BAHAN DAN METODA

Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Oktober 2008 sampai Maret 2009.
Tempat penelitian di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Kampus IPB Darmaga Bogor.
Bahan
Isolat bakteri denitrifikasi yang digunakan adalah isolat NFR1, NFR4 yang
diisolasi oleh Marnis (2008) dari muara sungai Cimandiri Pelabuhan Ratu
Sukabumi, isolat LNF, HNF5 oleh Syahputra (2008) dari muara sungai Cisadane
Tanggerang Banten. Isolat-isolat tersebut merupakan koleksi Laboratorium
Mikrobiologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. IPB Bogor.
Konfirmasi dan Peremajaan Isolat
Isolat bakteri ditumbuhkan pada medium agar padat denitrifikasi dengan
metode gores secara kuadran dan diinkubasi selama tujuh hari di dalam Anaerobik
Jar BBL (Oxoid Ltd.Hamspire. England) selama 7 hari. Medium denitrifikasi
yang digunakan memiliki komposisi perliter sebagai berikut: 10 g Natrium asetat,
4,2 g NaNO3, 3,0 yeast ekstrak, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,9 g K2HPO4.3 H2O , 0,5 g
MgSO4.7H2O, 0,2 g KH2PO4, 0,1 g CaCl2.2H2O dengan salinitas 2% dan pH 7
(Rodina 1972). Media padat dibuat sama dengan media cair ditambah agar Bacto
20 g per liter. Media disterilisasi pada suhu 121C dengan tekanan 1 atm selama
15 menit.
Koloni-koloni yang tumbuh terpisah kemudian digores kuadran lagi sampai
didapatkan koloni-koloni yang murni. Isolat murni yang didapat disimpan pada
medium agar miring dan gliserol sebagai biakan stok. Kemudian dilakukan
pengamatan morfologi koloni meliputi; bentuk, warna dan tepian. Karakterisasi
dan morfologi dilakukan dengan teknik pewarnaan gram dan diamati dibawah
mikroskop (Hadioetomo 1983).
Konfirmasi isolat secara fisiologi dilakukan dengan uji fermentasi
menggunakan glukosa sebagai sumber karbon dan bromcressol purple sebagai

12
indikator keasaman pada tabung reaksi dengan tutup ulir. Inkubasi dilakukan pada
kondisi anaerob. Uji dilakukan untuk melihat kemampuan fermentasi tiap isolat.
Hasil positif ditunjukan dengan berubahnya warna medium dari ungu menjadi
kuning. Jika tidak ada perubahan warna berarti isolat bukanlah bakteri fermentatif.
Peremajaan bakteri pada medium cair dilakukan dengan cara memasukkan
medium cair sebanyak 20 ml ke dalam botol yang berukuran 75 ml . Dibuat
kondisi anaerobik dengan cara menghilangkan oksigen yang terdapat di dalam
tabung. Gas nitrogen bebas oksigen dialirkan ke dalam botol reaksi dengan
menggunakan jarum/syringe steril selama 5 menit. Sebelum gas dimasukkan gas
terlebih dahulu disaring dengan filter steril diameter 47 mm dengan ukuran 0,45
mikro meter. Masing-masing isolat diinokulasikan sebanyak 1 ml dengan jarum
suntik steril, kemudian diinkubasikan pada suhu 28-310C selama 48 jam,
kemudian sebanyak 1ml isolat yang telah diinkubasi diinokulasikan kembali ke
dalam 50 ml medium cair, diinkubasi selama 24 jam. Isolat yang sudah
diremajakan ini dipakai untuk perlakuan selanjutnya.
Uji Aktivitas Reduksi Nitrat untuk Pemilihan Isolat
Pengukuran aktivitas reduksi nitrat pada konsentrasi oksigen berbeda
dilakukan dengan menggunakan 7 botol serum steril 75 ml yang ditutup dengan
butyl rubberseptum. Setiap botol diisi dengan 23 ml medium cair, volume head
space 50 ml.
Selanjutnya dibuat komposisi saturasi udara pada head space dengan
konsentrasi 0%, 1%, 10%, 30%, 50%, 80% dan 100%. Pengkondisian saturasi
udara dilakukan dengan memperhitungkan volume head space botol serum.
Konsentrasi udara 0% didapatkan dengan cara mengalirkan gas Nitrogen bebas
oksigen (OFN) selama lima belas menit. Saturasi udara 1% dengan cara di OFN
kemudian dikeluarkan 0.5 ml gas dalam botol dan dimasukan 0,5 ml udara.
Saturasi udara 10% dibuat dengan mengeluarkan 5 ml gas dari dalam botol dan
memasukan 5 ml udara. Konsentrasi saturasi udara 30% dilakukan dengan
mengeluarkan 15 ml gas dari dalam botol dan dimasukan 15 ml udara. Saturasi
udara 50 % dengan cara mengeluarkan 25 ml gas dari botol lalu dimasukan 25 ml

13
udara saturasi. Konsentrasi 80% dilakukan dengan mengeluarkan 10 ml gas dari
botol dan dimasukan 40 ml udara. Kegiatan tersebut dilakukan secara aseptik.
Konsentrasi saturasi udara 100% adalah botol yang terisi media tanpa perlakuan
OFN. Sebanyak 1ml isolat peremajaan diinokulasikan kedalam botol yang telah
terisi media dan telah dikondisikan konsentrasi saturasi udaranya, dan diikubasi
selama 96 jam (Su et al 2001) pada suhu ruang 28-31C diatas mesin penggoyang.
Setelah diinkubasi pada konsentrasi oksigen yang berbeda, dilakukan
pengukuran densitas sel dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 620
nm. Kultur biakan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit
untuk mendapatkan supernatan. Selanjutnya supernatan kultur biakan di analisis
untuk diuji kadar nitat, nitrit dan amoniumnya.
Analisis nitrit
Analisis nitrit menggunakan metode Sulfanilamide Cleseri et al (1989).
Nitrit dengan amina aromatik pada sulfalinamide akan membentuk diazonium.
Senyawa tersebut dengan NED (N-I-Naphtyl Ethylene Diamine Dyhidrochloride)
membentuk gugus kromofor yang berwarna merah muda (Lampiran 5). Kadar
nitrit ditentukan dengan cara memasukkan 5 ml sampel yang telah diencerkan
kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,1 ml sulfadilamid dan dikocok, setelah
homogen lalu ditambahkan 0,1 ml Naftalena Etilena Diamina (NED) kemudian
didiamkan selama 30 menit dan diukur dengan spektrofotometer pada panjang
gelombang 540 nm. Nilai absorban yang diperoleh kemudian dikonversi dengan
menggunakan kurva standar hingga diperoleh satuan konsentrasi dalam (mM).
Kurva standar natrium nitrit dengan konsentrasi : 0; 0.2; 0,4; 0,6; 0,8, dan 1,0 mg/l
digunakan untuk menentukan konsentrasi nitrit pada sampel (Lampiran 9)
Analisis nitrat
Analisis senyawa nitrat dengan menggunakan metode Greenberg (1992).
Kadar nitrat ditentukan dengan cara memasukkan 20 ml sampel yang telah
diencerkan ke dalam tabung reaksi lalu dilewatkan di kolom cadmium. Selama
melewati kolom,

nitrat akan direduksi menjadi nitrit. Sampel sebanyak 5ml

14
diberi reagen seperti pada analisis nitrit dan diukur pada panjang gelombang
540 nm. Konsentrasi nitrat akan didapatkan dengan mengurangkan nitrit yang
dihasilkan setelah melewati kolom dengan nitrit yang tidak melewati kolom. Nilai
absorban dikonversi dengan menggunakan kurva standar nitrit.
Analisis amonium
Pengukuran konsentrasi amonia menggunakan metode phenate (Cleseri
et al.1989) kadar amonia ditentukan dengan cara 5 ml sampel yang diencerkan,
dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 0,2 ml larutan fenol alkohol
(C6H5OH) lalu dihomogenkan, diamkan selama 1 menit lalu tambahkan 0,2 ml
Na-Dihidro Nitroprusid(Na2[Fe(CN)NO]2H2O), kemudian ditambahkan 0,5 ml
larutan oksidan yang terdiri dari Natrium Sitrat (C6H5Na3O7.2H2O) dan Natrium
hipoklorit (NaOCl2) dan dibiarkan selama satu jam pada suhu ruang (28-31)o C.
Sampel yang telah direaksikan dengan reagen akan membentuk indofenol
berwarna biru diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 640 nm
(Lampiran 6). Konsentrasi amonium dalam (mM) didapat setelah dikonversi
dengan menggunakan kurva standar amonium. Kurva standar amonium klorida
sebesar: 0; 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 2,0; 4,0; dan 8,0 mg/l digunakan untuk menghitung
konsentrasi amonium pada sampel (Lampiran 10).
Setelah masing-masing sampel diketahui kandungan

nitrat (NO3), nitrit

(NO2) dan amonium (NH4). Jumlah nitrat yang tereduksi dengan rumus :
[NO3-]red
%

[ NO3-]red

= [NO3-] kontrol [NO3-]inokulasi

= [NO3-] red
[NO3-] kontrol

X 100

Jumlah senyawa nitrit yang terbentuk dihitung dengan humus:

[NO2]terbentuk

[NO2]perlakuan [NO2]kontrol

%[NO2]terbentuk

[NO2]perlakuan [NO2]kontrol
[NO3] tereduksi

X 100

15
Jumlah senyawa amonium yang terbentuk dihitung dengan rumus:
[NH4+]terbentuk

[NH4+]perlakuan [NH4+]kontrol

%[NH4+]terbentuk

[NH4+]perlakuan [NH4+]kontrol
[NO3-] tereduksi

X 100

Estimasi gas yang terbentuk dihitung dengan rumus

[Gas ]

[NO3-]tereduksi [NO2-] terbentuk [NH3-] terbentuk

%[ Gas]

[Gas ]
[NO3-] red

X 100

Keterangan : Konsentrasi nitrat kontrol didapatkan dari sediaan medium steril

tanpa bakteri.
Uji Aktivitas Reduksi Nitrat dan Kinetika Isolat Bakteri Denitrifikasi
Dua isolat terbaik dalam mereduksi nitrat, dan responsif terhadap perbedaan
konsentrasi oksigen dipilih untuk diuji dan diamati kinetikanya. Botol serum steril
volume 125 ml diisi dengan media 50 ml medium cair. Sebanyak 1ml kultur
peremajaan diinokulasikan pada masing-masing media pada botol serum. Saturasi
udara pada head space dikondisikan menjadi 1%, 10% dan 100%. Setiap
perlakuan sebanyak 5 ulangan. Inkubasi dilakukan selama 96 jam pada suhu rang
28-31C pada inkubator dengan mesin penggoyang (Su et al. 2001).
Pengukuran nilai Optical Density (OD) sel dilakukan setiap 12 jam pada
masing-masing isolat dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 620 nm. OD dikonversi dengan menggunakan kurva standar untuk
menghitung jumlah sel jumlah sel. Laju pertumbuhan spesifik maksimum (maks)
didapat dengan cara mencari Regresi dari ln jumlah sel. koefisien X merupakan
nilai maks (Maier 2000). Kurva standar pertumbuhan isolat NFR1 dan NFR4
dapat dilihat pada Lampiran 13.
Analisis nitrat, nitrit dan amonium dilakukan setiap 12 jam, dengan cara
yang sama pada tahap seleksi isolat. Hasilnya digambarkan dalam bentuk grafik
yang memperlihatkan hubungan jumlah sel, jumlah nitrat, nitrit, dan amonium.
Kecepatan reduksi nitrat sel tiap isolat pada masing-masing konsentrasi saturasi
udara berbeda dihitung dan dianalisa.