Professional Documents
Culture Documents
(IMIQ) 2016
1 Facultad de Ingeniera Qumica, UADY, Mxico Perifrico Norte kilmetro 33.5, Perif. de Mrida Lic. Manuel
Berzunza 13615, Chuburn de Hidalgo Inn, 97203 Mrida, Yuc. * correo:emanuelflrsb@hotmail.com. Tel: 9991093646
RESUMEN
El presente trabajo tuvo como objetivo el
anlisis de la influencia de distintos factores
ambientales (pH, temperatura y oxigenacin)
en el crecimiento de Lactobacillus casei. El
microorganismo se incub bajo diferentes
condiciones de pH (5 y 7), de temperatura
(25, 35 y 45 C) y de agitacin (0 y 200 rpm)
durante 4 das. Las mediciones se llevaron a
cabo al inicio y al final del experimento. El
crecimiento se determin por medio de dos
mtodos indirectos: determinacin de la
biomasa por medio de turbidimetra y
determinacin de protenas por el mtodo de
Bradford; el pH se determin mediante tiras
de papel y el potencimetro. A partir de los
parmetros de crecimiento obtenidos
mediante ambos mtodos se puede concluir
que el crecimiento ptimo se dio a 35 C con
una agitacin de 200 rpm y pH de 7.
Mediante un anlisis de varianza con un nivel
de confianza mayor al 99% se demostr que
los factores que tienen mayor efecto en el
crecimiento son la temperatura y el pH y la
interaccin de ambos, mientras que la
oxigenacin por agitacin a 200 rpm no tiene
un efecto significativo.
2
the factors which have greatest influence on
growth are temperature, pH and the
interaction between them both, while
oxygenation did not show a significant effect.
Key
words:
environmental
factors,
Lactobacillus casei, pH, temperature,
oxygenation, microbial growth.
INTRODUCCIN
Los
microorganismos
desarrollan
su
morfologa
y
actividad
metablica
adaptndose a las condiciones ambientales
del ecosistema donde viven, estas actividades
se ven muy afectadas por las condiciones
qumicas y fsicas del medio. El conocimiento
y el control de estos efectos permiten disear
escenarios de crecimiento que potencien las
actividades microbianas y la produccin de
un metabolito deseado. Hay diversos factores
que afectan al crecimiento ptimo de un
microorganismo dentro de los cuales destaca
la temperatura. Cada microorganismo tiene
temperaturas cardinales de crecimiento, es
decir, una temperatura mnima, una
temperatura ptima-a la que se produce el
crecimiento ms rpido-y una temperatura
mxima, por encima de la cul es imposible
que se d el crecimiento. Estas tres
temperaturas son caractersticas de cada
organismo.
El crecimiento microbiano tambin se ve
afectado por el pH del medio donde se
encuentre, cada organismo posee un rango de
pH en el cual le es posible desarrollarse y
normalmente posee un pH ptimo definido.
El rango de la mayora de ambientes
microbianos va de 5 a 9. Los organismos que
crecen a un pH menor se consideran
acidfilos, por el contrario, a un pH mayor
son considerados alcalfilos.
3
cultivado en un medio de cultivo lquido
MRS (Man, Rogosa y Sharpe) durante 20
horas a una temperatura de 37C sin agitacin
sometidos a dos pH diferentes (5 y 7).
Posteriormente se llev a cabo un proceso de
re siembra en la que se sometieron a
diferentes condiciones de incubacin
abarcando 3 temperaturas (25, 35 y 45C), los
dos pH mencionados y dos diferentes
condiciones de agitacin (0 y 200 rpm).
Las mediciones se realizaron por duplicado y
se utiliz un control en cada paso de
medicin
Se inocularon 20l del cultivo a 4 tubos de
ensayo con medio de cultivo MRS. A otros 2
tubos de ensayo se le aadi medio de cultivo
libre de microorganismos para fungir como
control. Se verific el pH del cultivo
utilizando tiras de pH. Las muestras para la
medicin del crecimiento del microorganismo
se realizaron a las 0 y 96 horas Para la
determinacin del crecimiento celular se
emplearon
dos
mtodos
indirectos:
cuantificacin de biomasa por turbidimetra y
determinacin de protena por el mtodo de
Bradford.
Para el anlisis de crecimiento por
turbidimetra se utiliz un espectrofotmetro
y se ajust a 540 nm, se utiliz como blanco
1ml de medio de cultivo libre de
microorganismos. Se ley la absorbancia de
1ml de cada muestra colocados en celdas
plsticas y se registraron los resultados.
El anlisis de concentracin de protena se
realiz utilizando el mtodo propuesto por
Bradford, para esto se centrifugaron 0.5ml de
cada muestra a 13000rpm por 10 minutos a
RESULTADOS Y DISCUSIONES
La BAL, grampositiva, heterofermentativa,
L. casei es utilizada ampliamente en la
industria para la produccin biotecnolgica
4
amplios rangos de temperatura ptima para el
crecimiento de L. casei, un pH ptimo
ligeramente cido (5.5- 6.5), mientras que
para la agitacin, los reportes apoyan tanto el
cultivo en presencia, como en ausencia de
agitacin.
En el experimento se llevaron a cabo tres
condiciones de temperatura (25, 35 y 45C),
dos de pH inicial (5 y 7) dos de agitacin (0 y
200 rpm). Se tomaron muestras para obtener
un panorama del crecimiento microbiano por
mtodos indirectos (turbidimetra y protena
por el mtodo de Bradford) y para medir el
pH. Estas muestras fueron analizadas al inicio
del experimento y cuatro das despus de
incubacin. Las lecturas variaron (para
turbidimetra y el mtodo de Bradford) de
espectrofotmetro a espectrofotmetro y se
hicieron lecturas en espectrofotmetros
diferentes en funcin de la disponibilidad. Sin
embargo, las pruebas de turbidimetra
presentaron datos ms homogneos (Tabla 1).
La magnitud de crecimiento fue dada por el
cambio o diferencia en las medidas de la
turbidimetra ( Abs). Se llev a cabo un
anlisis estadstico para evaluar el efecto de
cada factor. Adems, se hicieron anlisis
para el crecimiento en funcin cada factor de
manera independiente, permitiendo as,
analizar de manera global y especfica cada
factor. Algunos datos difieren mucho de los
dems (heterogneos), por tanto tienen baja
confiabilidad.
Tabla 1. Turbidimetra, Datos Finales Grupales . *ND: No diluida. Los datos subrayados son heterogneos y fueron
descartados para algunos anlisis. UA: Unidades de Absorbancia
pH
Agitacin
25
25
35
35
45
45
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
0 rpm
200 rpm
Absorbancia
Inicial ND
(UA)
0.044
0.0435
0.0455
0.06
0
0.1508
0.009
0.0105
0.0095
0.0105
0.0535
0.049
Absorbancia
Final ND
(UA)
1.925
1.583
1.9635
1.8825
0.289
0.317
1.83
2.0145
0.2585
0.2225
1.4345
1.465
Abs
1.881
1.5395
1.918
1.8225
0.289
0.1662
1.821
2.004
0.249
0.212
1.381
1.416
Anlisis Estadstico
Asumiendo
una
distribucin
aproximadamente normal, se realiz un
ANOVA trifactorial (Tabla 2) para evaluar el
efecto del pH (dos niveles), la temperatura
Tabla 2. ANOVA trifactorial del experimento. Se analiz el Efecto de T, pH y Agitacin en el Crecimiento Microbiano
medido por Turbidimetra.
Tabla 3. Promedio de los datos de Turbidimetra a diferentes temperaturas. Los datos subrayados en amarillo son las
medias y los datos subrayados en azul fueron descartados.
Turbidimetra (UA)
25 C
35 C
1.881
0.289
1.53995
0.1662
1.918
1.821
1.8225
2.004
1.77965
1.9125
45 C
0.249
0.212
1.381
1.416
1.3985
2
1.5
25 C
Absorbancia (UA) 1
35 C
0.5
45 C
Tabla 4. Promedio de los datos de Turbidimetra a diferentes grados de agitacin. Los datos subrayados en amarillo son
las medias de cada temperatura y los datos subrayados en azul fueron descartados.
Turbidimetra (UA)
0 rpm
200 rpm
1.881
1.918
1.821
1.381
0.289
0.249
1.75025
1.5395
1.8225
2.004
1.416
0.1662
0.212
1.6955
1.8
0rpm
1.6
200 rpm
Absorbancia
1.4
(UA)
1.2
1
Tabla 5. Promedio de los datos de Turbidimetra a diferentes pH. Los datos subrayados en amarillo son las medias de
cada temperatura y los datos subrayados en azul fueron descartados.
Turbidimetra (UA)
pH = 5
pH=7
1.881
1.5395
0.289
0.1662
0.249
0.212
1.71025
1.918
1.8225
1.821
2.004
1.381
1.416
1.72708333
1.75
1.7
Absorbancia
(UA)
pH 5
1.65
pH 7
1.6
1.55
1.5
Turbidimetra en funcin del pH inicial
9
6.5 (Krischke y col., 1991), y de 5.5 utilzando
L. helveticus (Ghaly y col., 2004), que
coincide con el pH ptimo de la Lactato
Deshidrogenasa (Holland & Pritchard, 1974).
Por tanto para una fermentacin industrial se
debe de identificar el pH ptimo especfico de
crecimiento y el de produccin de cido
lctico, para ajustarlo segn se requiera.
Adems se ha reportado que algunas especies
del Gnero Lactobacillus producen Perxido
Bradford
0 rpm
200 rpm
25 C
0.00775
0.077
35 C
0.064
0.07875
45 C
0.0545
0.03425
Determinacin de Protena
0.08
0.06
Absorbancia (UA) 0.04
0 rpm
200 rpm
0.02
0
25 C
35 C
45 C
Temperatura
Figura 4. Magnitud del Crecimiento (Protena) en funcin de la Temperatura
10
2016
Se puede observar que los datos coinciden
con los datos de turbidimetra, en cuanto a la
temperatura, sin embargo, se observ un
efecto significativo por la agitacin. Los
datos de protena no siguen un patrn
uniforme en cuanto a la agitacin, pues a 25y
a 35 C la agitacin tiene un efecto positivo y
a 45 C tiene un efecto negativo.
CONCLUSIONES
La evaluacin del efecto de los factores
ambientales en el crecimiento de L. casei
indican que el crecimiento ptimo de la
BIBLIOGRAFA
Castrilln Quintana, O. and Bedoya Meja, O. (2006).
Efecto del pH sobre el crecimiento de microorganismos
durante la etapa de maduracin en pilas estticas de
compost. Produccin + Limpia, Vol.1 No.2
Dasari y col. (2014) Antimicrobial activity of Lactobacillus
against microbial flora of cervicovaginal infections. Asian
Pac J Trop Dis. 2014 Feb; 4(1): 1824.
Gandhi, D.N., Patel, R.S., Wadhwa, B.K., Bansal, N.,
Kaur, M. and Kumar, G. (2000), Effect of agro-based byproducts on production of lactic acid in whey permeate
medium. J. Food Sci.Technol., 37, 292-295.
Ghaly, A.E., Tango, M.S.A., Mahmood, N.S. andAvery,
A.C. (2004), Batch propagation ofLactobacillus helveticus
for production of lactic acidfrom lactose concentrated
cheese whey withmicroaeration and nutrient
supplementation. World J.Microbiol. Biotechnol., 20, 6575.
Holland, R., Pritchard, G.G. (1974) Regulation of LLactate Dehydrogenase from L. casei by F-6-P and Metal
Ions. Journal of Bacteriology, p 777-784.
10