Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Departamento de Bioqumica
Curso prctico de Mtodos de anlisis
Determinacin de riboflavina por fluorometra
Simn Martnez Luis ngel
Gpo: 5QV1 Secc: 2
Introduccin
La riboflavina se conoca como vitamina B2 y lactoflavina. Su descubrimiento
como uno de los componentes del grupo vitamina B se debe a su fluorescencia
caracterstica y su calidad de pigmento en alimentos tan comunes como la
leche y la yema de huevo. El aislamiento y la caracterizacin de la enzima
proteica amarilla originalmente de la levadura motivaron la realizacin de
estudios sobre el carcter esencial del pigmento flavnico de la enzima en el
metabolismo del ser humano, el crecimiento y la salud.
En solucin alcalina, es soluble con facilidad, pero es bastante inestable al
calor, y a la luz forma lumiflavina, un producto de degradacin fluorescente
que carece de actividad biolgica. La riboflavina es ms estable al calor en
solucin cida, en particular de pH 1 a 6.5 pero ante la irradiacin forma
lumicromo, que tambin carece de actividad biolgica. Las soluciones de
riboflavina tiene una fluorescencia amarillo verde caracterstica, con una
absorcin mxima en 565 nm en el rango de pH cido. Esta propiedad se
aprovecha para la determinacin qumica de riboflavina. Se reduce con rapidez
por hidrosulfito o por hidrogeno en presencia de cinc en solucin cida, a la
forma leuco que es incolora y no fluorescente.
Un gramo se disuelve en 3 000 a 20 000 mL de agua; las variaciones de
solubilidad se deben a diferencias de la estructura cristalina interna de la
riboflavina: es mas soluble en solucin isotnica de cloruro de sodio o alcalina
que en agua, y es menos soluble en alcohol. Es insoluble en la mayora de los
solventes lpidos.
Las determinaciones qumicas se basan en procedimientos colorimtricos y
fluoromtricos. La determinacin directa del color amarilla intrnseco de la
riboflavina suele ser suficiente para el anlisis de preparados farmacuticos. El
mtodo fluoromtrico es ms sensible y esta libre de interferencias y, por lo
tanto, es ms adecuado para el anlisis de la vitamina en alimentos. Depende
de la extraccin de la vitamina con cido diluido, filtracin, tratamiento de
filtrado con permanganato y perxido de hidrogeno para destruir pigmentos
que interfieren y determinacin de la fluorescencia. Los estudios tambin se
pueden efectuar por cromatografa liquida de alta presin y un detector
fluoromtrico.
Objetivo

 Conocer el manejo de un fluormetro de filtros

Determinar el efecto del pH del disolvente sobre la intensidad de
fluorescencia

Resultados
Tabla 1.- Resultados de la curva de calibracin de riboflavina en diferentes
medios
Intensidad de fluorescencia en
Riboflavina (ppm)
H2O
HCl 0.1 M
NaOH 0.1 M
0
4.92
4.89
4.86
1.0
5.99
5.03
4.88
2.0
6.85
5.17
4.89
3.0
7.67
5.30
4.89
4.0
8.62
5.41
4.89
5.0
9.17
5.52
4.90
9.5
9

H2O

8.5
8
Linear7.5
(H2O)

Intensidad de fluorescencia

Linear (HCl 0.1 M)

HCl 0.1 M

7
6.5
6

5.5
NaOH 0.1
5 M

Linear (NaOH 0.1 M)

4.5
0

Riboflavina (ppm)

Grafica 1.- Curva de calibracin de la riboflavina en diferentes medios

Preguntas adicionales
1.-Por qu se deben conocer las longitudes de onda de mxima excitacin y
de mxima emisin?
Al ser estimulados con fotones de una determinada longitud de onda,
denominada de absorcin o excitacin, emiten otro fotn de mayor longitud
de onda, es decir con menor energa. El fluorocromo prototipo es la
fluorescena que al ser estimulada con luz azul (abs.mx. a 495 nm) emite luz
verde (emisin mxima a 520 nm).
Tanto la excitacin como la emisin no son exactas a esa longitud deonda:
aunque la excitacin de la fluorescena sea mxima a 495 nm, tambin es

posible estimular (menos eficazmente) con 470 o con 510 nm, puesto que en
realidad la longitud de onda de excitacin es una campana de Gauss (espectro
de absorcin). Siempre que se hable de excitacin y emisin de un fluorocromo
se entiende que se est hablando de los valores mximos.
2.- Diga cuales son las formas coenzimaticas de la riboflavina y cul es su
papel en el metabolismo celular
Flavn adenn dinucletido interviene en las
reacciones metablicas de oxidacin-reduccin
Flavin mononucletido (FMN), oriboflavina-5'fosfato acta como coenzima de
diversas oxidoreductasas. Es un agente oxidante
ms fuerte que el NAD+ y es particularmente til
que puede tranferir uno o dos electrones

ya

Discusin de resultados
El fluormetro de filtros que utilizamos maneja dos monocromadores que son
filtros que son utilizados para aislar la luz incidente y la luz fluorescente,
seleccionar dos diferentes tipos de longitudes de onda. Los filtros utilizados
fueron para la excitacin fue de 425 nm y para la emisin 540 nm, como se
conoce el de emisin es ms grande que el de excitacin, esto es debido a
procesos de relajacin no radiante.
La riboflavina es una vitamina hidrosoluble que como se observo en las
diferentes soluciones, se disolvi ms rpido en el hidrxido pero como se sabe
es inestable en soluciones lcalis, as que se puede suponer que perdi sus
propiedades y la solucin fue ms rpida por esto y se ve directamente en los
resultados obtenidos con NaOH que como se ve no hay mucha cantidad de
riboflavina. La riboflavina es resistente a los cidos fuertes pero como se
observo en la solucin de HCl est tambin perdi su fluorescencia como se ve
en los resultados obtenidos en la tabla 1. El comportamiento que tuvo con
respecto a los otros disolventes se ve muy claro, solo que a la hora de disolver
fue un procedimiento muy tardado aunque se trate de una molcula
hidrosoluble, como se observa en la tabla 1, los resultados de las
concentraciones fueron muy buenos y se obtiene una curva tipo con mejores
caractersticas que con los disolventes anteriormente usados. Se puede decir
que la riboflavina es muy inestable a diferente pH, debido a que cuando se
tiene en agua su fluorescencia es la esperada y sin en cambio con los otros
disolventes un cido y un lcali, a pesar de tener la misma concentracin en
todas las soluciones las lecturas fueron distintas. En el lcali pierde
completamente su fluorescencia porque las lecturas son muy similares al
blanco, y con el acido se va incrementando la fluorescencia conforme aumenta
la concentracin pero como se observa en la grafica 1, es mucho menor que
cuando est en presencia de agua destilada. En agua destilada se observa una
curva tipo caracterstica donde aumenta la concentracin de riboflavina,
aumenta la intensidad de fluorescencia.
Conclusin

La riboflavina es inestable a pH cido y lcali, mantiene su fluorescencia a pH

neutro (agua destilada)
Bibliografa
Alfonso R. Gennaro Remington Farmacia, Volumen 2 20 edicin. Editorial
Panamericana S. A. Mexico 2003 pg 2170-2171
Adela Mauri Aucejo, Mara Jos Llobat Estells, Rosa Herrez Hernndez.
Laboratorio de anlisis instrumental Editorial PUV ER. Universidad de
Valencia, 2010. Pg 70-75