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APNDICE D: Procedimento de Ensaio
Procedimento de Ensaio
Pgina 1 de 12
MTODO COLILERTTM- 18 E QUANTITRAYTM PARA PESQUISA E
QUANTIFICAO DE COLIFORMES E
ESCHERICHIA COLI
NDICE:
1. OBJECTIVO E MBITO...............................................................................................................................................2
2. REFERNCIAS...............................................................................................................................................................2
3. DEFINIES...................................................................................................................................................................2
4. ADVERTNCIAS E PRECAUES DE SEGURANA...........................................................................................2
5. PRINCPIO ......................................................................................................................................................................2
5.1.AVALIAO E CONFIRMAO ......................................................................................................................................3
6. MATERIAL E EQUIPAMENTO ..................................................................................................................................3
7. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES......................................................................................................................3
8. MODO DE PROCEDER.................................................................................................................................................3
8.1. PREPARAO DA AMOSTRA.........................................................................................................................................3
8.1.1 Amostra de lavados de areia ...............................................................................................................................3
8.1.2 Amostra de gua..................................................................................................................................................3
8.2. EXECUO DO ENSAIO ................................................................................................................................................4
8.3.INCUBAO E DIFERENCIAO ....................................................................................................................................4
9. EXPRESSO DE RESULTADOS .................................................................................................................................4
10. INTERPRETAO DOS RESULTADOS .................................................................................................................4
11. RELATRIO DE ENSAIO ..........................................................................................................................................4
12. VALIDAO DO MTODO.......................................................................................................................................4
12.1.CARACTERSTICAS DE DESEMPENHO DO MTODO ......................................................................................................5
12.1.1.Tipo de amostra.................................................................................................................................................5
12.1.1.1.Amplitude de aplicao ................................................................................................................................................5
12.1.1.2.Limite de deteco ........................................................................................................................................................5
12.1.1.3.Limites de quantificao ...............................................................................................................................................5
12.1.2.Exactido (erros sistemticos) ..........................................................................................................................5

13.1.3.Incerteza ............................................................................................................................................................5
12.1.4.Preciso.............................................................................................................................................................5
12.1.5.Tempo necessrio anlise...............................................................................................................................5
ANEXO I - INFORMAES ADICIONAIS SOBRE COLIFORMES .........................................................................6
ANEXO II - MEIOS DE CULTURA .................................................................................................................................7
ANEXO III - TABELAS .....................................................................................................................................................8
TABELA I - NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE ESCHERICHIA COLI E OUTRAS BACTRIAS COLIFORMES EM QUANTI
TRAYMT DE 51 POOS.........................................................................................................................................................8
TABELA II NMERO MAIS PROVVEL (NMP) DE ESCHERICHIA COLI E OUTRAS BACTRIAS COLIFORMES EM QUANTI
TRAYMT/2000 NMP ...........................................................................................................................................................9
ANEXO IV - FLUXOGRAMA.........................................................................................................................................11
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1. Objectivo e mbito
O mtodo descrito aplicvel pesquisa e quantificao de bactrias coliformes e Escherichia coli
em amostras de gua para consumo humano, de piscinas, de lavagem de areias e a outros tipos de
gua. Pode ser usado para amostras de guas doces superficiais mas no para guas minerais naturais
engarrafadas ou para guas balneares designadas sob a regulamentao das guas balneares.
2. Referncias
Normas
HPA (2004) Enumeration of coliforms and Escherichia coli by Idexx (Colilert TM18) QuantiTrayTM. National Standard Methods W18 issue 2.3.
US EPA 9223 B - Greenberg, A.E.; Clesceri, L.S.; Eaton, A.D.1992. Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association. Washington.
ISO 17994
3. Definies
Bactrias coliformes bactrias que possuem a enzima -galactosidase que metaboliza o substrato
ONPG, com produo de cidos e viragem do indicador para amarelo.
Escherichia coli - bactrias que possuem a enzima -glucoronidase, que na presena do nutriente
MUG muda de incolor para amarela fluorescente, quando observada numa cmara de UV.
4. Advertncias e precaues de segurana

Tomar as precaues habituais num laboratrio de microbiologia para microrganismos do nvel 2.
A luz UV pode causar irritao de olhos e pele. Usar cmara de UV ou culos de proteco e luvas.
5. Princpio
O mtodo ColilertTM -18 detecta simultaneamente Escherichia coli e outras bactrias coliformes na
gua. um mtodo baseado na adio de um substrato amostra, com leitura dos resultados em 18 h.
Para uma semi-quantificao a amostra com o substrato colocada num Quanti-TrayTM e selada de
forma a isolar as vrias clulas.
A mistura da amostra com o substrato incubada a 37 C durante 18 a 22 h.
Os resultados positivos so visveis visualmente, uma vez que, o substrato utilizado constitudo por
indicadores especficos para estas bactrias.
As bactrias coliformes, possuem a enzima -galactosidase que metaboliza o substrato ONPG,
acidificando o meio, o que permite a mudana de cor do indicador para amarelo.
No caso da E. coli, o mecanismo semelhante; a enzima -glucoronidase, actuando sobre o substrato
(MUG), o que permite que a soluo mude de incolor para amarela fluorescente, quando observada
numa cmara de UV.
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5.1.Avaliao e confirmao
Contam-se o nmero de poos amarelos e o nmero de poos amarelos e fluorescentes. A contagem
em NMP de bactrias coliformes e E. coli obtida a partir da tabela ou software apropriado
(fornecido pelo fabricante) (Anexo III)
Este mtodo no necessita de confirmaes.
O mtodo utilizado um mtodo alternativo que permite a deteco e clculo do NMP de E. coli e
outras bactrias coliformes.
6. Material e Equipamento
Material corrente de laboratrio de Microbiologia, e em particular:
7.1. Estufa de incubao,
7.2. Lmpada de Ultravioleta, comprimento de onda 365nm,
7.3. Aparelho Selador de Quanti-trayTM (Quanti-tray 2x).
7. Meios de cultura e reagentes

Neste procedimento s utilizado um substrato cromognico, o ColilertTM-18, que est disponvel
comercialmente (a composio est descrita no AnexoII). As embalagens so constitudas por doses
unitrias, o que elimina a necessidade de preparao.
8. Modo de proceder
8.1. Preparao da amostra
Inicia-se a anlise, de preferncia, imediatamente a seguir colheita da amostra. Se as amostras so
mantidas temperatura ambiente (no escuro, sem exceder 25 C), a anlise deve ser iniciada dentro
de 6 h aps a colheita. Em circunstncias excepcionais, as amostras podem ser mantidas a (5 3) C
at 24 h antes da anlise.
8.1.1 Amostra de lavados de areia
Pesar 50g da amostra de areia com auxlio de uma esptula esterilizada, numa balana monoprato
(d=0,01 g).
Em condies de assepsia, introduzir a amostra de areia num frasco de vidro esterilizado contendo
500ml de gua destilada e esterilizada.
Agitar o frasco durante 30 minutos num agitador rotativo, para garantir uma lavagem eficiente, da
areia.
A partir deste lavado, retirar, em condies de assepsia, uma alquota de 10 ml do sobrenadante,
colocar num recipiente estril prprio e completar com gua destilada estril at perfazer 100 ml.
Adicionar o contedo de uma ampola do meio de Colilert. Agitar at dissolver.
8.1.2 Amostra de gua
Colocar 100 ml de amostra (ou um volume menor completado com gua destilada estril at perfazer
100 ml) num frasco estril e adicionar o contedo de uma ampola do meio. Agitar at dissolver.
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8.2. Execuo do ensaio

Colocar a mistura obtida dentro de Quanti.TrayTM ou Quanti-Tray TM /2000 e fechar no Selador de
Quanti-tray.
8.3.Incubao e diferenciao
Incubar a (37+1) C durante 18 h.
NOTA: Olhar para a fluorescncia com luz UV de 6 watt, 365 nm, num ambiente escuro.
9. Expresso de resultados
Atravs da contagem do nmero de poos amarelos/fluorescentes, determina-se o nmero mais
provvel (NMP), que consta na tabela do Anexo III
10. Interpretao dos resultados

Aparncia
Incolor
Amarelo
Amarelo + Fluorescncia
Resultado
Negativa para coliformes totais e Escherichia coli
Positiva para bactrias coliformes
Positiva para e Escherichia coli
NOTA: Os resultados do ColilertTM-18 so definitivos aps 18 horas. Se a aparncia for duvidosa

reincubar mais 3-4 horas at 22 horas. Os resultados no so vlidos aps 22 horas.
11. Relatrio de ensaio

O relatrio de ensaio deve conter pelo menos a seguinte informao:
a) Referncia ao mtodo,
b) Todos os pormenores necessrios completa identificao da amostra;
c) Expresso de resultados de acordo com a alnea 10;
d) Qualquer ocorrncia observada durante o decurso do ensaio e qualquer procedimento no
especificado no mtodo que pode ter influenciado os resultados.
12. Validao do Mtodo

Especfico de cada laboratrio cada laboratrio deve seguir os seus prprios processos de
validao.
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Foi demonstrada a equivalncia entre este mtodo e o mtodo de referncia num estudo europeu que
serviu de base Norma ISO 17994, que estabelece critrios para a avaliao da equivalncia entre
mtodos microbiolgicos. Posteriormente, foi demonstrada ao Instituto Regulador de guas e
Resduos (IRAR), a equivalncia entre este mtodo e TTC Lactose Agar With Sodium
Heptadecylsulphate (ISO 9308-1:2000) de acordo com a Norma ISO 17994.
12.1.Caractersticas de desempenho do mtodo

12.1.1.Tipo de amostra
Aplicvel a todos os tipos de amostras de gua incluindo guas para consumo humano, superficiais,
balneares* (com excepo de gua salgada), e lavados de areia. principalmente aconselhvel para
guas com grande quantidade de matrias em suspenso.
12.1.1.1.Amplitude de aplicao
12.1.1.2.Limite de deteco
Um microrganismo por 100 mL.

12.1.1.3.Limites de quantificao
Limite inferior - NMP 1 microrganismo por 100 mL de amostra de gua analisada

Limite superior NMP 200,5 microrganismos por 100 mL de amostra de gua analisada num
Quanti- TrayTM de 51 poos.
Limite superior- NMP 2419,6 microrganismos por 100 mL de amostra analisada num Quanti-Tray TM
/2000 NMP.
O limite superior pode ainda ser aumentado se forem analisadas diluies da amostra.
12.1.2.Exactido (erros sistemticos)
No aplicvel directamente. Veja-se resultados da Avaliao Externa da Qualidade.
13.1.3.Incerteza
Especifico de cada laboratrio
12.1.4.Preciso
Especifico de cada laboratrio
12.1.5.Tempo necessrio anlise
Preparao da suspenso e colocao no Quanti TrayTM 5 m.
Incubao a 37C: entre 18 e 22 horas, mais um curto espao de tempo para a contagem de
poos positivos.
Clculo do nmero mais provvel por leitura em tabela muito rpido
Total: Mnimo 18:30 horas
*Para gua salgada existe uma adaptao deste mtodo. Contactar o representante local.
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Anexo I - Informaes adicionais sobre coliformes

Os coliformes so bacilos Gram -negativos, no formadores de esporos, oxidase - negativos, capazes
de crescimento em aerobiose e em anaerobiose (facultativo), na presena de sais biliares (ou outros
agentes tensioactivos, com propriedades semelhantes de inibio do crescimento similares) e que so
normalmente capazes de fermentar a lactose com produo de cido e aldedo em 48 h, quando
incubados a uma temperatura de (362)C. Possuem tambm a enzima -galactosidase.
A E. coli um coliforme capaz de produzir indol a partir do triptofano em (213) h a (44,00,5)C.
Possui a enzima -glucoronidase, d resultado positivo no teste vermelho de metilo, capaz de
descarboxilar o cido L-glutmico, mas no capaz de produzir acetil-metil-carbinol, utilizar o
citrato como nica fonte de carbono ou crescer em caldo KCN (cianeto de potssio).
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ANEXO II - Meios de cultura

Reagente
ColilertTM 18
Composio dos meios de cultura
Contactar o fabricante ou o representante local
Armazenamento
Guardar a 2-25 C ao abrigo da luz solar directa.
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Anexo III - Tabelas

Tabela I - Nmero mais provvel (NMP) de Escherichia coli e outras bactrias
coliformes em Quanti TrayTM de 51 poos
Tabela II Nmero mais provvel (NMP) de Escherichia coli e outras bactrias coliformes em Quanti TrayTM/2000 NMP
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Procedimento de Ensaio
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MTODO COLILERTTM- 18 E QUANTITRAYTM PARA PESQUISA E
QUANTIFICAO DE COLIFORMES E
ESCHERICHIA COLI
Anexo IV - Fluxograma
Pesquisa e quantificao de Escherichia coli e outras bactrias coliformes (NMP),
Mtodo ColilertTM-18
MEDIR
100 ml DA AMOSTRA
PARA FRASCO GRADUADO COM ANTIESPUMA
JUNTAR
O MEIO
100 mL
DE UMA AMPOLA TOMA DA AMOSTRA
100mL
DEIXAR
REPOUSAR
PELO MENOS
10 min
AGITAR
SUAVEMENTE AT DISSOLUO
DEITAR NO QUANTY TRAY ADEQUADO E IDENTIFICADO
(Continua na pgina seguinte)
(Continuao)
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SELAR
INCUBAR COM OS POOS PARA CIMA

NO SOBREPOR MAIS DE 6
18 A 22 HORAS A 37C
Bactrias coliformes
CONTAR O N. DE POOS AMARELOS E ANOTAR
CONTAR O N. DE POOS FLUORESCENTES E ANOTAR
LER NA TABELA NMP
LER NA TABELA NMP
Escherichia coli
APNDICE E:
Laboratrios e pessoal que realizaram as anlises e o estudo
Intituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge com a participao de:

Dra. Leonor Falco, Coordenadora da Unidade de Riscos Ambientais e
Ocupacionais Emergentes Laboratrio de Microbiologia.
Fernanda Oliveira
Raquel Esaguy Rodrigues
Ceclia Maria da Costa Silva
Manuela Barroso
Instituto Tcnico Superior com a participao de:
Dra. Manuela Cadete, Directora do Laboratrio de anlises
Ricardo Santos
Silvia Santos
Ftima Ferreira
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HEPTADECYLSULPHATE (ISO 9308-1:2000) PARA A

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APNDICE D: Procedimento de Ensaio

12.1.2.Exactido (erros sistemticos) ..........................................................................................................................5

4. Advertncias e precaues de segurana

7. Meios de cultura e reagentes

8.2. Execuo do ensaio

10. Interpretao dos resultados

NOTA: Os resultados do ColilertTM-18 so definitivos aps 18 horas. Se a aparncia for duvidosa

11. Relatrio de ensaio

12. Validao do Mtodo

12.1.Caractersticas de desempenho do mtodo

Um microrganismo por 100 mL.

Limite inferior - NMP 1 microrganismo por 100 mL de amostra de gua analisada

Anexo I - Informaes adicionais sobre coliformes

ANEXO II - Meios de cultura

Guardar a 2-25 C ao abrigo da luz solar directa.

Anexo III - Tabelas

DE UMA AMPOLA TOMA DA AMOSTRA

DEITAR NO QUANTY TRAY ADEQUADO E IDENTIFICADO

(Continua na pgina seguinte)

INCUBAR COM OS POOS PARA CIMA

CONTAR O N. DE POOS FLUORESCENTES E ANOTAR

LER NA TABELA NMP

LER NA TABELA NMP

Laboratrios e pessoal que realizaram as anlises e o estudo

Intituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge com a participao de:

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