuente: Elaboracin propia. Semana 10. Se observa mayor prdida de integridad cutnea,
por tanto se deja inmerso en glicerina pura por una (1) semana para mejorar fijacin e
integridad cutnea. B. Luego una (1) semana de inmersin en glicerina se evidencia
diafanizacin de tejido.
53
Fotografa 8. Inmersin por 15 das y recambio cada 7 das de Glicerina pura.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 12 y 13. A. Se mejora la diafanizacin de

tejido y visualizacin de sistema seo a los 14 das pos-inmersin en glicerina pura.
B. Diafanizacin de tejido del dorso y se observa la columna vertebral del
espcimen y mejora la diafanizacin con el recambio de glicerina en comparacin
con la semana 11.
54
Fuente: Elaboracin propia. Semana 14. Se coloca inmerso nuevamente en solucin de

hidrxido de potasio 0,2%, para mejorar diafanizacin de tejido en regin plvica y trax,
con posterior opacidad de tejido al retiro de la glicerina e inmersin en KOH.
55
Fotografa 10. Inmersin en Glicerina pura
Fuente: Elaboracin propia. Semana 15. A. durante las primeras 24h en glicerina pura se
diafaniza tejido con visualizacin de tejido seo. B. Tres (3) das de inmersin en glicerina
y recambio mejora visualizacin de pelvis y trax.
56
11.1.1 FIJACIN DE CENTROS DE OSIFICACIN: PRIMERA FASE.
La fijacin de los centros de osificacin en la primera fase se realiz a partir de

recomendaciones de la experiencia de la profesora y Dra. Zoila Emilia Castaeda y la
revisin bibliogrfica, por tanto la tcnica de tincin de centros de osificacin en la fase
uno (1) se realiz de la siguiente manera: en un recipiente mayor a un litro se prepar una
solucin de 1000cc de agua estril, se adicion 1gr de rojo de alizarina. Cuando la solucin
estaba disuelta y homognea se aplicaron: 2cc de acetona al 99%, 2cc de alcohol al 99% y
0,3gr de hidrxido de potasio; se mezcl totalmente hasta encontrar un estado homogneo.
Se introdujo al espcimen por siete 7 das, aclarando que se gener un control secuencial
fotogrfico evidenciado desde la fotografa No 11 hasta la No 16 que se encuentran a
continuacin:
57
Fotografa 11. Marcacin de centros de osificacin con rojo de alizarina primer,

tercer, quinto y sptimo da.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 16. A. 24 horas de tincin con rojo de alizarina. B. 72
horas de tincin de rojo de alizarina. C. Cinco (5) das de tincin con de rojo de alizarina.
D. sptimo y ltimo da de tincin y primer da de inmersin en glicerina pura
58
Fotografa 12. Aspecto final de marcacin de centros de osificacin.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 17. Se finaliza marcacin de centros de osificacin e

inmersin en glicerina pura, evidenciando teido de piel y aspecto muy rojizo del
espcimen.
Fotografa 13. Desmanchado con alcohol al 70% e inmersin en solucin de hidrxido
de potasio.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 18. Se realiza inmersin en alcohol al 70%, por 48h,
para fijacin y retiro de rojo de alizarina en piel y tejido blando. Posterior al segundo da de
inmersin de alcohol, se pone inmerso en KOH al 0,2% por dos semanas
59
Fotografa 14. Inmersiones en glicerina pura, alcohol e hidrxido de potasio.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 19. A y B Se mejora diafanizacin pero se evidencia

que piel se ti por aspecto rojizo marcado del espcimen que se trat de aclarar (ver
fotografa C, D) con alcohol al 70% por 24 horas e inmersin nuevamente en KOH al 0,2%.
60
Fuente: Elaboracin propia. Semana 20 y 21 Espcimen inmerso en KOH al 0,2%, para

mejorar diafanizacin y desmanchado de piel del espcimen.
61
Fotografa 16. Inmersin y recambio de glicerina pura.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 22 y 23. Espcimen inmerso en glicerina pura, se

cambia glicerina pura varias veces
para finalizar el proceso de diafanizacin del
espcimen.
11.1.2 CONCLUSIONES DE LA FASE UNO: PRUEBA PRELIMINAR.
Se logra diafanizar tejido del espcimen, visualizacin y tincin del sistema seo.
Se concluye que no se debe superar las concentraciones de KOH mayores a 0,5%

para evitar el dao en la piel del espcimen.
Se concluye que el manejo del espcimen debe ser en un frasco amplio.
Se concluye que el uso de inmersin del espcimen en rojo de alizarina debe ser
menor a siete das.
11.2. FASE DOS: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
62
En la fase (2), encaminada a la implementacin y estandarizacin de la tcnica de

diafanizacin se utiliz un ratn de 60 das de nacido, el proceso se realiz con base en la
revisin bibliogrfica local donde se revis un protocolo basado en glicerina (protocolo
Universidad de los Andes) disuelta con solucin de hidrxido de potasio con
concentraciones mximas hasta del 10%, pero la actual revisin bibliogrfica del protocolo
no da cuenta de tiempos especficos de manejo del espcimen en las soluciones. Con base
en la primera fase y las caractersticas de las soluciones se realiz una aproximacin en
tiempos en conjunto con los resultados arrojados en el ratn, que se registraron como
evidencia en la tabla 4 desde el inicio hasta el final del proceso de diafanizacin.
Tabla 4. Registro de reactivos fase dos.

MUES
SEM
REACTIVO
CANTIDAD
TRA
ANA
EMPLEADO
REACTIVO
KOH al 99%
50 gr+500cc Agua estril
FECHA
FECHA
REACTI
INICIO Y
FINAL
VO
HORA
HORA
10%
07-06-14
12-06-14
12h
14h
07-06-14
12-06-14
12h
14h
12-06-14
19-06-14
se toma un volumen de
DEL
375cc.
Glicerina
100%
tcnica
125ml
KOH al 99%
10%
10h
325cc.
GLICERINA
175cc
100%
12-06-14
19-06-14
10%
19-06-14
23-06-14
TECNICA
3
KOH al 99%
10h
325cc
GLICERINA
175cc
100%
19-06-14
23-06-14
10 gr de KOH+500cc
2%
23-06-14
27-06-14
TECNICA
4
KOH al 99%
Agua estril se toma un

volumen de 250cc
63
Glicerina
250cc
100%
23-06-14
27-06-14
10 gr de KOH+500cc
2%
27-06-14
11-07-14
100%
27-06-14
11-07-14
2%
11-07-14
29-07-14
100%
08-07-14
29-07-14
29-07-14
05-08-14
tcnica
5y6

volumen de 250cc
KOH al 99%
Glicerina
250cc
tcnica
7y8
10 gr de KOH+500cc
volumen de 250cc
KOH al 99%
Glicerina
250cc
tcnica
9
KOH al 99%
10 gr de KOH+500cc
volumen de 250cc
2%
Glicerina
250cc
100%
29-07-14
05-08-14
500 cc
100
05-08-14
12-08-14
tcnica
10
Glicerina
tecnica
11
KOH 99%
2gr
0.2%
12-08-14
19-08-14
12
KOH 99%
2gr
0.2%
19-08-14
28-08-14
13
Glicerina
500cc
100%
28-08-14
04-09-14
100%
14
KOH
4 gr
0,4%
04-09-14
16-09-14
15
KOH
4gr
0,4%
16-09-14
23-09-14
16
Glicerina
250cc
100%
23-09-14
01-10-14
17
Marcacin
800cc+0,8mg
01-10-14
01-10-14
Hora:
Hora:
16:30h
23:30h
02-10-14
02-10-14
02-10-14
02-10-14
ROJO
DE
rojo
de
alizarina.
ALIZARINA
17
17
Alcohol
al
300cc recambio a las 6
70%
horas
Agua estril
300cc recambio c/2h x

8h.
64
17
KOH
4,5gr
0,4
02-10-14
9-10-14
18
KOH
4,5gr
0,4
09-10-14
16-10-14
19
KOH
4,5gr
0,4
09-10-14
24-10-14
20
KOH
5gr
0,5%
24-10-14
31-10-14
21
Glicerina
250cc
100%
31-10-14
04-10-14
En el cuadro precedente se realiz un control secuencial de registro semanal minucioso de

acontecimientos acompaado con el registro fotogrfico para registrar las variables
definidas durante el diseo metodolgico (color, diafanizacin de tejido, friabilidad de
tejido, centros de osificacin, visualizacin sea y cartilaginosa) como se evidencia desde
la fotografa No 17 hasta la No 27.
Fotografa 17. Fijacin en formol al 10% e inmersin en solucin de hidrxido de

potasio 10%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 1. Ratn fijado en formol al 10% por 48 horas y al
tercer (3) da se coloca inmerso en una solucin de hidrxido de potasio al 75 % volumen
(KOH 10%,) + 25% de volumen de glicerina tcnica.
Fotografa 18. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 10%.
65
Fuente: Elaboracin propia. Semana 2. Ratn se coloca inmerso en una solucin de

hidrxido de potasio al 65 % de volumen (KOH 10%,) + 35% de volumen de glicerina
tcnica, el lquido es amarillo claro, an no hay cambios en el espcimen.
Fotografa 19. Prdida y retiro de pelo.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 3. A. Ratn inmerso en solucin de la semana 2,

presenta prdida de pelo y lquido amarillo claro. B. Se retira pelo con bistur. No presenta
significativa diafanizacin.

66
Fuente: Elaboracin propia. Semana 4. Ratn inmerso en solucin de hidrxido de potasio

50% de volumen (KOH 2%,) + 50% de volumen de glicerina tcnica.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 5 y 6. Durante el cambio de la solucin se visualizan

los miembros inferiores del ratn y se insina la pelvis.
67
Fuente: Elaboracin propia. Semana 7 y 8. Sin cambios significativos de diafanizacin en

miembros inferiores y pelvis. Se insina la columna del ratn. Por falta de diafanizacin, se
cambi solucin de KOH cada semana y no cada dos (2) semanas.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 9. Tejido blandos del ratn empiezan a diafanizar y
algunos huesos se observan.
Fotografa 24. Primera inmersin en glicerina pura.
68
Fuente: Elaboracin propia. Semana 10. A. primeras 24 horas de inmersin. B. tercer da

de inmersin. C y D. quinto da pos-inmersin.
Hasta la fotografa 24, se realizaron todos los pasos del protocolo universidad de los Andes,
aunque los resultados no fueron totalmente satisfactorios en diafanizacin pero se observ
que la glicerina junto al hidrxido de potasio a concentracin del 10% aceleran el proceso
corrosin y/o diafanizacin y preservan la piel del espcimen. Las anteriores observaciones
del protocolo de la Universidad de los Andes permitieron concluir que algunos pasos del
proceso de diafanizacin del protocolo se pueden fusionar con los de la fase 1, para obtener
resultados de igual calidad ms rpidamente. Para comprobar lo anterior se continula
diafanizacin de la fase dos con base a los resultados positivos que se evidenciaron en la
fase uno, al diafanizar con KOH a concentraciones no superiores de 0,5% sin glicerina
mezclada, como se observa en las fotografas No 25,26,27 y 28 de la fase 2 de
diafanizacin.
Fotografa 25. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,2%.
69
Fuente: Elaboracin propia. Semana 11 y 12. Se torna blanco el espcimen durante la

inmersin en hidrxido de potasio 0,2% sin glicerina mezclada.
Fotografa 26. Segunda inmersin en glicerina pura.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 13. Mejora la diafanizacin de tejido y la

visualizacin de sistema seo.
70
Fuente: Elaboracin propia. Semana 14 y 15. El espcimen se torna de aspecto traslucido o

difano.
Fotografa 28. Tercera inmersin en glicerina pura.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 16. Se mejora diafanizacin de pelvis, columna y

trax del espcimen al quinto da de inmersin en glicerina pura.
11.2.1. FIJACIN DE CENTROS DE OSIFICACIN: SEGUNDA FASE.
71
La fijacin de centros de osificacin en la segunda fase se realiz a partir de la experiencia

de la primera fase. Para la tcnica de tincin de centros de osificacin se realiz de la
siguiente manera: en un recipiente mayor a uno (1) litro se prepar una solucin de 800cc
de agua estril con 0,8gr de rojo de alizarina. Cuando la solucin estuvo disuelta y
homognea se adicionaron: 2cc de acetona al 99%, 2cc de alcohol al 99% y 0,5gr hidrxido
de potasio, se mezcl hasta lograr un estado homogneo. Se introdujo el espcimen por seis
horas, se llev control secuencial fotogrfico como se observa en las fotografas No 29
hasta la No 31:
Fotografa 29. Pos-marcacin de centros de osificacin.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 17. Se realiza coloracin de centros de osificacin por
6 horas por medio de inmersin, se lava y se recambia con alcohol al 70% por 6 horas, al
encontrar manchado de piel del espcimen, se transfiere a solucin de hidrxido de potasio
a 0,45%.
72
Fotografa 30. Inmersin y desmanchado en solucin de hidrxido de potasio 0,45% y

0,5%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 18, 19,20. Se recambia solucin de hidrxido de

potasio 0,45% y se logra el desmanchado de piel durante la semana 18, las semanas
siguientes 19 y 20 se aumenta la solucin de hidrxido de potasio a 0,5%.
Fotografa 31. Inmersin en glicerina pura.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 21. Inmersin y recambio cada 3 das de glicerina
pura con resultados satisfactorios en marcacin de sistema seo y diafanizacin.
73
11.2.2 CONCLUSIONES DE LA FASE DOS: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE

LOS ANDES.
Se observ que los pasos iniciales de la diafanizacin en el protocolo de la

Universidad de los Andes puedes ser fusionados con la fase uno (1) y as acelerar el
proceso en los especmenes grandes mayor de 4 cm mejorando la calidad en
diafanizacin y desmanchado de la piel.
Se demostr que el tiempo de marcacin de centros de osificacin no debe superar

las 6 a 8 horas de inmersin del espcimen en la solucin de alizarina adems se
observ la necesidad de adicionar hidrxido de potasio para mejorar la penetracin
del rojo de alizarina en el sistema seo.
11.3. FASE TRES: PROTOCOLO UNIVERSIDAD DE CHILE
En la fase, encaminada a la implementacin y estandarizacin de la tcnica de

diafanizacin se utiliz un (1) ratn de 30 das de edad, el proceso se realiz con base a la
revisin bibliogrfica del protocolo de la Universidad Santo Tomas de Chile (ver marco
terico). No haba tiempos especficos de inmersin del espcimen en las soluciones. Con
base en la experiencia en las fases uno y dos considerando las caractersticas de las
soluciones se realiz una aproximacin en tiempos de las soluciones de acuerdo con los
resultados encontrados en el ratn, se obtuvieron resultados poco satisfactorios en
diafanizacin. En la siguiente tabla 5 se registraron las concentraciones de los reactivos
hasta el final del proceso.
74
Tabla 5. Registro de reactivos fase tres.
MUEST
SEMAN
REACTIV
CANTIDAD
DEL
RA
REACTIVO
REACTIVO
EMPLEAD
FECHA
INICIO
FECHA
Y
FINAL
HORA
HORA
Formol al 10%
16-06-14
18-06-14
2%
18-06-14
23-06-14
100%
24-06-14
Hasta el da
O
1
Formol
al
100cc
44%
KOH al 99%
20
gr
(KOH)+1000cde
agua estril
Glicerina al
100cc
99%.
de hoy.
Se realiz un control fotogrfico semanal de los acontecimientos relevantes en relacin a

las variables definidas durante el diseo metodolgico (color, diafanizacin de tejido,
friabilidad de tejido, centros de osificacin, visualizacin sea y cartilaginosa) en las
fotografas No 31 y No 32:
Fotografa 32. Fijacin con formol al 10%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 1. Fijacin con formol al 10% por 48horas e
inmersin en solucin de hidrxido de potasio 2% sin glicerina.
75
Fotografa 33. Cinco das de inmersin en solucin de hidrxido de potasio 2% sin

glicerina.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 2. Cinco (5) das de inmersin en KOH al 2% sin
glicerina genera corrosin masiva, prdida total de integridad cutnea, muscular y
tendinosa, por tanto se suspendi inmersin de KOH al 2% y se puso inmerso en glicerina
tcnica.
11.3.1 CONCLUSIN FASE TRES: PROTOCOLO UNIVERSIDAD SANTO
TOMAS DE CHILE.
Las concentraciones de hidrxido de potasio por encima de 2% puro sin adicionar glicerina
son sumamente corrosivas en el espcimen. Por tanto, se descarta este tipo protocolo y se
suspende.
76
11. 4. FASE CUATRO: EXPERIENCIAS POSITIVAS FASE UNO Y DOS

Durante la fase cuatro se realiz el proceso de diafanizacin con base en experiencias
positivas de la fase uno y dos del presente proyectos de investigacin. En consecuencia se
realiz la diafanizacin como se muestra en la tabla 6 a continuacin:
Tabla 6. Registro de reactivos fase cuatro.
MUES
SEMAN
REACTIVO
CANTIDAD
TRA
EMPLEADO
REACTIVO
REACTI
INICIO
VO
HORA
HORA
Formal al
1-07-14
3-07-14
10%
03-07-14
08-07-14
100%
03-07-14
08-07-14
10%
08-07-14
23-07-14
100%
08-07-14
23-07-14
10%
08-07-14
23-07-14
100%
08-07-14
23-07-14
Formol al 44%
100cc
DEL
FECHA
FECHA
Y
FINAL
10%
1
(solo
KOH al 99%
50
gr+500cc
cinco(5)
Agua estril se
das)
toma
un
volumen
de
375cc.
Glicerina tcnica
125ml
KOH al 99%
50
gr+500cc
Agua estril se
toma
un
volumen
de
325cc.
GLICERINA
175cc
TCNICA
3
KOH al 99%
50
gr+500cc
Agua estril se
toma
un
volumen
de
325cc
GLICERINA
175cc
TCNICA
77
10
gr
de
23-07-14
31-07-14
23-07-14
31-07-14
31-07-14
07-08-14
KOH+500cc
Agua estril se
KOH al 99%
toma
un
volumen
de
2%
250cc
Glicerina tcnica
250cc
10
100%
gr
de
KOH+500cc
Agua estril se
KOH al 99%
toma
un
volumen
de
2%
250cc
Glicerina tcnica
250cc
100%
31-07-14
07-08-14
KOH
3 gr
0,3%
07-08-14
14-08-14
KOH
3 gr
0,3%
14-08-14
21-08-14
KOH
3 gr
0,3%
21-08-14
28-08-14
KOH
3,5 gr
0,35%
28-08-14
05-09-14
10
KOH
4 gr
0,4%
05-09-14
12-09-14
11
KOH
4 gr
0,4%
12-09-14
19-09-14
12
KOH
4,5gr
0,45%
19-09-14
29-09-14
13
Marcacin ROJO
800cc+0,8mg
01-10-14
01-10-14
DE ALIZARINA
rojo
Hora:
Hora:
alizarina.
16:30h
23:30h
300cc recambio
02-10-14
02-10-14
02-10-14
09-10-14
13
Agua estril
de
c/2h x 8h.
14
KOH
4,5gr
0,45%
78
15
KOH
4,5gr
0,45%
09-10-14
16-10-14
16
GLICERINA
250cc
100%
16-10-14
18-10-14
Se gener un control fotogrfico secuencial semanal de los acontecimientos relevantes en

relacin a variables definidas durante el diseo metodolgico (color, diafanizacin de
tejido, friabilidad de tejido, centros de osificacin, visualizacin sea y cartilaginosa) como
se evidencia desde la fotografa No 34 hasta la 40.

potasio 10%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 1. Ratn fijado en formol al 10% por 48 horas y al
tercer (3) da se coloca inmerso en una solucin de hidrxido de potasio al 75 % de
volumen (KOH 10%,) + 25% de volumen de glicerina tcnica.
79
Fuente: Elaboracin propia. Semana 2. El ratn se coloca en inmersin de solucin de

hidrxido de potasio al 65 % de volumen (KOH 10%,) + 35% de volumen de glicerina
tcnica, el se torna liquido amarillo claro, no hay cambios di diafanizacin en el espcimen.
80
Fotografa 36. Prdida y retiro de pelo.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 3. Ratn inmerso en solucin de la semana 2, se

observa prdida de pelaje y lquido de la solucin amarilla turbia, se cambia a la solucin
de hidrxido de potasio al 65 % de volumen (KOH 10%,) + 35% de volumen de glicerina
tcnica
Fotografa 37. Inmersin en solucin de hidrxido de potasio 2% con glicerina.
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 4 y 5. Ratn inmerso en solucin de hidrxido de

potasio 50% de volumen (KOH 2%,) + 50% de volumen de glicerina tcnica.
81
Fotografa 38. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,3%
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 6,7 y 8. La solucin de hidrxido de potasio 0.3%

sin glicerina, se cambia cada semana, al final de la octava (8) semana se evidencia
diafanizacin y se aprecia la columna, los dedos, las garras y levemente otros huesos de las
extremidades.
Fotografa 39. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,35%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 9.Diafanizacin de extremidades, columna, dedos,

garras y se insina pelvis del espcimen.
82
Fotografa 40. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,4%
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 10, 11 y 12. A. Durante las semana 10 y 11, se
visualiza tejido muscular, mejora la visualizacin de tejido seo. B. al final de la semana
12, el espcimen se visualiza blando, desaparece visualizacin de tejido muscular, y mejora
diafanizacin de tejido seo en especial pelvis y trax
11.4.1 FIJACIN DE CENTROS DE OSIFICACIN: CUARTA FASE.

La fijacin de centros de osificacin en la cuarta fase se realiz a partir de la experiencia de
la primera y segunda fase asociado a la revisin bibliogrfica; por tanto la tcnica de
tincin de centros de osificacin en la fase cuatro (4) se realiz de la siguiente manera: en
un recipiente de un (1) litro se prepar una solucin de 800cc de agua estril con 0,8gr de
rojo de alizarina. Cuando la solucin estuvo disuelta y homognea se agregaron 2cc de
acetona al 99%, 2cc de alcohol al 99% y 0,5gr hidrxido de potasio, se mezcl hasta
encontrar un estado homogneo. Se introdujo al espcimen por seis horas y se llev un
control fotogrfico como se observa en las fotografas No 41 hasta la 43:
83
Fotografa 41. Post-marcacin de centros de osificacin.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 13. Coloracin de centros de osificacin con rojo de
alizarina por 6 horas. Luego se sumerge en agua estril, se lava y se recambia cada 2 horas
por 8 horas. Se observ desmanchado y retiro de la alizarina en la casi totalidad de la piel
del espcimen luego se deja inmerso en solucin de hidrxido de potasio a 0,45% por dos
semanas.
Fotografa 42. Inmersin y desmanchado en solucin de hidrxido de potasio 0,45%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 14 y 15. Solucin de hidrxido de potasio 0,45% y se

evidencia desmanchado en la piel durante la semana, l espcimen estaba ms friable y se
observa la escapula en trax.
84
Fuente: Elaboracin propia. Semana16. Inmersin con recambio cada 3 das de glicerina
pura con resultados satisfactorios en marcacin de sistema seo y diafanizacin.
11.4.2 CONCLUSIN FASE CUATRO: EXPERIENCIAS POSITIVAS FASE

UNO Y DOS.
Se obtiene un resultado satisfactorio durante el proceso de la diafanizacin gracias a las
experiencias adquiridas durante la fase uno (1) y dos (2); sumado a esto se logra
estandarizar la tincin de centros de osificacin en especmenes mayores a 4cm,
concluyendo que la tincin se debe realizar luego de la solucin de hidrxido de potasio y
el desmanchado se debe realizar con solo agua estril en recambios cada 2 horas por
aproximadamente 8 horas, se sugiere no utilizar para el retiro de la alizarina de la piel y
tejidos la glicerina, ni mucho menos alcohol al 70% por ser sustancias conservadoras,
fijadoras y que generan deshidratacin. Posterior al retiro de la alizarina del tejido se coloc
rata inmersa en solucin de hidrxido de potasio para mejorar aspecto de piel y tejidos.
85
11.5. FASE CINCO: FETOS RATONES.

Durante la fase cinco se realiz el proceso de diafanizacin con base en la solucin de
hidrxido de potasio a concentraciones no mayores de 0,2% por el tamao de los fetos de
ratn. Entonces se realiz la diafanizacin de la manera como se ve en la tabla 7 que se
encuentra a continuacin:
Tabla 7. Registro de reactivos fase cinco.
MUESTR
SEMANA
REACTIV
CANTIDAD
REACTIVO
REACTI
INICIO
VO
HORA
HORA
200cc
10%
4-08-14
6-08-14
EMPLEAD
DEL
FECHA
FECHA
Y
FINAL
O
1
Formol
al
44%
1
KOH
0,5gr
0,05%
6-08-14
13-08-14
KOH
0,5gr
0,05%
13-08-14
20-08-14
KOH
1gr
0,1%
20-08-14
27-08-14
KOH
1gr
0,1%
27-08-14
03-09-14
KOH
1,5gr
0,15%
03-09-14
10-08-14
KOH
1,5gr
0,15%
10-09-14
17-08-14
KOH
2gr
0,2%
17-09-14
23-09-14
KOH
1gr
0,1%
23-09-14
30-09-14
KOH
1gr
0,1%
30-09-14
07-10-14
10
KOH
1gr
0,1%
07-10-14
14-10-14
86
11
KOH
1gr
0,1%
14-10-14
21-10-14
12
KOH
1gr
0,1%
28-10-14
28-10-14
13
Glicerina
50cc
100%
05-10-14
FINAL
DE
LA
TECNICA
De la anterior tabla se llev control fotogrfico secuencial semanal de los acontecimientos

relevantes en relacin a variables definidas durante el diseo metodolgico (color,
diafanizacin de tejido, friabilidad de tejido, centros de osificacin, visualizacin sea y
cartilaginosa) como se muestra en las fotografas No 44 hasta el No 52:

potasio 0,05%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 1. Se sacrific rata copulada de aproximadamente 17

das, en cmara hiperbrica, se realiz incisin en el abdomen, se retiraron las vsceras, se
fijaron en formal al 10%, en grupos de dos (2) especmenes por 48 horas y se inici
inmersin en KOH al 0,05%.
87
Fotografa 45. Aumento de concentracin de 0,05% a 0,1% de solucin de hidrxido

de potasio.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 2, 3 y 4. Se cambia KOH cada semana, al terminar la

segunda semana, se aumenta concentracin de KOH a 0,1%, con posterior visualizacin de
tejido seo en patas al finalizar la cuarta semana.
Fotografa 46. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio a 0,15% y fijacin con

alcohol al 70%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 5. Liquido amarillo, turbio, con partculas en su

interior por tanto se cambia KOH y se aument concentracin a 0,15%, durante el cambio
de solucin se evidencia perdida de la integridad y friabilidad cutnea, por tanto se fija
espcimen con alcohol al 70% por un (1) da.
88
Fotografa 47. Solucin de hidrxido de potasio 0,2%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 6. Se visualiz tejido seo en los miembros del ratn
y se insina en el trax, se present aumento de la prdida de integridad cutnea, sin ms
cambios significativos. Se cambia solucin de hidrxido de potasio y se aumenta
concentracin a 0,2%.
Fotografa 48. Solucin de hidrxido de potasio superior a la permitida para obtener

una diafanizacin adecuada.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 7. Se mejor la diafanizacin de tejido en patas de

ratn y trax de los fetos. Desafortunadamente asociado con mayor prdida de integridad
cutnea y la solucin se torn de aspecto rojo, por tanto se reduce la concentracin de
solucin de hidrxido de potasio a 0,1%.
89
Fotografa 49. Solucin de hidrxido de potasio a 0,1%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 8 y 9. Se hizo el recambio de solucin de hidrxido

de potasio cada semana y luego se llev a cabo la fijacin por 24 horas con alcohol al 70%
para disminuir la perdida de integridad cutnea y reducir la friabilidad.
Fotografa 50. Solucin de hidrxido de potasio a 0,1%.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 10 y 11. Durante estas dos semanas, se mantuvo la
concentracin de hidrxido de potasio al 0,1% con prdida total en fetos de integridad
cutnea.
90
Fuente: Elaboracin propia. Semana 12. Se dejan inmersos los especmenes en glicerina
pura que se recambia cada 3 das.
Fotografa 52. Sptimo da de inmersin y recambio de la glicerina.
Fuente: Elaboracin propia. Semana 13. Se evidenciaron centros de osificacin y cartlago.
91
11.5.1 CONCLUSIN FASE CINCO: FETOS RATONES.

Se logra diafanizar fetos menores a 4 cm de longitud, concluyendo que se debe
implementar solucin de KOH sin glicerina en concentraciones que no superen 0,1% para
conservar la calidad de la diafanizacin y la integridad cutnea de los fetos ratones.
11.6 FASE SEIS: PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN EXPERIENCIAS

POSITIVAS DE FASES 1, 3, 4, 5 EN CUATRO RATONES DE 17 DIAS
Durante la fase seis el proceso de diafanizacin se realiza con base a las experiencias
positivas de las fases uno, dos, cuatro y cinco del presente proyectos de investigacin. De lo
anterior se realiza la diafanizacin como se encuentra en la tabla 8 que est a continuacin:
Tabla 8. Registro de reactivos fase seis
MUESTRA
SEMANA
REACTIVO
CANTIDAD
% DEL
FECHA
FECHA
EMPLEADO
REACTIVO
REACT
INICIO Y
FINAL
IVO
HORA
HORA
Formol al 44%
500cc
10%
29-07-14
01-08-14
KOH al 99%
50
10%
01-08-14
03-08-14
125ml
100%
01-08-14
03-08-14
50
10%
03-08-14
06-08-14
gr+500cc
Agua estril se
toma
un
volumen
de
375cc.
Glicerina
tcnica
1 recambio
KOH al 99%
gr+500cc
por
Agua estril se
turbidez.
toma
un
volumen
de
375cc.
92
Glicerina
125ml
100%
03-08-14
06-08-14
50
10%
06-08-14
11-08-14
175cc
100%
06-08-14
11-08-14
50
10%
11-08-14
14-08-14
175cc
100%
11-08-14
14-08-14
50
10%
14-08-14
21-08-14
175cc
100%
14-08-14
21-08-14
tcnica
2
KOH al 99%
gr+500cc
Agua estril se
toma
un
volumen
de
325cc.
GLICERINA
TECNICA
KOH al 99%
gr+500cc
Agua estril se
toma
un
volumen
de
325cc
GLICERINA
TECNICA
3
KOH al 99%
gr+500cc
Agua estril se
toma
un
volumen
de
325cc
GLICERINA
TECNICA
4
KOH
2 gr
0,3%
21-08-14
28-08-14
KOH
2 gr
0,3%
28-08-14
04-09-14
KOH
3 gr
0,3%
04-09-14
11-09-14
KOH
3 gr
0,3%
11-09-14
18-09-14
KOH
3,5 gr
0,3%
18-09-14
25-09-14
KOH
3,5 gr
0,3%
18-09-14
25-09-14
10
Marcacin
800cc+0,8mg
25-09-14
25-09-14
rojo
Hora:
Hora:
ROJO
DE
de
93
10
ALIZARINA
alizarina.
16:30h
23:30h
Agua estril
300cc
26-09-14
26-09-14
recambio c/2h
x 8h.
10
KOH
4 gr
0,4%
26-09-14
03-10-14
11
Glicerina
250cc
100%
03-10-14
10-10-14
12
Glicerina
250cc
100%
10-10-14
Hasta el da
de hoy.
De la tabla anterior se realiz un registro fotogrfico semanal de acontecimientos relevantes

en relacin a variables definidas durante el diseo metodolgico (color, diafanizacin de
tejido, friabilidad de tejido, centros de osificacin, visualizacin sea y cartilaginosa) como
se evidencia desde las fotografas No 53 hasta la No 56:

potasio 10%.
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 1 y 2. . Ratones fijados en formol al 10% por 48

horas y al tercer (3) da se colocan inmersos en una solucin de hidrxido de potasio al 75
% volumen (KOH 10%,) + 25% de volumen de glicerina tcnica.
94
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 3 y 4. Los ratones se colocan en inmersin en una

solucin de hidrxido de potasio al 65 % de volumen (KOH 10%,) + 35% de volumen de
glicerina tcnica, el lquido se torna amarillo claro, no hay cambios que reflejen
diafanizacin.
Fotografa 55. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,2% y 0,3%.
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 5 y 6. La inmersin y recambio de solucin de

hidrxido de potasio durante las dos semanas, no hay cambios significativos.
95
Fotografa 56. Inmersin de solucin de hidrxido de potasio 0,3% y 0,35%.
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 7 y 8. Inmersin y recambio de solucin de

hidrxido de potasio y espcimen pierde todo su pelo.
11.6.1 FIJACIN DE CENTROS DE OSIFICACIN: SEXTA FASE.
La fijacin de centros de osificacin en la sexta fase se realiz a partir de la experiencia de

la cuarta fase asociado a la revisin bibliogrfica. La tcnica de tincin de centros de
osificacin en la fase seis se realiz de la siguiente manera: en un recipiente de uno (1)
litro se prepar una solucin de 800cc de agua estril se adiciono 0,8gr de rojo de alizarina.
Cuando la solucin estuvo disuelta y homognea se agregaron: 2cc de acetona al 99%, 2cc
de alcohol al 99% e hidrxido de potasio 0,5gr, se mezcl hasta lograr encontrar un estado
homogneo. Se sumergi al espcimen por seis horas y se llev un control secuencial
fotogrfico como se observa a continuacin:
96
Fotografa 57. Coloracin de centros de osificacin.
Fuente: Elaboracin propia. Semanas 10 y 11. Coloracin de centros de osificacin con

rojo de alizarina por 6 horas. Posteriormente se pone inmerso en agua estril, se lava y se
recambia cada 2 horas por 8 horas. Evidencindose desmanchado y retiro de la alizarina de
la piel del espcimen casi en su totalidad. Posteriormente se deja inmerso en solucin de
hidrxido de potasio a 0,45%.
97
Fuente: Elaboracin propia. Semana 12. Inmersin y recambio de glicerina pura para
mejorar diafanizacin en espcimen.
11.6.2 CONCLUSIN FASE SEIS: PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN

EXPERIENCIAS POSITIVAS DE FASES 1,2, 4, 5 EN CUATRO RATONES DE 17
DIAS.
Se lograron diafanizar cuatro ratones en 12 semanas en menor tiempo en comparacin con
las fases anteriores, permitiendo generar y replicar un protocolo de diafanizacin en
especies mayores de 4 cm de longitud basado en la evidencia que mejora la eficacia en
tiempo y calidad en diafanizacin.
98
11.7. PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN EXPERIENCIA PRELIMINAR

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA.
El proceso, segn el protocolo que propone la presente investigacin para realizar la
diafanizacin es el siguiente:
1. Fijacin de la muestra en formol 10% por 48 horas.

2. Diafanizar siguiendo el esquema:
a) Solucin de Hidrxido de potasio + H2O estril 75% volumen (KOH 10%) +
25% volumen de glicerina tcnica. (7 das).
b) Solucin de 65% volumen de (KOH 10%)+ 35% de glicerina tcnica. (14 das)
c) Solucin de hidrxido de potasio 0,2% por dos (2) semanas.
d) Solucin de hidrxido de potasio 0,3% por dos (2) semanas.
e) Solucin de hidrxido de potasio 0,35% por dos (2) semanas.
f) Solucin de hidrxido de potasio 0,4% por dos (2) semanas.
3. Tcnica de tincin de centros de osificacin al terminar el paso (f) de la siguiente

manera:
a) En un recipiente de uno (1) litro preparar una solucin de 800cc de agua
estril disolver 0,8gr de rojo de alizarina, cuando la solucin este disuelta
agregar: 2cc de acetona 99%, 2cc de alcohol al 99% y 0,5gr de hidrxido de
potasio. Cuando la mezcla est totalmente homognea, se sumerge el
espcimen por seis (6) horas.
b) Introducir al espcimen en agua estril y recambiar cada dos horas hasta
retirar la coloracin del rojo de alizarina de la piel.
c) Para completar el desmanchado de piel y tegumentos introducir al
espcimen en hidrxido de potasio (0,2%) por una (1) semana.
4. Solucin de 100% de glicerina tcnica. Si en esta etapa la muestra no se torna

transparente, se puede volver al paso dos (2) puntos e y f. (Por lo general se requiere
cambiar varias veces la solucin en glicerina pura hasta obtener una transparencia
adecuada).
99
11.8 ANLISIS GENERAL DE RESULTADOS DE CADA FASE, DURANTE LA

ELABORACIN DE LAS PIEZAS ANATMICAS DIAFANIZADAS.
Se elaboran las siguientes tablas 9 y 10 de reactivos y resultados de cada fase para el

anlisis global comparativo de las fases del proyecto de investigacin las cuales se
muestran a continuacin:
Tabla 9. Resumen de reactivos y resultados fases 1,2 y 3 durante las tcnicas de
diafanizacin.
FASE 1. PRUEBA
PRELIMINAR
REACT
IVOS
RESUL
TADOS
Solucin de hidrxido de
potasio (KOH) en
concentracin no superior
a 0,5% sin glicerina.
Diafanizacin de tejido y
visualizacin de sistema
seo con tincin de
centros de osificacin no
adecuada, manchado y
aspecto muy rojizo del
modelo anatmico.
FASE 2. PROTOCOLO
UNIVERSIDAD DE
LOS ANDES
KOH en concentracin
de 10% y 2% mezclado
con glicerina.
FASE 3. PROTOCOLO
UNIVERSIDAD DE
CHILE
KOH en concentracin
a 2% sin glicerina.
Diafanizacin de tejido
no satisfactorio pero en
menor tiempo, asociado
a mejor tincin de
centros de osificacin
basado en evidencia
experimental.
Se descarta protocolo
sumamente corrosivo en
espcimen.
Diafanizacin no
adecuada.
Tabla 10. Resumen de reactivos y resultado fases 4,5,6 y 7 durante las tcnicas de
diafanizacin.
FASE 4.
EXPERIENCIAS
POSITIVAS FASE 1
Y 2.
REACT
IVOS
RESUL
TADOS
Inicio de KOH a
concentraciones
de
10% con glicerina y
finaliza KOH 0,5% sin
glicerina.
Diafanizacin
satisfactoria y se logra
estandarizar la tincin
de
centros
de
osificacin.
FASE 5.FETOS
RATONES
FASES 6 y7. PROTOCOLO

DIAFANIZACIN SEGN
EXPERIENCIAS DE FASES 1,
3,4 y 5 EN CUATRO
RATONES DE 17 DIAS.
KOH
a Inicio
de
KOH
a
concentracin no concentraciones de 10% con
superior de 0,2% en glicerina y finaliza KOH 0,5%
fetos ratones
sin glicerina.
La solucin de
KOH no debe
superar
la
concentracin de
0,1%
para
conservar
integridad cutnea
y calidad
en
diafanizacin.
100
Se diafaniza en 12 semanas
menor que en fases anteriores,
se elabora y replica protocolo de
diafanizacin
basado
en
evidencia real que mejora
eficacia en tiempos y calidad de
diafanizacin.
12. CONFIABILIDAD Y VALIDEZ.

Enfocando el proyecto de investigacin hacia el concepto de la confiabilidad que se refiere
a la consistencia, coherencia y estabilidad de la informacin recolectada, en el presente
proyecto, los puntos anteriormente mencionados estarn soportados por: la calidad de los
reactivos, buen estado de los elementos a utilizar, idoneidad del investigador que se
fortalecer mediante asesoras de personal experto en la tcnica de diafanizacin, como la
Doctora Zoila Emilia Castaeda Murcia, profesora pensionada e invitada de la Maestra de
Morfologa Humana Universidad Nacional de Colombia y docente Universidad del
Rosario.
101
13. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.

La tcnica de diafanizacin en la facultad de Medicina de la Universidad Nacional de
Colombia abre posibilidades a los alumnos de pregrado y posgrado que quieran incursionar
en el desarrollo de la tcnica de conservacin anatmica en anatoma humana y diafanizar
otros sistemas como el cardiovascular, digestivo nervioso. La alternativa de la tcnica de
diafanizacin como lnea de profundizacin e investigacin de correlacin terico-prctica
de morfognesis sea, anatoma comparada y embriologa que permita el fortalecimiento y
posicionamiento de la Maestra de Morfologa Humana.
La diafanizacion, as como el desarrollo de otras tcnicas de preservacin de modelos

anatmicos se convierte en un elemento constructor de aprendizaje significativo para el
estudiante que aprenda en contacto directo e inmerso con la tcnica y piezas diafanizadas,
que permite reforzar sus conocimientos de morfognesis sea, anatoma y embriologa.
Con el fin de responder al objetivo de investigacin, se exploraron e implementaron varias

tcnicas de diafanizacin en ratones y se elabor un protocolo de normatizacin que
incluye reactivos qumicos utilizados, pureza, concentracin y tiempos empleados con
sugerencias y recomendaciones explicitas en cada fase del procedimiento de la
diafanizacin.
Los resultados obtenidos con esta investigacin deben permitir la utilizacin de la tcnica
de diafanizacion utilizando, el protocolo aqu consignado para ser implementada en el
estudio de la anatoma humana, por consiguiente, se estima que es conveniente la
realizacin de otros estudios posteriores para mejorar el proceso y estandarizar el protocolo
definitivo en esta rea.
Se encontraron diferencias significativas en relacin a concentraciones y usos de reactivos,

como es el caso de la solucin de hidrxido de potasio para diafanizar y se deja evidencia
normativa basada en la experiencia de marcacin de tejido seo con rojo de alizarina sobre
pureza, concentracin y tiempos, ya que haba una gran ausencia terica de los
102
procedimientos durante la revisin del reactivo (rojo de alizarina) para la marcacin de los
centros de osificacin.
A pesar de la corrosin para la diafanizacin con solucin de hidrxido de potasio en los

modelos anatmicos como investigador sugiero el uso de la glicerina durante el proceso
para conservar integridad cutnea, friabilidad de los tejidos y fidelidad de los detalles
anatmicos en modelos anatmicos que superen los 4cm de longitud.
Se logr estandarizar de alguna manera la tcnica de diafanizacin en modelos que superen

los 4 cm de longitud y se recomienda con base en la evidencia, que modelos como fetos y
embriones menores a 3 a 4cm de longitud se deben diafanizar solamente con solucin de
hidrxido de potasio que no supere el 0,1%.
103
14. CRONOGRAMA.
Tabla 11: CRONOGRAMA SEGUNDO SEMESTRE 2013
MESES
AGOSTO
SEPTIEMBRE
OCTUBRE
NOVIEMBRE
DICIEMBRE
SEMANA
ACTIVIDADES
Formulacin
del problema
Revisin
del
marco terico
Aprobacin
propuesta
de
investigacin
Revisin
de
tcnicas
de
diafanizacin.
Tabla 12: CRONOGRAMA PRIMER SEMESTRE 2014

MESES
FEBRERO
MARZO
ABRIL
SEMANA
ACTIVIDADES
Revisin de tcnicas
de diafanizacin
Realizacin
de
inventario
solicitud
de
laboratorio
de
histo-tecnologia.
Compra
de
reactivos.
Compra
de
especmenes.
Prueba preliminar
fase(1)
Protocolo U. Andes
104
MAYO
JUNIO
JULIO
Fase (2)
Protocolo U. Chile
Fase (3)
Diafanizar
segn
experiencias
positivas. Fase (4).
Tabla 13: CRONOGRAMA SEGUNDO SEMESTRE 2014

MESES
AGOSTO
SEPTIEMBRE
SEMANA
ACTIVIDADES
Prueba
preliminar
fase(1)
Protocolo
U.
Andes Fase (2)

Diafanizacin
fetos de ratn.
Fase (5)
Protocolo
de
diafanizacin
segn
experiencias
positivas
de
fases1, 2, 3, 4, 5
en 4 ratones.
Fase (7)
Anlisis
interpretacin
de resultados.
Presentacin de
resultados
informe final.
105
OCTUBRE
NOVIEMBRE
DICIEMBRE
15. PRESUPUESTO.
15.1 PRESUPUESTO GENERAL.
El valor total del proyecto: 1.061.000$ mil pesos Mcte.
Tabla 14: Presupuesto.
RUBROS
VALOR
TALENTO HUMANO
1 Investigador
No aplica
Proporciona
2 Docentes asesores
la
Universidad
Subtotal
$ 0.0
LABORATORIOS, EQUIPOS Y MATERIALES

Proporciona
Arrendamiento de laboratorio.
Universidad
Equipos y materiales.
596.000$
Subtotal
596.000$
REACTIVOS QUIMICOS
Hidrxido de potasio, agua destilada, rojo de alizarina,
glicerina, formol, agua destilada, acetona y alcohol 323.000$
etlico.
Subtotal
323.000$
ESPECIMENES
Ratones (Mus Musculos) colonia ICR 21
142.000$
Subtotal
142.000$
GRAN TOTAL
1.061.000$
106
la
15.2 PRESUPUESTO DETALLADO
Tabla 15: presupuesto detallado.

TALENTO HUMANO
VALOR
RECURSOS
UNIDAD CANTIDAD
1 Investigadores
Mes
2 Docentes asesores
Mes
UNITARIO
TOTAL
VALOR TOTAL
No aplica
Proporciona
la
Universidad
$0.0
LABORATORIOS, EQUIPOS Y MATERIALES

RECURSOS
CANTIDAD
VALOR
UNITARIO
VALOR TOTAL
ARRENDAMIENTO DE LABORATORIOS
Proporciona la
Anfiteatro y laboratorio de 1
Universidad
histo-tecnologia
/mes
Subtotal
Proporciona
la
Universidad
$0.0
EQUIPOS Y MATERIALES
Frascos de vidrio 5L
5.000
25.000
499.000$
499.000$
Gafas de seguridad industrial 1
22.000$
22.000$
batas desechables talla L
20
40.000$
40.000$
Vaso precipitado x 500cc
8000$
8000$
Papel higinico
2000$
2000$
Cmara fotogrfica marca

Nikon
coolpix
L320
16 1
megapixeles.
Bascula gramera
Proporciona la Proporciona
Universidad
107
Universidad
la
Guantes limpios talla L
Tapa boca x 50 unidades
1 cajas x 100 Proporciona la Proporciona

unid
Universidad
1 caja x 50 unid
Universidad
Protectores de va area
1 caja
Probeta graduada
Baln aforadox 500
Pipeta
Subtotal
la
Universidad
la
Universidad
Universidad
la
Universidad
Universidad
la
Universidad
Universidad
la
Universidad
Universidad
Baln aforadox1000
Universidad
Universidad
la
la
Universidad
$596.000
TOTAL
$596.000
ESPECIMENES
RECURSO
Ratn(Mus
CANTIDAD
Musculus)
colonia ICR 21
Ratn(Mus
Musculus)
copulado colonia ICR 21

TOTAL
VALOR
VALOR TOTAL
UNITARIO
9000$
72000$
70000$
70000$
142000$
108
Tabla 16: Presupuesto Reactivos qumicos.
REACTIVOS QUIMICOS
REACTIVO
Hidrxido de potasio 99% en lentejas
por 250mg.
CANTIDAD
VALOR
VALOR
UNITARIO TOTAL
9.000$
36.000$
Glicerina tcnica x 500ml
2500
20.000
Glicerina tcnica x galn.
20000
60000
Rojo de alizarina MERCK
FCOx25gr
186.000
186.000
Agua destilada por galn.
10.000
10.000
Alcohol etlico al 96% por galon
11.000
11.000
Proporciona
Proporciona la
la
Universidad
Acetona
1
Universidad
TOTAL
323000$
109
ANEXOS.
Anexo A.
HOJA DE REGISTRO DE DATOS
FORMATO DE REGISTRO DE ESPECIMENES DIAFANIZADO
PROCEDIMIIENTO:________________________________________________
MUESTR
A
SEMANA
REAC
CANTIDA
TIVO
EMPL
REACTIV
EADO
DEL
FECHA
FECHA FINALIZACIN Y
REACTIV
INICIO
HORA
Y
HORA
110
Anexo B.
CONTROL FOTOGRAFICO DE DIAFANIZACIN
PROCEDIMIIENTO: ________________________________________________
SEMANA 1
SEMANA 2
SEMANA 3
SEMANA 4
SEMANA 5
111
Anexo C
COMIT DE ETICA
ACTA DE EVALUACION No 076-14
112
113
16. BIBLIOGRAFA.
Bulfon, M., Carabajal, M., & Porcari, C. (Noviembre de 2012). Diafanizacin y tincin
diferencial de hueso y cartlago en embriones y pequeos vertebrados. H. Rios
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http://rccp.udea.edu.co/index.php/ojs/article/view/825/914
Tilotta F, L. B. (2009). A study of the vascularization of the auricle by dissection and
diaphanization. Surgical And Radiologic Anatomy 31:259265. Recuperado de
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tion_of_the_auricle_by_dissection_and_diaphanization_
Villegas, A. C., Quiroga, M. D., & Cleves, D. (2012). Diafanizacion: visualizacion del
desarrollo oseo en fetos. Recuperado de http://www.pdfio.com/k-3611418.html
115
116

Tincion Con Alizarina

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ELABORACIN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TCNICA DE

DIAFANIZACIN PARA LA ENSEANZA DE LA MORFOGNESIS SEA.

JONATHAN CORONADO CASALLAS

Trabajo de grado para optar al

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

ELABORACIN DE MATERIAL DOCENTE MEDIANTE LA TCNICA DE

JONATHAN CORONADO CASALLAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

A la Dra. Zoila Emilia Castaeda Murcia, Profesora pensionada e invitada de la Maestra

Al Dr Jaime Alfonso Beltrn Guerra, Profesor asociado de la Unidad de Anatoma y

El proyecto de investigacin busca exponer la obtencin de piezas anatmicas diafanizadas

Palabras clave: Diafanizacin, centros de osificacin, fases, ratn y estandarizacin.

Keywords: Diaphanization, ossification centers, stages, mouse and standardization.

6.3.8.4 Desarrollo de la cara. ............................................................................................... 36

11.6 FASE SEIS: PROTOCOLO DE DIAFANIZACIN SEGN EXPERIENCIAS

Fotografa 34. Fijacin en formol al 10% e inmersin en solucin de hidrxido de potasio

La tcnica de diafanizacion la que permite corroborar la secuencia anatmica del proceso

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

2.1 OBJETIVO GENERAL

Establecer protocolo y piezas anatmicas de conservacin con la tcnica de

2.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:

Desarrollar un protocolo de diafanizacin que pueda ser implementado por docentes

Realizar la revisin terica de la tcnica de diafanizacin que permita su

Validar la tcnica, segn revisin terica, con el fin de obtener resultados de

4.1. Antecedentes mundiales

Rodriguez Baeza en colaboracin con M. Rodriguez Palos de la Universidad Autonoma de

El objetivo es evaluar la filtracin marginal coronal de tres materiales restauradores

4.2 Antecedentes latinoamericanos

utilizadas. En conclusin, la tcnica de diafanizacin posibilita corroborar la secuencia

Bulfon, M; Carabajal, M; Porcari,C. en la Universidad Nacional de Crdoba, Argentina,

que tiene como objetivo la capacitacin para la

ejecucin de las tcnicas de tincin diferencial en vertebrados , fueron utilizados un total de

4.3. Antecedentes nacionales.

Los resultados de crecimiento de los centros de osificacin primarios durante el desarrollo

4.4. Antecedentes de investigacin asociados al estudio en la Universidad

5.1.1.1. Tcnica de maceracin de Dawson // Schultz.

El espcimen se encuentra sumergido glicerina, y

en una solucin de KOH, en

concentraciones menores al 15%. En el transcurso de cuatro semanas aproximadamente, se

1. Fijacin de la muestra en formol 10%

a) Solucin de Hidrxido de potasio + H2O al 75 % (KOH 10%,) + 25% de

En la universidad Santo Tomas de Chile (Concha, 2006) se desarrolla as:

b. Solucin de 75% de (KOH 2%)+25%glicerina de tcnica.

5.1.1.2. Mtodo de diafanizacin en peces (Mikolji, 2010)

5.2. Reactivos a implementar en la investigacin.

5.2.1 Hidrxido de potasio.

fcilmente, es altamente inflamable y es soluble en agua. Es utilizada como disolvente

Tabla 1. Datos de seguridad de reactivos.

polvo, uso guantes de Sustancia no expuesto

aire fresco y en caso de peligrosa

(CAS N:56- e irritante No ingerir o inhalar.

6. BIOQUIMCA DE COLORANTES EN TEJIDO OSEO Y CARTILAGO A

dihidroxiantraquinona. Su estructura molecular puede ser vista como derivado de

El rojo de alizarina es utilizado en ensayos bioqumicos para determinar, cuantitativamente

6.2 Azul de alcian.

especficamente por este medio de contraste se vuelven azules o azul-verde despus de la

6.3. Embriologa del tejido seo.

6.3.1. Desarrollo del mesodermo lateral.

6.3.2. rganos derivados del mesodermo paraxial (sistema esqueltico)

6.3.3. Histogenia del cartlago.

Cartlago hialino: el tipo de distribucin ms amplia en articulaciones(cartlagos

Fibrocartlago: como en los discos intervertebrales.

Cartlago elstico: (por ejemplo en el pabelln auditivo)