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Reacciones de Precipitacin
Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Facultad de Estudios Superiores Zaragoza
Laboratorio de Inmunologa L-121, Campus I
Prez Prez Jos Manuel ____________
Prez Sevilla Alma Beatriz ____________
Equipo 3, Grupo 2802
Introduccin:
Los ensayos inmunolgicos se basan en la
especificidad de la unin Ag.- Ac. La unin antgenoanticuerpo depende de la complementariedad entre
ambas molculas.
En la interaccin in vitro de un Ag. con su
correspondiente Ac. se distinguen 2 etapas
1 Interaccin primaria: unin de un Ag. y su
correspondiente Ac. No es visualizable directamente y
no es demasiado influenciada por la temperatura, la
concentracin salina o la fuerza inica ni la agitacin.
Slo depende de la complementariedad.
2 Interaccin secundaria: los complejos inciales,
se agregan para dar diferentes fenmenos visibles
cuya caracterstica depender principalmente de la
naturaleza del antgeno. Esta etapa se acelera con la
temperatura, la agitacin y es dependiente de la
concentracin de electrolitos.
Las reacciones de interaccin secundarias son:
Precipitacin:
En este caso el antgeno es una molcula soluble y al
ponerse una solucin del mismo, en contacto con los
anticuerpos que origin, se forman complejos Ag-Ac
que al insolubilizarse en su mayor parte, dan una
reaccin de precipitacin, se desarrolla rpidamente
formndose los complejos Ag-Ac. despus los
complejos se agregan formando micelas o redes que al
alcanzan determinado tamao y precipitan. Esta etapa
se acelera con el aumento de la T (se la lleva a cabo
normalmente a 37C) y es adems dependiente de la
concentracin de electrolito.
Objetivo:
Evaluar y comparar los diferentes mtodos de
precipitacin,
como
precipitacin
en
capilar,
Inmunoelectroforesis, precipitacin en gel por mtodo de
Ouchterlony, Contrainmunoelectroforesis con en diferentes
antgenos, y anticuerpos.
Diagrama de Flujo:
Inmunoprecipitacin en capilar
Dividir 12 capilares en 4
Realizar diluciones del suero de rata (Ab)
Barnizar con
agarosa al 0.1%
-Electroforesis
La electroforesis en acetato de celulosa separa las
protenas del suero en cinco fracciones que son la
albumina y la globulinas (alfa 1, alfa 2, beta y gama)
Perforar el agar
conagujeros.
Adicionar antgeno
en los pozos
inferiores Incube 24
horas en cmara
hmeda
Adicionar un
anticuerpo en el
pozo superior
Resultados:
Inmunoelectroforesis
En una placa con agar
realizar un canal y dos
perforaciones colocar
en una el suero
problema y en el otro
gammaglobulina
Precipitacin en capilar.
Tabla 1.Precipiracin del complejo (Antigeno-Ancicuerpo) en
milmetros (mm) con respecto a la concentracin de Antigeno
adicionada (%/mL).
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
1:256
1:512
Concentracin
%/mL
100.0000
50.0000
25.0000
12.5000
6.2500
3.1250
1.5625
0.7812
0.3906
0.1953
11 Blanco
Antisuero de Rata
Negativo
12 Blanco
Suero de Rata
Negativo
Tubo
Adicionar azul de
bromofenol y correr la
electroforesis por 30
minutos a
30miliamperes
Adicionar antisuero
humano y dejar
precipitar durante 24
horas en cmara
hmeda
Contrainmuno
electroforesis
Precipitacin
(mm)
15
10
9
8
7
5
4
3
2
1
Realizar en un
gel de agarosa
dos perforaciones
oresis
16
14
Colocar en un
pozo el antgeno,
y en otro el
anticuerpo y
ejercer corriente.
Por 30 minutos
Precipitacin (mm)
Dilucin
12
10
8
6
4
2
0
-5.00 5.00 15.00 25.00 35.00 45.00 55.00 65.00 75.00 85.00 95.00105.00
% de Antigeno/mL
Mtodo de Ouchterlony
Se realizo 3 sistemas en una placa de agarosa como se
muestra en la imagen
Anti-AHV
No
Identidad
Anti- GM
Anti-AHV
Identidad
Anti-AHV
AHM
Negativo
AHV
Negativo
AHV
GH
AHV
Negativo
Negativo
Negativo
AHV
Negativo
Identidad
cruzada de
AHM y AHV
Precipitado
Precipitado
Curva
homognea de
precipitacin
Mltiples bandas
Varias bandas
Mltiples bandas
Una banda en
Gamaglobulina
Electroforesis
Se diseo un sistema con tres muestras los cuales se colocaron
por duplicado y triplicado, en acetato de celulosa.
Suero humano
globulina
Contrainmunoelectroforesis
El sistema se diseo con Gammaglobulina Humana, GHM
y Anticuerpo para Globulina Humana ANTI-GMH.
Albmina humana
Suero humano
globulina
Albmina humana
Suero humano
globulina
Imagen D. Corrimiento electrofortico de 8 muestras,
Negativo a
precipitacin
Precipitacin
Inmunoelectroforesis
Inmunoelectroforesis, mediante Suerto Total Humano, y
Gamaglobulina Humana, en el canal se deposito Antisuero
total
Anlisis de Resultados:
Precipitacin en capilar
La concentracin del suero de rata se tomo a una
concentracin de 100%/mL debido a que no se
conoca la concentracin, adems el suero proviene
de un animal previamente sangrado. Tabla 1.
Mtodo de Ouchterlony
Mediante este mtodo se diseo tres sistemas para la
identificacin de antgenos con identidad parcial, no
identidad y identidad total, se esperaba como lo indica
la tabla 2, que en los tres sistemas se registrara
precipitacin con sus respectivos resultados, sin
embargo al realizar la lectura a las 72 h, no se obtuvo
precipitacin, probablemente a una nula zona de
equilibrio entre el anticuerpo y el antgeno, llenado
inadecuado, velocidad de difusin tarda, incubacin y
que los recipientes de antgenos o anticuerpos
estuvieran contaminados, todos estos factores,
probablemente con llevaron a no observar
precipitacin.
Mtodo de Contrainmunoelectroforesis
En ste mtodo se esperaba la una zona de
precipitacin en la cual el anticuerpo de
gammaglobulina humana hubiera precipitado al
antgeno gammaglobulina humana Imagen B, sin
embargo no se observo, posiblemente a que se haya
colocado de manera inadecuada el antgeno y
anticuerpo, o que ambos no se correspondieran Tabla
2, tambin es posible a una nula zona de equilibrio,
as como tiempo de incubacin o contaminacin de
ambos reactivos.
Conclusin:
Con base en el anlisis de resultados, se cumpli de
manera parcial el evaluar y comparar los mtodos de
precipitacin en capilar, mtodo de Ouchterlony,
Contrainmunoelectroforesis,
Inmunoelectroforesis
y
electroforesis, con diferentes antgenos y anticuerpos
respectivos, debido a que solo se logro evaluar los mtodos
de Inmunoelectrodifusin y electroforesis, se debe
considerar que el estudio no se llevo bajo condiciones
estandarizadas como el manejo de la muestra, tratamiento
y errores del operador, factores que contribuyeron a un no
cumplimento total de los objetivos.
Referencias:
Gualde N, Bourinat-Lafon J. Inmunologa. Mxico: Ed. Norma,
1994: Vol. 20: 23-50
Hudson L. C. Hay F. Inmunologa prctica. Espaa: Ed. Jims,
1979: 27-51.
Roitt I, et al. Inmunologa. 5 edicin. Espaa: Harcourt, 2000:
1- 26
Anbal Margni R. Inmunologa e inmunoqumica fundamentos.
Argentina: Ed. Panamericana, 1996: 418-423.
Mtodo de Inmunoelectrodifusin.
En una primera etapa se lleno un pozo con Suero
Humano Total (parte superior) y en otro con
Gammaglobulina (parte inferior) purificada en
sesiones anteriores, se realiza la electroforesis en la
cual separo cada muestra en su carga y peso,
posteriormente se utilizo un antisuero humano el cual
se coloco en el pozo entre cada muestra y con ello se
comparo las bandas del suero total humano contra
antisuero total, en la cual se observo mltiples bandas
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