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Tecnol. Ciencia Ed.

(IMIQ) 2016

Evaluacin del Efecto de pH, Temperatura y


Agitacin en el Crecimiento de L. casei
Gonzlez- Burgos, A., Canul-Chan, M. , Flores-Bautista, E. *, Baqueiro-Berry, R. ,
Domnguez-Razo, A. , Pech-Consuett, R. , Valenzuela-Zamudio, J. F. , Puc-Sosa, A.A.

1 Facultad de Ingeniera Qumica, UADY, Mxico Perifrico Norte kilmetro 33.5, Perif. de Mrida Lic. Manuel
Berzunza 13615, Chuburn de Hidalgo Inn, 97203 Mrida, Yuc. * correo:emanuelflrsb@hotmail.com. Tel: 9991093646

RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo el
anlisis de la influencia de distintos factores
ambientales (pH, temperatura y oxigenacin)
en el crecimiento de Lactobacillus casei. El
microorganismo se incub bajo diferentes
condiciones de pH (5 y 7), de temperatura
(25, 35 y 45 C) y de agitacin (0 y 200 rpm)
durante 4 das. Las mediciones se llevaron a
cabo al inicio y al final del experimento. El
crecimiento se determin por medio de dos
mtodos indirectos: determinacin de la
biomasa por medio de turbidimetra y
determinacin de protenas por el mtodo de
Bradford; el pH se determin mediante tiras
de papel y el potencimetro. A partir de los
parmetros de crecimiento obtenidos
mediante ambos mtodos se puede concluir
que el crecimiento ptimo se dio a 35 C con
una agitacin de 200 rpm y pH de 7.
Mediante un anlisis de varianza con un nivel
de confianza mayor al 99% se demostr que
los factores que tienen mayor efecto en el
crecimiento son la temperatura y el pH y la
interaccin de ambos, mientras que la
oxigenacin por agitacin a 200 rpm no tiene
un efecto significativo.

Palabras clave: factores ambientales,


Lactobacillus casei, pH, temperatura,
agitacin, crecimiento microbiano.
ABSTRACT
The purpose of this work was to analyze the
influence different environmental factors
(PH, temperature and oxygenation) have on
the growth of Lactobacillus casei. The
microorganism was incubated for four days
under different conditions; at a pH of 5 and 7;
at temperatures of 25, 35 and 45o C and at an
oxygenation rate of 200 rpm and at rest.
Measurements were carried out at the
beginning and the end of the experiment.
Growth was determined by two indirect
methods: determination of biomass by
turbidimetric analysis and by the Bradford
protein assay. PH was determined by paper
strips and by potentiometer. From the
parameters of growth obtained using both
methods it was concluded that optimum
growth was reached at 35C, an oxygenation
rate of 200 rpm and a pH of 7.
On carrying out statistical analysis with over
99% confidence level, it was observed that
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the factors which have greatest influence on
growth are temperature, pH and the
interaction between them both, while
oxygenation did not show a significant effect.
Key
words:
environmental
factors,
Lactobacillus casei, pH, temperature,
oxygenation, microbial growth.
INTRODUCCIN
Los
microorganismos
desarrollan
su
morfologa
y
actividad
metablica
adaptndose a las condiciones ambientales
del ecosistema donde viven, estas actividades
se ven muy afectadas por las condiciones
qumicas y fsicas del medio. El conocimiento
y el control de estos efectos permiten disear
escenarios de crecimiento que potencien las
actividades microbianas y la produccin de
un metabolito deseado. Hay diversos factores
que afectan al crecimiento ptimo de un
microorganismo dentro de los cuales destaca
la temperatura. Cada microorganismo tiene
temperaturas cardinales de crecimiento, es
decir, una temperatura mnima, una
temperatura ptima-a la que se produce el
crecimiento ms rpido-y una temperatura
mxima, por encima de la cul es imposible
que se d el crecimiento. Estas tres
temperaturas son caractersticas de cada
organismo.
El crecimiento microbiano tambin se ve
afectado por el pH del medio donde se
encuentre, cada organismo posee un rango de
pH en el cual le es posible desarrollarse y
normalmente posee un pH ptimo definido.
El rango de la mayora de ambientes
microbianos va de 5 a 9. Los organismos que
crecen a un pH menor se consideran
acidfilos, por el contrario, a un pH mayor
son considerados alcalfilos.

El principal efecto que tiene el pH en el


desarrollo microbiano es en la estabilidad de
la membrana citoplasmtica. Para reducir un
posible contra efecto de cambios de pH es
posible la adicin de tampones a los medios
de cultivo con el fin de mantener el pH
relativamente constante.
Entre otros factores relevantes se encuentran:
concentracin de nutrientes, oxgeno, presin,
radiacin, y actividad hdrica. Esta ltima
involucra condiciones de humedad y
concentracin de solutos como sales o
azucares y es expresada como el cociente de
la presin de vapor del aire en equilibrio con
una sustancia o solucin y la presin de vapor
del agua pura a la misma temperatura.
Los factores antes mencionados afectan la
actividad enzimtica y por tanto en el
metabolismo, de diversas formas como
factores de transcripcin, cambios fsicos en
los organelos, comunicacin celular, entre
otros. La disminucin en la actividad
metablica de los microorganismos puede
causar la apoptosis fcilmente.
Todos
los
microorganismos
tienen
condiciones ptimas para su crecimiento y
para la produccin de metabolitos. Es
importante conocer dichas condiciones para
as, optimizar los procesos de produccin
biotecnolgica de algn metabolito de inters
industrial.
En este trabajo se evala el crecimiento de la
bacteria cido lctica (BAL) Lactobacillus
casei a diferentes condiciones de temperatura,
pH y agitacin con el fin de determinar si
tienen un efecto significativo en este.
METODOLOGA
El estudio de los efectos de los factores
ambientales se realiz mediante el anlisis de
la
cintica
de
crecimiento
del
microorganismo
Lactobacillus
casei
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cultivado en un medio de cultivo lquido
MRS (Man, Rogosa y Sharpe) durante 20
horas a una temperatura de 37C sin agitacin
sometidos a dos pH diferentes (5 y 7).
Posteriormente se llev a cabo un proceso de
re siembra en la que se sometieron a
diferentes condiciones de incubacin
abarcando 3 temperaturas (25, 35 y 45C), los
dos pH mencionados y dos diferentes
condiciones de agitacin (0 y 200 rpm).
Las mediciones se realizaron por duplicado y
se utiliz un control en cada paso de
medicin
Se inocularon 20l del cultivo a 4 tubos de
ensayo con medio de cultivo MRS. A otros 2
tubos de ensayo se le aadi medio de cultivo
libre de microorganismos para fungir como
control. Se verific el pH del cultivo
utilizando tiras de pH. Las muestras para la
medicin del crecimiento del microorganismo
se realizaron a las 0 y 96 horas Para la
determinacin del crecimiento celular se
emplearon
dos
mtodos
indirectos:
cuantificacin de biomasa por turbidimetra y
determinacin de protena por el mtodo de
Bradford.
Para el anlisis de crecimiento por
turbidimetra se utiliz un espectrofotmetro
y se ajust a 540 nm, se utiliz como blanco
1ml de medio de cultivo libre de
microorganismos. Se ley la absorbancia de
1ml de cada muestra colocados en celdas
plsticas y se registraron los resultados.
El anlisis de concentracin de protena se
realiz utilizando el mtodo propuesto por
Bradford, para esto se centrifugaron 0.5ml de
cada muestra a 13000rpm por 10 minutos a

una temperatura ambiente (Thermo Scientific


SL16R centrifuge) y se recuper la pastilla
celular obtenida en el fondo del tubo para
microcentrifuga. Se adicion 1ml de NaOH
0.5M y se agit con un agitador vrtex para
su resuspencin, los tubos se llevaron a
calentamiento en bao trmico a 75 C por 5
minutos. Posteriormente se aadi 1ml de
reactivo de Bradford y se dej reaccionar por
10 minutos evitando la exposicin a la luz,
consecutivamente cada muestra se midi en
el espectrofotmetro (Thermo Scientific
Genesys 20) a una longitud de onda de 595
nm utilizando como blanco una solucin con
NaOH y reactivo de Bradford.
Se verific si existi un cambio en el pH de la
muestra de 96 horas utilizando un
potencimetro
Preparacin de los reactivos:
Medio MRS g/L: Glucosa 20.0g; Proteosapeptona 10.0g; extracto de carne 8.0g,
extracto de levadura 4.0g; Fosfato dipotsico
2.0g, acetato de sodio 5.0g, citrato de amonio
2.0g; sulfato de magnesio 0.2g; sulfato de
manganeso 0.05g. pH final 6.5 se ajust a pH
a 5 y 7.
Reactivo de Bradford. Se disolvi 100 mg del
colorante Azul de Coomassie G-250 en 50
mL de etanol al 95%. Se agreg 100 mL de
cido fosfrico al 85% (w/v) y se agit hasta
homogenizar. Se diluy la solucin a 1 lt. Las
concentraciones finales en el reactivo fueron:
Azul Brillante de Coomasie G-250 0.01
(w/v), etanol 4.7% (w/v), cido fosfrico
8.5% (w/v).

RESULTADOS Y DISCUSIONES
La BAL, grampositiva, heterofermentativa,
L. casei es utilizada ampliamente en la
industria para la produccin biotecnolgica

de cido lctico, la fabricacin de una amplia


gama productos lcteos y como probitico en
alimentos funcionales. Se han reportado
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amplios rangos de temperatura ptima para el
crecimiento de L. casei, un pH ptimo
ligeramente cido (5.5- 6.5), mientras que
para la agitacin, los reportes apoyan tanto el
cultivo en presencia, como en ausencia de
agitacin.
En el experimento se llevaron a cabo tres
condiciones de temperatura (25, 35 y 45C),
dos de pH inicial (5 y 7) dos de agitacin (0 y
200 rpm). Se tomaron muestras para obtener
un panorama del crecimiento microbiano por
mtodos indirectos (turbidimetra y protena
por el mtodo de Bradford) y para medir el
pH. Estas muestras fueron analizadas al inicio
del experimento y cuatro das despus de
incubacin. Las lecturas variaron (para
turbidimetra y el mtodo de Bradford) de

espectrofotmetro a espectrofotmetro y se
hicieron lecturas en espectrofotmetros
diferentes en funcin de la disponibilidad. Sin
embargo, las pruebas de turbidimetra
presentaron datos ms homogneos (Tabla 1).
La magnitud de crecimiento fue dada por el
cambio o diferencia en las medidas de la
turbidimetra ( Abs). Se llev a cabo un
anlisis estadstico para evaluar el efecto de
cada factor. Adems, se hicieron anlisis
para el crecimiento en funcin cada factor de
manera independiente, permitiendo as,
analizar de manera global y especfica cada
factor. Algunos datos difieren mucho de los
dems (heterogneos), por tanto tienen baja
confiabilidad.

Tabla 1. Turbidimetra, Datos Finales Grupales . *ND: No diluida. Los datos subrayados son heterogneos y fueron
descartados para algunos anlisis. UA: Unidades de Absorbancia

pH

Agitacin

25

25

35

35

45

45

0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm

Absorbancia
Inicial ND
(UA)
0.044
0.0435
0.0455
0.06
0
0.1508
0.009
0.0105
0.0095
0.0105
0.0535
0.049

Absorbancia
Final ND
(UA)
1.925
1.583
1.9635
1.8825
0.289
0.317
1.83
2.0145
0.2585
0.2225
1.4345
1.465

Abs
1.881
1.5395
1.918
1.8225
0.289
0.1662
1.821
2.004
0.249
0.212
1.381
1.416

Anlisis Estadstico
Asumiendo
una
distribucin
aproximadamente normal, se realiz un
ANOVA trifactorial (Tabla 2) para evaluar el
efecto del pH (dos niveles), la temperatura

(tres niveles) y agitacin (dos niveles) y de la


interaccin de los factores en el crecimiento
microbiano de manera global. Se utiliz un
nivel de confianza del 95% para la prueba.
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Tabla 2. ANOVA trifactorial del experimento. Se analiz el Efecto de T, pH y Agitacin en el Crecimiento Microbiano
medido por Turbidimetra.

Los resultados demuestran un efecto


significativo de la Temperatura y el pH, as
como la interaccin de ambos factores (todos
con valor P 0.01) en el crecimiento
microbiano. Esto significa que el efecto

esperado de los factores pH y temperatura fue


confirmado con un nivel de confianza mayor
al 99%. Sin embargo, la agitacin a 200 rpm,
no
tuvo
un
efecto
significativo.

Efectos de la Temperatura en el Crecimiento Microbiano


Se evalu la magnitud de crecimiento en
funcin de la temperatura de incubacin. El
experimento se realiz por duplicado y se
tomaron los promedios de cada condicin y

se grafic la media de los promedio, tomando


en cuenta las lecturas que tenan un carcter
homogneo. Las medias se presentan en la
Tabla 3 y la grfica en la Figura 1.

Tabla 3. Promedio de los datos de Turbidimetra a diferentes temperaturas. Los datos subrayados en amarillo son las
medias y los datos subrayados en azul fueron descartados.

Turbidimetra (UA)
25 C
35 C
1.881
0.289
1.53995
0.1662
1.918
1.821
1.8225
2.004
1.77965
1.9125

45 C
0.249
0.212
1.381
1.416
1.3985

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2
1.5

25 C

Absorbancia (UA) 1

35 C

0.5

45 C

Turbidimetra a diferentes Temperaturas

Figura 1. Magniud de Crecimiento de Biomasa en funcin de la Temperatura

La temperatura ptima para el crecimiento de


bacterias cido lcticas, vara entre especies.
En fermentaciones usando L. delbrueckii y
L.bulgaricus se han reportado temperaturas
ptimas de 45 C o ms, desplazndose hacia
los rangos termoflicos. L. helveticus y
L.acidophilus pueden crecer en un rango de
temperatura de 37-45 C. Krischke y col.

(1991) utilizaron 37 C para la produccin de


cido lctico con L. casei. Sin embargo, se ha
reportado una temperatura ptima de 28 C
para L. casei (Nabi y col., 2004). En nuestros
resultados, se pudo observar que los
crecimientos ms altos se dieron a una
temperatura de 35 C que es parecida a la
reportada
por
Krischke
y
col.

Efecto de la Agitacin en el Crecimiento Microbiano


Se evalu la magnitud de crecimiento (
Abs) en funcin de la agitacin. Se sacaron
promedios de las muestras finales por
duplicado y se grafic la media de los

promedios, tomando en cuenta las lecturas


que tenan un carcter homogneo. Los datos
se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4. Promedio de los datos de Turbidimetra a diferentes grados de agitacin. Los datos subrayados en amarillo son
las medias de cada temperatura y los datos subrayados en azul fueron descartados.

Turbidimetra (UA)
0 rpm

200 rpm

1.881
1.918
1.821
1.381
0.289
0.249
1.75025

1.5395
1.8225
2.004
1.416
0.1662
0.212
1.6955

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1.8
0rpm

1.6

200 rpm

Absorbancia
1.4
(UA)
1.2
1

Turbidimetra a diferentes grados de Agitacin

Figura 2. Magnitud del crecimiento de biomasa en funcin de la Agitacin.

Al graficar los datos (Figura 2), se puede


visualizar los resultados del ANOVA: no hay
una diferencia significativa entre el
crecimiento con o sin agitacin, sin embargo,
en promedio se observ un crecimiento
ligeramente ms pronunciado en la
incubacin sin agitacin.
Existen estudios que reportan la produccin
de cido lctico con diferentes especies de
bacterias cido lcticas sin agitacin (Gandhi
y col., 2000). Incluso hay estudios que
demuestran que no hay un aumento
significativo en la conversin del sustrato a
cido Lctico, con la agitacin, comparado
con el crecimiento sin agitacin, lo cual se

atribuye a la naturaleza microaerfila de L.


casei (Panesar et al, 2010). Sin embargo, los
resultados experimentales difieren con los
datos reportados por Roy y col. que
demuestran que hay un mayor crecimiento
con agitacin.
Esto es importante ya que a nivel industrial,
la agitacin es un gasto energtico y un factor
de diseo de biorreactores importante. El
hecho que la agitacin no tenga un impacto
positivo sobre el crecimiento microbiano,
significa que no sera pertinente invertir en
energa mecnica dentro del biorreactor,
haciendo un proceso biotecnolgico ms
econmico y por tanto ms sostenible.

Efectos asociados con el pH


Se evalu tambin, la magnitud de
crecimiento ( Abs) en funcin del pH
inicial. Se sacaron promedios de las muestras
finales por duplicado y se grafic la media de
los promedios, tomando en cuenta las lecturas
que tenan un carcter homogneo. Los datos

se presentan en la Tabla 4. Al descartar los


datos heterogneos, observamos que en
promedio, el pH inicial no tiene un efecto
significativo en el crecimiento (Figura 3), lo
cual difiere con los datos del ANOVA,
debido a que se descartaron algunos datos.

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Tabla 5. Promedio de los datos de Turbidimetra a diferentes pH. Los datos subrayados en amarillo son las medias de
cada temperatura y los datos subrayados en azul fueron descartados.

Turbidimetra (UA)
pH = 5

pH=7
1.881
1.5395
0.289
0.1662
0.249
0.212
1.71025

1.918
1.8225
1.821
2.004
1.381
1.416
1.72708333

1.75
1.7
Absorbancia
(UA)

pH 5

1.65

pH 7

1.6
1.55
1.5
Turbidimetra en funcin del pH inicial

Figura 3 . Magnitud del Crecimiento de biomasa en funcin del pH inicia

Se ha reportado que el pH afecta ms de dos


aspectos celulares de los microorganismos:
actividad enzimtica, expresin de protenas
de membrana asociadas con el transporte de
nutrientes hacia dentro de la clula, cambios
en los organelos, etc.
L. casei utiliza un sistema de expresin de
protenas de membrana para el crecimiento en
pHs bajos, con dos grupos de protenas
dominantes a pH 6.5 y a pH 4( Nezhad y col.,
2010). La expresin diferencial de protenas

de membrana es un mecanismo que le


permite protegerse de las condiciones
ambientales.
L. casei es una bacteria heterofermentativa y
genera cido lctico y etanol como producto
final de su Ruta Metablica. Se han reportado
pHs ptimos de 6.5 para la produccin de
cido lctico (conversin de Lactosa del 95%
p/v) con L. casei utilizando suero de leche
como sustrato (Panesar y col., 2010). Otros
datos reportados como pH ptimo son de 68

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6.5 (Krischke y col., 1991), y de 5.5 utilzando
L. helveticus (Ghaly y col., 2004), que
coincide con el pH ptimo de la Lactato
Deshidrogenasa (Holland & Pritchard, 1974).
Por tanto para una fermentacin industrial se
debe de identificar el pH ptimo especfico de
crecimiento y el de produccin de cido
lctico, para ajustarlo segn se requiera.
Adems se ha reportado que algunas especies
del Gnero Lactobacillus producen Perxido

de Hidrgeno (especie reactiva de oxgeno,


agente oxidante y cido dbil) y cidos
orgnicos para defenderse de otras bacterias
por pH pero manteniendo un tampn o buffer
para sobrevivir (Dasari y col., 2014). Las
bacteriocinas
son
otros
metabolitos
producidos por BALs que sirven como
defensa hacia otras especies o gneros de
bacterias y/o hongos.

Determinacin de Protena por el Mtodo de Bradford


A diferencia de lo realizado para la prueba de
turbidimetra, se utilizaron nicamente los
datos finales de protena para est anlisis. Se
tom esta decisin debido a que la mayora
de los datos iniciales dieron una absorbancia
nula y por tanto la magnitud de crecimiento
es la medida de turbidimetra final.

Esto puede ser atribuido a que la


concentracin de protena inicial en el medio
fue tan baja que no entr en el rango de
lectura del espectrofotmetro. Se tomaron los
promedios y se grafic en funcin de la
temperatura y la velocidad de agitacin
(Tabla 6).

Tabla 6. Magnitud de Crecimiento a nivel de Protena en funcin de la Temperatura

Bradford
0 rpm
200 rpm

25 C
0.00775
0.077

35 C
0.064
0.07875

45 C
0.0545
0.03425

Determinacin de Protena
0.08
0.06
Absorbancia (UA) 0.04

0 rpm
200 rpm

0.02

0
25 C

35 C

45 C

Temperatura
Figura 4. Magnitud del Crecimiento (Protena) en funcin de la Temperatura

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Se puede observar que los datos coinciden
con los datos de turbidimetra, en cuanto a la
temperatura, sin embargo, se observ un
efecto significativo por la agitacin. Los
datos de protena no siguen un patrn
uniforme en cuanto a la agitacin, pues a 25y
a 35 C la agitacin tiene un efecto positivo y
a 45 C tiene un efecto negativo.
CONCLUSIONES
La evaluacin del efecto de los factores
ambientales en el crecimiento de L. casei
indican que el crecimiento ptimo de la

bacteria acidolctica L. casei se da a 35C, a


un pH prximo a la neutralidad y que la
agitacin no tiene un efecto significativo. En
este experimento, la temperatura tuvo el
efecto ms robusto, lo cual puede estar
asociado con el metabolismo y la biosntesis.
Sera pertinente disear un experimento
estadstico que englobe ms niveles en cada
factor, as como ms factores para obtener
datos cuantitativos ms exactos sobre las
condiciones ptimas de crecimiento y adems
incluir la produccin de cido lctico, con el
fin de obtener un panorama global del
proceso y aplicarlo a nivel industrial.

BIBLIOGRAFA
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