Pewarnaan Bakteri

Tujuan
Untuk melihat bagian-bagian struktural sel
bakteri
Mempermudah melihat morfologi sel bakteri
Memperjelas ukuran dan bentuk sel bakteri
Membantu mengidentifikasi bakteri

Tipe tipe pewarnaan

1. Pewarnaan Negatif
2. Pewarnaan sederhana
3. Pewarnaan diferensial:
a. Pewarnaan Gram
b. Pewarnaan Tahan Asam (Ziel-Neelsen Method)
c. Pewarnaan Spora (Schaeffer-Fulton Method)
4. Pewarnaan Khusus:
a. Pewarnaan kapsul
b. Pewarnaan flagel
c. Pewarnaan fluoresensi

Pewarnaan negatif
Pewarnaan
yang
dilakukan
untuk
mewarnai
latar
belakang
preparat
sedangkan
bakteri
tidak
terwarnai.
Pewarna yang banyak digunakan higrosin
dan tinta cina.

Pewarnaan Sederhana

Pada pewarnaan ini hanya

digunakan satu maam zat
pewarna.
Pewarnaan ini biasanya hanya
digunakan untuk mengamati
bentuk-bentuk morfologi
seperti kokus, basil, spral dan
bermacam-macam variasinya.
Sel bakteri akan terwarnai
sesuai dengan macam pewarna
yang digunakan. Pewarna
yang banyak digunakan
methylene blue, gentian violet,
fuchsin atau safranain

Pewarnaan diferensial
Pewarnaan differensial menggunakan 2
macam zat pewarna yang memliki sifat
berlawanan.
Tujuan pewarnaan ini umumnya untuk
pemisahan
kelompok
seperti
pewarnaan Gram dan pewarnaan tahan
asam serta visualisasi perbedaan
struktur seperti pewarnaan flagella,
kapsul, spora dan pewarnaan inti.

Property

Gram-positive

Gram-negative

Thickness of wall

thick (20-80 nm)

thin (10 nm)

Number of layers

Peptidoglycan (murein) content

>50%

10-20%

Teichoic acids in wall

present

absent

Lipid and lipoprotein content

0-3%

58%

Protein content

9%

Lipopolysaccharide content

13%

Sensitivity to Penicillin G

yes

Sensitivity to lysozyme

yes

no (some
exceptions
no

Pewarnaan gram
Pewarna utama pewarnaan gram adalah Kristal
Violet yang memberikan warna biru/ungu,
sedangkan pewarna tanding adalah carbol
fuchsin yang memberikan warna merah.

Pewarnaan gram
Bakteri yang mempertahankan pewarna utama
dan tidak hilang dengan pencucian maupun
pewarna tanding (counterstain) Gram Positif
Bakteri yang menyerap pewarna tanding dan
tidak hilang saat pencucian Gram Negatif

Mekanisme penyerapan warna

gram pada bakteri
Dinding sel bakteri golongan gram negatif
umumnya lebih tipis dari dinding sel
bakteri golongan gram positif.
Gram - : peptidoglikan tipis, namun lipid
lebih tebal.
Gram + : peptidoglikan tebal, namun
lemak tipis.

Mekanisme penyerapan warna

gram pada bakteri (2)
Gram
Alkohol melarutkan lemak menaikkan
permeabilitas dinding sel kristal violet
iodin keluar dan bakteri tidak berwarna.
Gram +
dinding selnya sedikit mengandung lemak
dehidrasi karena perlakuan dengan
alkohol ukuran pori-pori dan
permeabilitas dinding sel berkurang.

 Pemberian zat Iodine (mordant) menambah

kekuatan ikatan kristal violet dalam sel dan
membentuk presipitat sehingga kristal violet
tidak larut dalam air.
Pemberian zat dekolorisasi (alkohol) akan
melarutkan lipid pada dinding sel bagian luar.
Gram negatif kompleks kristal violet-iodine
lepas
Gram Positif celah pada dinding sel menutup

Pewarnaan Tahan Asam

(Acid Fast Stain)
Beberapa spesies tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan biasa, contohnya genus
Mycobacterium
Hal ini disebabkan komposisi dinding sel yang
mengandung lipid yang tebal sehingga
menyulitkan pewarna biasa untuk dapat
melakukan penetrasi pewarnaan.
Pewarna yang digunakan:
Karbol fuchsin (pewarna utama), metilen biru (pewarna
tandingan), alkohol asam (3 % HCl + 95 % etanol)
sebagai pemucat.

Proses pewarnaan dilakukan dengan pemanasan

atau tanpa pemanasan (penambahan
turgitol/wetting agent)

Pewarnaan Tahan Asam

Intepretasi hasil:
Bakteri tahan asam: mampu menahan
pewarna utama meskipun telah dilakukan
pemucatan terhadap asam alkohol
Bakteri berwarna merah keunguan

Bakteri tak tahan asam: mampu dipucatkan

oleh alkohol asam, dan menerima pewarna
tandingan.
Bakteri berwarna biru

Pewarnaan tahan asam

(Pewarnaan Khusus)

Pewarnaan Kapsul
Kapsul merupakan bagian dari struktur sel bakteri
yang berupa lapisan luar yang bergelatin
Kapsul mengandung polisakarida, glikoprotein dan
polipeptida.
Tidak semua bakteri memililki kapsul
Umumnya keberadaan kapsul mengindikasikan
virulensi
Pewarna yang digunakan:
Kristal violet 1 % (pewarna utama); tembaga sulfat 20 %
(pemucat dan pewarna tandingan)

Tidak ada perlakuan pemanasan

Pewarnaan Kapsul

Pewarnaan Spora
Endospora: Bentuk dormansi bakteri
Struktur yang resisten:
Panas, radiasi, dingin, asam, desinfektan kimiawi
Perebusan > 1 jam tetap viabel
Membutuhkan energi dan waktu untuk membentuk spora
Pewarnaan spora: menentukan lokasi yang menjadi dasar
klasifikasi sentral, subterminal,terminal
Struktur:
Spore coat
Cortex
Core (Spore protoplast)

Pewarnaan Spora lanjutan

Komponen penyusun inti endospora
Air dalam konsentrasi yang rendah
Small acid-soluble spore proteins (SASPs):
Melindungi DNA dari radiasi UV, pengeringan & pemanasan
Sumber karbon & energi untuk pembentukan sel vegetatif baru
(germinasi)

Pewarnaan Spora lanjutan

Pewarna yang digunakan:
Hijau malakit (pewarna utama), Safranin
(pewarna tandingan), air (pemucat)

Perlu pemanasan ketika pemberian warna

Intepretasi hasil:
Spora akan berwarna hijau (hijau malakit),
sedangkan sel vegetatif akan berwarna merah
(safranin)

Pewarnaan Spora lanjutan

Pewarnaan Flagel
Digunakan untuk mewarnai flagel sehingga dapat
diamati keberadaan, jumlah, dan penataan flagel
pada bakteri.
Penataan flagel akan membantu dalam identifikasi
bakteri.
Untuk mewarnai flagel dibutuhkan teknik
pewarnaan yang khusus.
Diperlukan bahan tertentu yang dapat melapisi
flagel bakteri, sehingga dapat menambah
ketebalan flagel.
Pewarna selanjutnya akan mewarnai bahan
pelindung tersebut.

Pewarnaan flagel

Faktor Penentu Keberhasilan Dalam

Teknik Pewarnaan
1. Penempatan olesan, atau lapisan tipis
spesimen pada kaca objek
2. Fiksasi olesan pada kaca objek,
biasanya
dengan
pemanasan,
menyebabkan mikroorganisme melekat
pada kaca objek
3. Aplikasi pewarna yang digunakan
(pewarnaan sederhana atau differensial)

Faktor-faktor yang mempengaruhi keberhasilan

pewarnaan :
1. Kaca objek bersih dan bebas dari lemak
2. Umur biakan (optimal) : 18-24 jam
3. Kualitas zat warna
4. Tebal tipisnya sediaan

Terima Kasih