Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia

Facultad de Ciencias Agropecuarias Ingeniera Agronmica

BACTERIAS FITOPATOGENAS

INTRODUCCION.
Las bacterias son organismos haploides (n), unicelulares, mviles, poseen pared y membrana
celular, pero carecen de membrana nuclear y se reproducen por fisin binaria. La mayora de las
bacterias fitopatgenos tienen forma de bastn (bacilo) y se desplazan en medios lquidos
mediante flagelos que pueden estar ubicados en un extremo (flagelacin polar) o alrededor de toda
la clula (flagelacin peritrica).
Las enfermedades causadas por bacterias se desarrollan en casi cualquier parte en donde haya
suficiente humedad y temperatura alta. Se expresan a travs de marchitez vascular, tizones o
manchas foliares y de frutos o formacin de agallas o tumores. Se han identificado alrededor de
200 especies de bacterias, en 45 gneros, que ocasionan enfermedades en plantas; sin embargo,
los principales gneros son Xanthomonas. Pseudomonas. Erwinia Agrobacterium, Pectobacterium
y Corynebacterium. Todas las especies de estos gneros son bacterias saprofitas facultativas y
pueden cultivarse en medios nutritivos artificiales. Debido a que las bacterias fitopatgenas son
morfolgicamente similares, la diferenciacin entre especies se basa fundamentalmente en
reacciones bioqumicas producidas en medios de cultivo.
Las bacterias sobreviven principalmente en semillas Xanthomonas en frijol, repollo y cereales;
Pseudomonas en tomate, chile y papa; Corynebacterium en semillas de frijol (Erwinia en semillas
de zanahoria, Pseudomonas semillas en tabaco y pepino), aunque tambin lo pueden hacer en
insectos, materia orgnica en descomposicin y an en el suelo.
Cuando se hace un diagnstico de problemas bacteriales se recomienda seguir la siguiente
secuencia:
Caracterizacin de los sntomas en la planta.
Deteccin de la presencia de bacterias en tejidos vegetales.
Aislamiento y purificacin de bacterias en medios artificiales
Pruebas de patogenicidad.
Caracterizacin final e identificacin de gneros y/o especies.

CARACTERIZACION DE LOS SINTOMAS EN LA PLANTA

La marchitez vascular es un sntoma producido principalmente por bacterias de los gneros
Pseudomonas y Erwinia. Estas bacterias se multiplican en el interior de tos haces vasculares de las
plantas, bloqueando el paso del agua y nutrimentos de las races fiada los tejidos areos de la
misma. Como resultado de este taponamiento, la planta presenta sntomas de marchitez. Debido a
la gran capacidad reproductiva de las bacterias, estos sntomas se manifiestan en un tiempo
relativamente corto, por lo cual, no obstante que las hojas mantienen su color verde, presentan una
consistencia flcida. Las races de las plantas afectadas permanecen en buen estado, pero los
vasos del xilema pueden estar destruidos o llenos de sustancias producidas por las bacterias, que
en ocasiones se oxidan produciendo un color oscuro en los haces del xilema.

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Los tizones y manchas foliares o de frutos se caracterizan por presentar lesiones de aspecto
hmedo. Alrededor del rea necrosada se puede observar tejido de aspecto "aguado" debido a
que las bacterias maceran el tejido mediante enzimas haciendo que el contenido de las clulas
fluya fuera de ellas. Los principales gneros productores de manchas y tizones foliares son
Xanthomonas. Pseudomonas y Erwinia. Generalmente los sntomas de tizones foliares se
observan primero en los bordes de las hojas debido a que las bacterias penetran principalmente
por los hidtodos, aunque tambin lo hacen por los estomas y por heridas causadas por accin de
insectos, viento, partculas de suelo que chocan con las hojas, o por el ser humano. En algunas
plantas dicotiledneas las lesiones pueden tener forma circular o de forma irregular, mientras que
en otras y en gramneas las lesiones estn delimitadas por las venas, lo cual les confiere un
aspecto angular y de rayado. En ocasiones, adems del rea macerada, se observa un halo
amarillo muy vistoso; tal es el caso de las lesiones producidas por bacterias del gnero
Xanthomonas en frijol y repollo. Las lesiones a menudo se unen destruyendo grandes reas del
tejido.
Las agallas o tumores son producidos principalmente por bacterias del genero Agrobacterium.
Estos tumores se producen principalmente en la parte baja del tallo de las plantas afectadas en
respuesta a la inoculacin de metabolitos producidos por las bacterias, aunque a veces tambin
se pueden observar en ramas bajas.

DETECCION DE LA PRESENCIA DE BACTERIAS EN TEJIDO VEGETAL

Deteccin en Tallos
Materiales:

* Tallos de plantas con sntomas de marchitez vascular.

* Vasos de decantacin.
* Agua limpia, bistur y microscopio compuesto.
Procedimiento:

Los tejidos a utilizar en esta prueba deben ser previamente lavados con agua corriente durante
varios minutos para eliminar la mayor cantidad posible de contaminantes. En el caso de una planta
con Sntomas de marchitez vascular, se hace un corte en diagonal en el cuello de la planta y se
coloca el tallo en un vaso conteniendo suficiente agua que cubra al menos 3/4 partes del vaso. Al
cabo de unos minutos, generalmente no ms de 4 5, se observar la salida de un flujo
blanquecino a partir de los haces vasculares del tejido (Figura 1).

Figura 1. Flujo bacterias observado en un vaso de decantacin que sale del tallo de una
planta afectada por marchitez vascular

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AISLAMIENTO Y PURIFICACION DE BACTERIAS EN MEDIOS ARTIFICIALES

Aislamiento de bacterias.
Materiales:

Material vegetal con sntomas de enfermedad bacterias.

Agua destilada esterilizada.
Cajas de Petri conteniendo medio de cultivo nutriente-agar (peptona 5 g + extracto de
carne 3 g + agar 15 g + 1 litro de agua destilada).
Asa bacteria

Procedimiento:

Una vez que la muestra ha sido colectada del campo y llevada al laboratorio, se procede a lavara
con abundante agua de la llave a fin de eliminar la mayor cantidad de contaminantes que pueda
tener. Este lavado puede durar de 2 a 5 minutos, aunque en muestras que estn contaminadas por
saprofitos el lavado puede durar hasta 1 hora.
Una vez lavado el tejido, en un ambiente asptico se corta un pedazo de aproximadamente 1 mm
de ancho y no ms de 3 mm de longitud, que incluya el rea prxima a la seccin que ya est
necrosada (Figura 2).
Este tejido se picar muy finamente utilizando un bistur esterilizado y se mezclar con unas gotas
de agua destilada esterilizada con NaCl 1%. La muestra se dejar reposar por unos 2 a 4 minutos
para permitir que las bacterias fluyan al lquido. Con un asa bacterias se tomar una muestra de
esta suspensin y se proceder a realizar un rayado continuo sobre la superficie de un plato de
Petri conteniendo un medio de cultivo apropiado segn la bacteria (Figura 3). El asa debe sujetarse
en un ngulo aproximado de 45 con respecto a la superficie del substrato, procurando no
separarlo hasta no haber terminado el rayado. Otra forma de inocular el plato es mediante el
rayado mltiple en el cual se hace una serie de pequeos rayados, luego se levanta el asa y se
quema antes de seguir con el siguiente rayado, este procedimiento se repite hasta cubrir el plato
completo (Figura 3). Los platos inoculados se incuban a temperaturas generalmente altas (26 a
28C) y al cabo de 2 3 das se pueden aislar aquellas colonias que se observan bien definidas y
solitaria.

Figura 2. rea de corte en una hoja mostrando sntomas de un tizn bacterias.

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Figura 3. Diagrama de dos tipos de rayado en platos de Petri. A. Un solo rayado, B. Rayado mltiple y
continuo a partir de una asada bacterial.

PURIFICACIN DE COLONIAS
Materiales:

* Platos de Petri con cultivos bacteriales.

* Tubos de ensayo conteniendo 2 ml de agua destilada esterilizada.
* Cajas de Petri con nutriente-agar.
* Asa bacterial, mechero.
Procedimiento:

Con el asa bacterial se toman muestras de aquellas colonias que se observan aisladas de las
dems y se suspenden en 2 ml de agua destilada esterilizada. Esta suspensin se agita
suavemente hasta que se observe que en el agua no hay grupos slidos de bacterias. Una vez
logrado esto, se esteriliza el asa bacterial en un mechero y se toma una muestra de la suspensin,
la cual se deposita en platos con el nuevo medio. La tcnica a utilizar para el rayado es
preferiblemente la ilustrada en la figura 3, .
Las bacterias fitopatgenos son ms lentas que las saprofitas para desarrollar colonias visibles en
medios artificiales de cultivo. Normalmente, las primeras se observan despus de 48-72 horas de
haber sido sembradas, mientras que las saprofitas se observan a las 24 horas. La purificacin de
colonias se realiza mediante siembras sucesivas en el medio elegido; sin embargo, se debe cuidar
de no hacer ms de 3 4 siembras sucesivas a partir de una misma colonia debido a que algunas
de las bacterias pueden perder de esta manera su virulencia o patogenicidad.

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CARACTERIZACION INICIAL DE LOS AISLAMIENTOS

Normalmente al hacer el aislamiento de bacterias a partir de tejido vegetal enfermo, se obtiene una
variedad de formas y colores de colonias desconocidas. Algunas de las pruebas que a
continuacin se describen son tiles para identificacin de bacterias patognicas.

Tincin de Gram:
Materiales:

Colonias de bacterias creciendo en forma activa (colonias no mayores de 2 a 3 das de

edad son ptimas).
Tinte violeta de genciana (disolver en agua destilada tinte de cristal violeta 0.5%
peso/volumen + metano! 20% peso/volumen + oxalato de amonio 0.8% peso/volumen).
Solucin decolorante (mezclar 1 parte de acetona + 3 partes de alcohol isoproplico).
Solucin de safranina (disolver en agua destilada el tinte safranina O 1% peso/volumen).

Procedimiento:
Se selecciona una muestra de la colonia bacterial, se diluye en la cantidad de agua que toma un
asa bacterial de laboratorio y se esparce en una lmina portaobjetos. Se deja secar y se pasa
ligeramente por el fuego de un mechero para fijar las bacterias. Una vez hecho esto, se depositan
varas gotas de violeta de genciana sobre las bacterias y se espera un minuto. Se lava con agua
de la llave corriente y se sacude. El remanente de agua se elimina depositando varias gotas de la
solucin de yodo, la cual se deja por un minuto. Se enjuaga con agua de la llave y se sacude. Se
coloca la lmina en forma inclinada, se le echa el decolorante gota a gota hasta que se vea que no
sale color y se enjuaga con agua (normalmente tarda de 10 a 20 segundos). Finalmente se echa la
safranina, se deja reposar por un minuto y posteriormente se enjuaga con agua de la llave.
La observacin al microscopio compuesto debe hacerse de clulas aisladas y puede lograrse
utilizando el aumento de 40 X o con la ayuda del aceite de inmersin en el aumento de 100 X. Las
bacterias Gram positivas tien azul y las Gram negativas tien rojo o rosado. La gran mayora de
bacterias fitopatgenas presentan reaccin negativa a la tincin de Gram a excepcin de las
bacterias del gnero Corynebacterium.

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Cultivo en medios especiales:

Debido a que las bacterias son morfolgicamente similares, la diferenciacin de algunos gneros
debe hacerse mediante el uso de medios artificiales relativamente sencillos, siguiendo el esquema
desarrollado por Schaad (Figura 4).
Formacin de colonias en medios artificiales: Todas las bacterias fitopatgenas crecen en medio
que contiene nutriente-agar. Sin embargo, la adicin de algunos compuestos o sustancias puede
inhibir el desarrollo de un gnero o especie particular de bacteria.

Figura 4. Esquema de Schaad para identificar bacterias fitopatgenas.

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OTRAS CARACTERSTICAS PARA LA IDENTIFICACIN DE BATERAS.

Olor de las colonias_______________________________

Color __________________________________________
Forma (lisa, rugosa, alargada)_______________________
Elevacin_______________________________________
Tasa de crecimiento_______________________________
Brillo___________________________________________

REFERENCIAS
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