Raport tiinific

privind implementarea proiectului UEFISCSU PN-II-RU-TE-2012-3-0136 nr.

Contract 60/30.04.2013, Dynamics of Escherichia coli population transformed
to express archeal heterologous protein S-layer n perioada mai decembrie
2013

Prezentul proiect are ca scop investigarea experimental a dinamicii unei populaii bacteriene
de Escherichia coli transformat s exprime proteina Archaea heterolog termostabil S strat de Pyrococcus abyssi i, ulterior, dezvoltarea unui model matematic dinamic, prin
mbinarea informaiilor la scara celular cu cele de la scara bioreactorului. Se testeaz
capacitatea unor organisme modificate genetic de a ajunge la sincronism, la nivelul ntregii
populaii microbiene, prin mecanisme intrinseci: cretere, diviziune i deces.
Pn n prezent, se tie foarte puin despre sincronicitatea intrinsec ntr-un astfel de sistem,
cazurile i modul n care aceast sincronicitate poate influena producia de protein. De
aceea, n acest proiect ne-am propus: a) s determinm dac bacteriile transformate sunt
supuse sincronismului prin mecanisme intrinseci: cretere, diviziune i deces; b) s corelam
acest fenomen cu o producie mai eficient a proteinelor recombinante; c) s elucidam dac
proteina recombinant este exprimat continuu sau ntr-o anumit faz a ciclul celular,
deoarece acest lucru ar putea schimba protocolul de recoltarea a proteinei, cu implicaii
asupra costurilor de operare.
n vederea realizrii acestor eluri, obiectivul propus pentru anul n derulare (2013) a vizat
studiul prin spectrometrie a dinamicii intrinseci a unei populaii bacteriene de Escherichia
coli BL21(DE3) (netransformat) ce se dezvolt ntr-un bioreactor cu agitare mecanic foarte
bun, la diferite turaii.
Condiiile de cultivare au urmrit s studieze comportarea noii tulpini de E. coli n acelai
mediu ca acela utilizat pentru sua K12-MG1655 care a fost folosit in experimentele
raportate in Lavric i Graham (2010), Chi Fru et al. (2011) i Ofieru et al. (2012). Tulpina
bacterian utilizat n experiment este E. coli BL21(DE3) (Studier & Mofat, 1986), avnd
genotipul fhuA2 [lon] ompT gal ( DE3) [dcm] hsdS DE3 = sBamHIo EcoRI-B

int::(lacI::PlacUV5::T7 gene1) i21 nin5. Selectarea tulpinii a avut n vedere utilizarea

acesteia pentru expresia genei care codific proteina stratului-S din archaeonul hipertermofil
Pyrococcus abyssi, BL21(DE3) reprezentnd tulpina clasic utilizat pentru expresia
bacterian a genelor clonate n vectori de expresie T7 n vederea obinerii proteinelor
recombinante. Timpul de dublare al acestei tulpini de E. coli la 37oC este de 30 min.
Schema instalaiei experimentale folosite este prezentat n Figura 1 i const din: bioreactor
Sartorius BIOSTAT Aplus cu un volum de lucru de 1,5 L (volum util 2,5 L),
spectrofotometru Ocean Optics Inc. Jaz (UV-VIS) cu sonda de imersie, compresor, unitate
complementar pentru bioreactor prevzut cu pompe peristaltice pentru acid/baz (necesare
pentru ajustarea pH-ului) i debitmetre pentru aer/O2/CO 2, laptop cu softuri dedicate pentru
bioreactor i spectrofotometru.

Figura 1. Schema instalaiei pentru cultivarea Escherichia coli BL21(DE3)

Legenda:1. Compresor; 2. Robinet reglare debit aer cu purja; 3. PC cu programe dedicate

operrii bioreactorului si spectrofotometrului; 4. Unitate central de control a bioreactorului;
5. Lamp spectrofotometru; 6. Spectrofotometru portabil; 7. Sonda spectrofotometru; 8. pH metru; 9. Vas de sticla cu manta pentru nclzire; 10. Agitator mecanic; 11. Distribuitor de
gaz frit metalic; 12. Senzor de temperatura; 13. Oxigenometru; 14. Filtru de aer;
15. Motor pentru acionarea arborelui agitatorului.

Protocolul experimental
Regimul de operare al bioreactorului a fost discontinuu. Studiile anterioare cu tulpinaK12MG1655 au fost efectuate n regim continuu, ns n aceast etap a fost ales regimul
discontinuu pentru a avea o referin n etapa urmtoare n care tulpina BL21(DE3) va fi
transformat pentru exprimarea proteinei Archaea heterologe termostabile S - strat de
Pyrococcus abyssi.
Bioreactorul sterilizat se pune n funciune, pornindu-se mai nti agitarea i aerarea, n
scopul crerii de suprapresiune n bioreactor, pentru ca adugarea componentelor mediului s
se realizeze n condiii suplimentare de siguran i sterilitate. Sonda spectrofotometric
imersat, care msoar continuu absorbana mediului pe toat durata procesului, este
conectat la sursa de lumin i la spectrofotometrul portabil i se iniializeaz spectrele de
referin pentru mediul clar. Ulterior, sonda este setat pentru a citi absorbana mediului la o
lungime de und de 600 nm, cu o frecvena de 10 sec. Dup amestecarea corespunztoare a
componenilor i pornirea sondei spectrofotometrului se inoculeaz mediul, ajustndu-se
turaia i saturaia n oxigen, n funcie de condiiile de spumare (Figura 2). Durata unei arje
a fost ntre 48 i 96h, n cazul unor timpi mai lungi fcndu-se i alimentri intermediare cu
substrat i nutrieni.

Figura 2. Instalaia de laborator n funciune

Mediul de cultur
Mediul de cultur ales este selectiv pentru sursa de carbon i conine o fracie sterilizabil
prin autoclavare (mediu 1) i o fracie sterilizabil prin filtrare (mediu 2).
Compoziie mediu 1 (g/L): 6 g Na2HPO4; 3 g KH 2PO4 ; 0,5 g NaCl; 1 g NH4 Cl.
Compoziie mediu 2: 5 mL glucoz 20%; 2 mL MgSO4 1M; soluie stoc de sruri minerale n
urme (pH = 7, conservare la 4C). ntr-o arj se adaug 10 mL din soluie concentrat 100X
ce conine: 5 g EDTA; 0,8 g FeCl3; 0,05 g ZnCl2; 0,0001 g CuCl2; 0,0001 g CoCl2; 0,0001 g
H3BO3; 0,016 g MnCl2 .
Inocularea s-a fcut cu 1% inocul avnd densitatea optic (DO) 1,987 la lungimea de und ()
de 600 nm.
Etapele principale de preparare sunt: srurile din mediul 1 se dizolv n apa distilat i se trec
n bioreactor, sterilizndu-se n autoclav la temperatura de 121C timp de cel puin 15 min.
Soluia de glucoz se prepar proaspt, nainte de adugarea n mediul de sruri sterilizat.
Parametrii de operare
n vederea asigurrii unor condiii propice dezvoltrii populaiei bacteriene, au fost utilizate
urmtoarele valori/intervale pentru principalii parametrii de operare:
-

Temperatura de lucru: 27C, respectiv 37C

Turaia agitatorului: 100, respectiv 170 rpm

Intervalul de pH: 6.5-7.5

Presiunea parial a oxigenului dizolvat n mediu pO2: 90%- 150%.

Rezultate i discuii
Pentru a observa modul cum parametrii de operare considerai semnificativi influeneaz
dezvoltarea bacteriei E. Coli BL21(DE3), planul experimental pentru etapa de raportare a
proiectului a implicat modificarea temperaturii, turaiei agitatorului i saturaiei n oxigen.
nregistrarea parametrilor culturii s-a efectuat automat, n Figura 3 prezentndu-se interfaa
de afiare a rezultatelor msurtorilor din softul dedicat al bioreactorului. Datele nregistrate
sunt apoi prelucrate i adnotate off line.
4

Figura 3. Interfaa de afiare a parametrilor msurai n bioreactorul Sartorius

Pentru a asigura interpretarea uniform i corect a nregistrrilor efectuate n experimente

avnd condiii diferite de operare a fost realizat la nceputul experimentelor o curb de
etalonarea a spectrofotometrului Ocean Optics, prezentat n Figura 4.

Figura 4. Curba de etalonare a spectrofotometrului realizat prin utilizarea camerei Thoma

Experimentul de referin a fost efectuat meninnd constante temperatura i agitarea n

bioreactor, iar rezultatele sunt prezentate n Figurile 5 i 6.

Densitatea optic pe durata experimentului de referin

1.6
1.4

OD 600 nm

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
-0.2

10

20

30

40

50

60

70

Timpul, h

Figura 5. Dinamica densitii optice n timpul experimentului de referin

Consumul de oxigen pe durata experimentului de referin

140

120

pO2, %

100

80
60
40
20
0

10

20

30

40

50

60

70

Time, h

Figura 6. Presiunea parial a oxigenului n bioreactor pentru experimentul de referin

n faza de nceput a culturii, pn la stabilirea unei comuniti microbiene n faza
exponenial de cretere, consumul de oxigen variaz n acord cu dinamica populaiei
bacteriene; scade, pe msur ce populaia bacterian crete, n primele zece ore ale

experimentului, dup care are fluctuaii periodice relativ ample i dese, timp de aproximativ
zece ore (Figura 6). n aceast perioad, populaia bacterian i crete masa semnificativ
(Figura 5), neliniar, prezentnd mici fluctuaii. Dup atingerea maximului, populaia ncepe
s scad lent, pn ctre ora 40. Aceast scdere este atipic, fiind format din perioade
distincte cu maxime locale, a cror durat variaz ntre 4 i 10 ore (Figura 5). Dup
aproximativ 45 de ore de cultivare, constatndu-se scderea pronunat a densitii optice,
precum i apariia unui fenomen de spumare slab, s-a concluzionat c populaia bacterian
consumase n mare msur substratul introdus iniial. Pentru a continua experimentul, mediul
de cultur a fost alimentat cu o cantitate de substrat echivalent cu cea iniial. Creterea
densitii optice i scderea presiunii pariale a oxigenului indic o reluare a activitilor de
cretere i diviziune celular, ntr-un ritm comparabil cu cel nregistrat dup a zecea or de
experiment. Modul n care variaia DO se coreleaz cu concentraia de oxigen dizolvat, indic
posibilitatea de a considera c valoarea DO este generat mai ales de fracia de celule vii din
cultur. Prin urmare, DO poate fi folosit pentru caracterizarea culturii bacteriene i studierea
dinamicii intrinseci a populaiei bacteriene. Aceast ipotez va fi mai bine documentat n
etapele urmtoare ale proiectului, prin folosirea msurtorilor cu flow-cytometru.
Urmtoarele experimente au urmrit viteza de cretere celular, prin nregistrarea DO a
mediului de cultura inoculat cu tulpina BL21(DE3), n diferite condiii de operare.
Sunt prezentate n continuare un set de rezultate obinute ntr-un experimentul ce a fost pornit
n condiiile de cultivare pentru mediul continuu (temperatura de 27C i turaia de 130 rpm).
n timpul desfurrii experimentului, din cauza condiiilor culturale (spumare intens a
mediului dup atingerea fazei de cretere cu viteza constant) s-a impus reducerea turaiei
agitatorului mecanic (la 100 rpm). De asemenea, a fost crescut temperatura la 32 o pentru a
studia dac o activitate microbian mai intens poate fi nregistrat cu aparatura pe care o
avem n dotare.

DO pentru ntreaga arj

1.6
1.4

OD 600, nm

1.2
1
0.8
0.6

0.4
0.2
0
-0.2

10

20

30

40

50

60

70

Timpul, h

Figura 7. Densitatea optic pentru ntreaga arj n care s-au variat temperatura i agitarea

Consumul de O2 pe ntrega arj

140
120

pO2, %

100
80
60
40
20
0
0

10

20

30

40

50

60

70

80

timp, h

Figura 8. Presiunea parial a oxigenului n bioreactor pentru ntreaga arj n care s-au variat
temperatura i agitarea

Dup 53 h de operare, cultura s-a realimentat cu mediul 2 (sterilizabil prin filtrare),

observndu-se reducerea spumrii n mediul de cultur timp de 10 h. Se poate observa c
8

dinamica relurii activitilor metabolice la nivel maxim este aceeai ca n experimentul

precedent (Figura 5).
nregistrarea absorbantei i a consumului de oxigen marcheaz perioadele de dezvoltare
maxim celular cu metabolism intens (consum ridicat de oxigen) respectiv, perioadele de
metabolism secundar.
i n cazul acestui experiment exist o coresponden ntre variaia densitii optice i cea a
presiunii pariale a oxigenului. Reprezentare pe o scal de timp mai mic (figura 9) a indicat
o tendin n variaia DO asemntoare cu aceea raportat n Ofieru et al. (2012).
Tendina de sincronism, caracterizat printr-o activitate n care ntreaga mas de celule este n
aceeai faz a ciclului celular, este evident n toate experimentele prezentate, chiar i n
perioadele de cretere exponenial. Sincronismul se manifest mai clar n perioadele de
platou, dar nu n acelai mod i la acelai nivel n care a fost evideniat n cazul cultivrii
continue. Concentraia iniial mic de substrat, precum i scderea continu a acestuia,
datorit consumului de ctre bacterii, determin apariia unei faze de platou tranzitorii, n care
bacteriile au la dispoziie din ce n ce mai puin substrat, ceea ce le oblig la o dinamic
accentuat a cilor metabolice interne.

DO pentru 270C i 100 rpm

0.8

DO 600, nm

0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
15

20

25

30

35

40

45

50

Timp, h

Figura 9. Densitatea optic pentru intervalul de timp n care temperatura a fost meninut la
27 oC i agitarea la 100 rpm.

Chiar i n aceste condiii, se constat o periodicitate a activitilor populaiei de bacterii, n

ansamblul ei, evideniat prin creteri i scderi locale ale DO (Figura 7, dup prima perioad
de cretere exponenial, ntre orele 20 i 45, respectiv Figura 9). Chiar i n perioada de
declin accelerat al masei celulare, datorit nfometrii (consumul cvasi-total al substratului),
sincronismul nc se manifest (Figura 7, ntre orele 45 i 53). n Figura 10, sincronismul se
evideniaz prin variaiile periodice ale DO att nainte, ct i dup adugarea de mediu
proaspt.

Figura 10.Densitatea optic pentru intervalul de timp n care temperatura a fost meninut la
32oC i agitarea la 100 rpm.
Remprosptarea mediului de cultur prin suplimentarea cu mediul 2 (sterilizat prin filtrare)
corespunde cu o scdere drastic a presiunii pariale a oxigenului (a se vedea Figurile 10 i
11).

10

Consumul de O2 la 320C i 100 rpm

140
120

pO2, %

100
80
60

40
20
0
45

50

55

60

65

70

75

Timp, h

Figura 11.Presiunea parial a oxigenului n bioreactor pentru intervalul de timp n care

temperatura a fost meninut la 32 oC i agitarea la 100 rpm.

Complexitatea procesului discontinuu, datorat scderii concentraiei de substrat de la o

valoare maxim, corespunztoare nceputului experimentului, la valori apropiate de zero,
modific modul n care se manifest sincronismul intrinsec n cultura celular. Cu toate
acestea, analiznd comparat dinamica DO i cea a concentraiei de oxigen dizolvat, pot fi
identificate perioade de timp n care sincronismul se manifest. O analiz mult mai
aprofundat poate fi fcut cu ajutorul flow-cytometr-ului care a fost achiziionat n aceast
etap a contractului, i care va permite nu doar cuantificarea celulelor vii i a celor moarte, ci
i a stadiului celular n care se afl celulele vii existena sincronismului intrinsec va fi
probat dac un numr semnificativ de celule vii se afl n acelai stadiu de dezvoltare
celular.
O prim diseminare a activitilor din cadrul proiectului s-a fcut prin trimiterea unui articol
(Gogulancea et al.), care a fost acceptat pentru publicare, n U.P.B. Sci. Bull., Series B (ISSN
1223-7027), cu menionarea proiectului n acknowledgments.

11

Referine
1. Chi Fru, E., Ofieru, I. D., Lavric, V., Graham, D. W.,Non-linear population dynamics in
chemostats associated with livedead cell cycling in Escherichia coli strain K12-MG1655.
Appl Microbiol Biotechnol, 2011. 89(3): p. 791-798
2. Gogulancea , V., Isopencu, G., Ferde, M., Ofieru, I.D., Lavric, V., Dynamics Of Escherichia
Coli Population Expressing Heterologous Proteins, U.P.B. Sci. Bull., Series B, acceptat spre
publicare
3. Lavric, V., Graham, D.W., Birth, growth and death as structuring operators in bacterial
population dynamics. J Theor Biol, 264(1) 2010, p. 45-54
4. Ofieru, I. D., Chi Fru, E., Ferde, M., Graham, D. W.,Lavric, V., Conditional confined
oscillatory dynamics of Escherichia coli strain K12-MG1655 in chemostat systems. Applied
Microbiology and Biotechnology, 94(1) 2012, p. 185-192
5. Studier, F.W., Moffatt, B.A., Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective
high-level expression of cloned genes. J. Mol. Biol. 189 1986, p. 113-130.

Director proiect,
Dr. Irina Dana Ofieru

12