Teknik Elektroforesis DNA

Elektroforesis gel agarose banyak digunakan analisis of

DNA
Gel elektroforesis gel merupakan prosedure
untuk memisahkan molekule berdasarkan
kecepatan bergerak melalui gel dibawah
pengaruh medan listrik .
Elektroforesis gel agarosa digunakan secara rutin untuk
preparasi dan analisis DNA
Kita akan menggunakan elektroforesi gel agarosa untuk
menetapkan adanya dan ukuran hasil PCR.

 DNA bermuatan negatif.

Jika diletakan pada medan listrik, DNA bergerak ke kutub positif
(anode).
Gel agarose digunakan untuk memperlambat memperlambat gerakan DNA
dan terpisah berdasarkan ukurannya.

O2

DNA

Power

+
Gel agarose berpori-pori, DNA
bergerak melewati
Scanning Electron Micrograph of
Agarose Gel (11 m)

Seberapa cepat DNA migrasi?

Kekuatan medan listrik, bufer, konsentrasi gel agarose
ukuran DNA!
*DNA berukuran kecil bergerak lebih cepat daripada DNA yg panjang
elektroforesis memisahkan DNA berdasarkan ukurannya

DNA
kecil

Power

besar

Dalam gel agarose, DNA linier migrasi berbanding

terbalik dengan log10 ukuran molekular.

Agarose

D-galactose

3,6-anhydro
L-galactose

Sweetened agarose gels have

been eaten in the Far East
since the 17th century.
Agarose was first used in
biology when Robert Koch*
used it as a culture medium for
Tuberculosis bacteria in 1882

Agarose merupakan polimer linier diekstrasi dari rumput laut.

Membuat Gel Agarose

Gel agarose dibuat dengan

mendidihkan serbuk
agarose dalam larutan
bufer.

Bufer

Labu utk mendidihkan

Agarose

Electrophoresis Equipment
Power supply
Tutup

Tangki Gel
Kabel

Casting tray
Sisir Gel

Gel casting tray & combs

Preparing the Casting Tray

Seal the edges of the casting tray and put in the combs. Place the casting
tray on a level surface. None of the gel combs should be touching the
surface of the casting tray.

Agarose

Larutan bufer

Campur serbuk agarose dan larutan bufer. Use a flask that is

several times larger than the volume of buffer.

Membuat Gel Agarose

Agarose tidak larut pada suhu kamar (kiri).

Larutan itu dididihkan sampai jernih (kanan).
Gently swirl the solution periodically when heating to allow all the grains of agarose
to dissolve.
***Be careful when boiling - the agarose solution may become superheated and may
boil violently if it has been heated too long in a microwave oven.

Menuangkan gel

Diamkan larutan agarose mendingin (~60C) dan kemudian

tuangkan dalam cetakan. Jangan sampai ada gelembung udara.

Each of the gel combs should be submerged in the melted agarose solution.

Ketika dingin, agarose polimerisasi, membentuk gel yg fleksibel.

Setelah dinging (30-45 minute) gel berwarna agak putih. Hati-hati copot
sisir dan selotape.

Letakkan gel dalam alat elektroforesis.

DNA
buffer

wells

Cathode
(negative)

Anode
(positive)

Tuangkan bufer sehingga diatas gel +/- 1 mm. Cak setiap

sumuran terisi bufer.

Preparasi Sample
Campur sample DNA dengan bufer sampel. Ini memudahkan sampel
masuk kedalam sumuran, karena adanya gliserol yg memperberat
sampel.

6X Loading Buffer:
Bromophenol Blue (for color)
Glycerol (for weight)

Memasukkan sampel ke Gel

Carefully place the pipette tip over a well and gently expel the sample.
The sample should sink into the well. Be careful not to puncture the
gel with the pipette tip.

Running the Gel

Letakkan penutuo, hubungkan dengan kabel, hubungkan dengan power

supply. Cek kabel terhubungkan dengan benar - DNA migrasi ke anode
(merah). Jika dihidupkan, terbentuk gelembung pada elektrode

Cathode
(-)
wells
Bromophenol Blue

DNA
(-)

Gel
Anode
(+)
Setelah dihidupkan, cek bahwa warna bergerak pada arah yg benar.
Bromophenol blue bergerak serah dg DNA.

Standar tangga DNA

12,000 bp
5,000

DNA
migration
Note: bromophenol
blue migrasi = 300 bp
DNA

bromophenol blue

2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100

+
Inclusion of a DNA ladder (DNAs of know sizes) on the gel
makes it easy to determine the sizes of unknown DNAs.

As an alternative to purchasing costly DNA ladders, one can be created

using meal worm (Tenebrio molitor) DNA and a restriction enzyme.

http://people.uis.edu/rmosh1/DNAexerciseVIIa02.pdf

Pewarnaan Gel
Etidium bromide interkalasi pada DNA dan berfluoresensi pada
sinar UV, menyebabkan DNA terlihat pada Gel.
Etidium bromide dapat ditambahkan pada gel atau pada buf
elektroforesis sebelum atau sesudah elektroforesis.

***PERHATIAN! Etidium bromide merupakanl mutagen kuat

dan toksik. Sarung tangan harus dipakai setiap waktu.

Pewarna lain yg lebih aman

Methylene Blue
BioRAD - Bio-Safe DNA Stain
Wards - QUIKView DNA Stain
Carolina BLU Stain

others
keuntungan
Tidak mahal
Kurang toksik
Tidak perlu sinar UV
Tidak ada sisa bahan berbahaya

kerugian
Kurang peka
diperlukan DNA lebih banyak pada gel
Perlu waktu pewarnaan lebih lama

Pewarnaan Gel

Letakan gel pada nampan yang berisi larutan pewarna hangat.

Diamkan gel selama 25-30 minute.
untuk menghilangkan kelebihan pewarna, diamkan gel dalam air.
Ganti air beberapa kali supaya efisien.

Etidium Bromide sumber sinar ultraviolet untuk dapat dilihat

Visualisasi DNA (etidium bromide)

DNA ladder
1

DNA ladder
8

wells

5,000 bp
2,000
1,650
1,000
850
650
500
400
300
200
100

PCR Product
Primer dimers

Samples # 1, 4, 6 & 7 were positive for Wolbachia DNA

Visualisasi DNA (QuikVIEW )

wells

DNA ladder

PCR
Product

+ - - - - + + - - + - +

2,000 bp
1,500
1,000
750
500
250

Samples # 1, 6, 7, 10 & 12 were positive for Wolbachia DNA

March12,2006