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DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
MANUAL DE PRÁCTICAS
DEL
LABORATORIO DE INMUNOLOGIA APLICADA
Profesores de Laboratorio
Dra. María del Carmen Oliver Salvador
M. en C. Paola B. Zárate Segura
Dr. Luis Gilberto Torres Bustillos
M. en C. Rodrigo Balam Muñoz Soto
IBT Héctor Molina Jiménez
IBT Hernán Cortés Arroyo
OCTUBRE 2008
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 2
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS INMUNOLOGÍA APLICADA
ÍNDICE GENERAL
ELECTROTRANSFERENCIA 20
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL 3
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REGLAMENTO DEL LABORATORIO
3. EXAMEN DE LABORATORIO
Consistirá en una evaluación del conocimiento adquirido durante las prácticas
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PRÁCTICA 1
1. INTRODUCCIÓN
SISTEMA ABO
Los eritrocitos poseen en su membrana sustancias antigénicas determinadas
genéticamente, las cuales pueden identificarse mediante anticuerpos específicos. El
primer grupo de estas sustancias fue identificado por Landsteiner en 1901, y le llamó
sistema ABO, el cual consiste en que un individuo tiene en sus glóbulos rojos uno, dos o
ninguno de los dos antígenos (A y/o B) pertenecientes a este sistema. Así, los individuos
pueden ser del tipo A, si solamente poseen el antígeno A; del tipo B, si únicamente tienen
el antígeno B; del tipo AB si poseen ambas, o del tipo 0 si no tienen ninguno de los dos.
La naturaleza química de los determinantes antigénicos es polisacarídica.
Aproximadamente el 85% de la población posee sustancias con características
antigénicas y estructurales similares a las presentes sobre las membranas de los
eritrocitos en prácticamente todas las secreciones corporales. A estos individuos se les
llama secretores.
Los carbohidratos que forman estructura antigénica A y B en la membrana de los
glóbulos rojos, también están presentes en otros materiales biológicos como bacterias,
alimentos y otros agentes ampliamente distribuidos que constituyen un persistente
estímulo. Los humanos reaccionan a este estímulo produciendo anticuerpos contra
aquellos antígenos que no forman parte de su propia estructura celular. Por esta razón, el
anticuerpo anti-A se produce en personas del grupo AB, que contienen ambos antígenos,
no forman dichos anticuerpos. A estos anticuerpos se les llama isohemaglutininas.
Sistema Rh
En 1939. Levine y Stetson reportaron el caso de una mujer con severa reacción
hemolítica después de la transfusión sanguínea proveniente de su esposo. El antígeno
responsable fue diferente de los ya conocidos en la época.
En 1940, Landsteiner y Winier inmunizaron conejos y cobayos con eritrocitos de
monos Macacus rhesus, basandose en la suposición de que en los eritrocitos de estos
monos podrían existir antígenos similares a los de los humanos. El suero obtenido
aglutinaba los glóbulos rojos de los monos rhesus y del 85% de la población humana
blanca.
Hasta ese momento todo sugería que el supuesto antígeno hallado por
Landsteiner y Wiener en monos, y el supuesto antígeno descrito por Levine y Stetson en
humanos, era el mismo. Posteriores investigaciones demostraron que los supuestos
antígenos eran diferentes; se determinó que la mayoría de los humanos tienen el antígeno
del mono rhesus y además otro diferente, pero relacionado. A sugerencia de Levine, se
conservó la demostración del factor Rh para el antígeno humano, y se le asignó el nombre
de LW al antígeno común al hoimbre y al mono.
A mediados de la década de los 40, se habían identificado cinco antígenos como
pertenecientes al actualmente denominado Rh. Estos cinco antígenos (C, c, D, E, e) se
combinan entre sí, dando lugar a diversos patronesantigénicos. El D tiene dominancia
antigénica. Los individuos que presentan el antígeno D en sus eritrocitos se denominan
Rh(+), y aquellos que no tienen el antígeno D se denominan Rh(-).
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Además de los sistemas AB0 y Rh pueden ser detectados otros sistemas
antigénicos de la membrana de los eritrocitos (Lewis, Duffy, MN, Ss. Li, etc). Estos
sistemas se consideran secundarios.
El conocimiento de los antígenos sanguíneos ABO y Rh. Como antígenos
celulares importantes en transfusiones sanguíneas, en medicina legal y en la
isoinmunización materno-fetal.
Los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM. Por lo que son
altamente aglutinantes y fijadores de complemento. Por este motivo, la determinación de
este sistema es de gran relevancia en transfusiones sanguíneas.
2. OBJETIVOS
3. MATERIALES Y REACTIVOS
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Resultados.
De acuerdo al ejemplo anterior, los resultados esperados para confirmar el grupo
sanguíneo serían:
A B 0
Aglutinación + - -
Reacción de los eritrocitos con antisueros Reacción con el suero con antígenos Grupo
comerciales conocidos sanguíneo
Anti-A Anti-B Anti-AB A B O
+ - + - + - A
- + + + - - B
+ + + - - - AB
- - - + + - O
4.2. Sistema Rh
De este sistema por su mayor inmunogenicidad, sólo se determina de forma
rutinaria el antígeno D en caso de requerirse una transfusión sanguínea. Por la
naturalez proteica del antígeno, los anticuerpos inducidos son de clase IgG que
pueden atravesar placenta y causar hemólisis intrauterina en caso de incompatibilidad
materno-fetal.
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1. Con una pipeta Pasteur colocar cuatro gotas de sangre en un tubo con tapón de
rosca que contenga 2 mL de SS.
2. Marcar dos tubos: Rh y Testigo, colocar una gota de eritrocitos en cada uno.
3. Al tubo Rh adicionar una gota de suero anti-D y agitar suavemente.
4. Al testigo adicionar SS y agitar suavemente.
5. Centrifugar 1000 rpm 60seg
6. Buscar aglutinación, en caso de que el tubo Rh presente es Rh(+)
7.Si no hay en ninguno incubar a 37°C, 20 min y lavar 3 veces con SS centrifugando a
1500 rpm 2 min. Después de la última centrifugación remover el sobrenadante y
adicionar al paquete celular dos gotas de suero de Coombs.
8. Resuspender suavemente y centrifugar ambos tubos a 1000 rpm 60 seg.
Resultados.
Presencia de aglutinación.
Rh con aglutinación corresponde al grupo Du Rh(+), en caso negativo Rh(-).
Testigo debe ser negativo, en caso opuesto es autoinmune. Para transfusión el sujeto
clasificado como Du, se considera como donador Rh (+) y receptor Rh (-).
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
1. Bird, G. W.G. and Cunningham, J. 1977. “Agglutination and agglutination-
inhibition”. Techniques in Clinical Immunology. R.A. Ed. Thompson, Black Scientific
Publications. Oxford.
2. Dodd, B.E. and Lincoln, P.J. 1975. Blood Group Topics. John Turk Editor. Year
Book Medical Publishers, Inc.Chicago.
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PRÁCTICA 2
ESQUEMAS DE INMUNIZACIÓN
1. INTRODUCCIÓN.
ADYUVANTES INMUNOLÓGICOS
VÍAS DE INMUNIZACIÓN.
2. OBJETIVOS.
3. MATERIALES Y REACTIVOS.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Para todos los antígenos el sangrado se hace antes y después de la última inmunización,
tratando de extraer la mayor cantidad de sangre posible. El sangrado previo es
indispensable para contar con un suero testigo.
Venosa.
1. Inmovilizar al animal.
2. Tomar la oreja.
3. Limpiar la zona de la vena lateral con alcohol al 70%.
4. Sujetar y colocar una torunda con agua tibia para ayudar a la exposición del a
vena.
5. Hacer un corte con una navaja de bisturí estéril de 2mm de longitudinalmente a
la vena y colectar 2 mL por goteo en un tubo sin anticoagulante.
6. Una vez colectados los 2mL, colocar un vendolete en la oreja.
SS = Solución Salina
Nota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación por
densitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford.
SS = Solución Salina
Nota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación por
densitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford.
SS = Solución Salina
Nota: la dosis debe ser ajustada de acuerdo a la pureza observada en el gel (cuantificación por
densitometría y por la concentración final obtenida por la técnica de Bradford.
4.2. Una vez terminado el esquema de inmunización en cada caso, realice un gel de
electroforesis de poliacrilamida utilizando muestras del suero testigo, del suero obtenido
después de terminado el esquema de inmunización y de los antígenos utilizados. Colocar
el siguiente orden en el gel.
1. Marcador de peso molecular.
2. Antisuero del conejo antes de iniciar el esquema de inmunización.
3. Antisuero del conejo una vez concluido el esquema de inmunización.
4. Antígeno inyectado.
5. Estandar de IgG de conejo.
4.3. Cuantificar por medio de densitometría la proporción de IgG obtenidas. (% pureza).
4.4. Reportar el gel final como resultado de esta práctica.
5. CUESTIONARIO.
5.1 ¿Qué es un antígeno soluble y qué es un antígeno partículado?
5.2 ¿Por qué se utilizan las diferentes vías de inmunización para los antígenos?
5.3 Investigue la importancia del uso de adyuvantes en la vacunación, los principales
tipos de adyuvantes y su mecanismo de acción, así como restricciones de uso.
5.4 Cite 5 tipos de antígenos utilizados para la inmunización de animales,
describiendo la naturaleza del antígeno, la vía de inmunización que se utiliza y
especie de animal en que se desarrolla.
5.5 . Investigue las nuevas vías de administración de proteínas para generar
respuesta inmune.
5.6 . Explique de que depende el desencadenamiento un tipo específico de
respuesta inmune (no específica, humoral o celular) en un organismo.
5.7 . Investigue el peso molecular de las IgG y compare los resultados obtenidos en
el gel de acrilamida.
6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
6.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de técnicas modernas en Inmunología.
Teoría y práctica. 1ª. Edición. INDRE-SSA. México.
6.2. Manual de laboratorio de Inmunología. (1998). Departamento de Inmunología. Escuela
Nacional de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.
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6.3. Biotecnología Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.
6.4 Grupta R., Relyveld E., Lindblad B., Bizzine B., Ben-Efraim S. and Grupta C (1993).
Adjuvants-a balance between toxicity and adjuvancicity. Vaccine (11):293-306.
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PRÁCTICA 3
REACCIONES DE PRECIPITACIÓN
1. INTRODUCCIÓN
Otra variante en la que sólo uno de los reactivos (generalmente el antígeno) difunde en el
gel, donde se haya embebido el otro (generalmente el antisuero), se conoce como
imunodifusión simple. En la imunodifusión radial se aplica este principio para determinar
cuantitativamente la concentración del antígeno, éste se encuentra en una concentración
inicial tan alta, que se forman complejos solubles y a medida que se van difundiendo, la
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concentración disminuye hasta que, en el sitio donde los reactivos están en proporciones
óptimas, se forma un halo de precipitación cuyo diámetro tiene relación directa a la
concentración del antígeno.
La técnica de imunoelectroforésis fue propuesta por Grabar y Williams quienes
combinaron las técnicas de electroforesis y de inmunodifusión para separar y determinar
la presencia de los componentes de una mezcla de sustancias antigénicas.
Primeramente, los componentes de la mezcla son separados por la aplicación de una
corriente eléctrica y posteriormente, se hacen reaccionar con sus anticuerpos específicos,
con los que se realiza la precipitación. Esta prueba es ampliamente utilizada para
determinar la pureza de sustancias antigénicas.
En la contra–inmunoelectroforesis, los antígenos y sus anticuerpos simultáneamente se
someten a la acción de un campo eléctrico en un gel a Ph de 8.6. En estas condiciones,
los anticuerpos casi no tienen carga, por lo que no se desplazarán bajo el efecto de la
corriente eléctrica, sin embargo, se mueven hacia el cátodo debido al flujo endosmótico
del regulador usado.
Los antígenos que poseen carga negativa migran hacia el ánodo y mediante la
disposición apropiada de los pozos en el agar, se puede lograr que el antígeno y el
anticuerpo se encuentren, reaccionen y se desarrollen bandas de precipitación en poco
tiempo, dependiendo de la concentración y de la velocidad de migración de los reactivos.
Obviamente, este método no es aplicable a antígenos con carga positiva o neutra.
2. OBJETIVOS.
3. MATERIALES Y REACTIVOS.
3.2 Reactivos
- 5 ml. de solución salina isotónica.
- 1.0 ml. de solución de antígeno que se desea probar.
- 1.0 ml. del antisuero correspondiente.
- Antisuero del conejo obtenido antes de empezar el esquema de inmunización.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
5. CUESTIONARIO
• Que metodologías actuales se pueden aplicar para medir la reacción antígeno-
anticuerpo.
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6. REFERENCIAS.
7.1. Correa, D., Mandujano A., (2000) Manual de técnicas modernas en Inmunología.
Teoría y práctica. 1ª. Edición. INDRE-SSA. México.
7.2. Manual de laboratorio de Inmunología. (2). Departamento de Inmunología. Escuela
Nacional de Ciencias Biológica. ENCB-IPN. México.
7.3. Biotecnología Aplicada. (2000). Vol. 17 (3) Ed. Elfos Scientiae. La Habana Cuba.
7.4. Mueller UW, Hawes CS, Jones WR. Monoclonal antibody production by hybridoma
growth in Freund´s adjuvant primed mice. J. Immunol. Methods 1986; 87:193.
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PRÁCTICA 4
1. INTRODUCCIÓN
2. OBJETIVO
3. MATERIALES Y REACTIVOS.
3.2 Reactivos
- Reactivo de Bradford
- Suero del conejo obtenido después el esquema de inmunización.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
Se determina la concentración de proteínas, por medio de una curva tipo con BSA
y el reactivo de Bradford, como se indica abajo:
(BSA) 200 0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25
µg/mL (mL)
Agua destilada 0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0
(mL)
Reactivo de 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75 0.75
Bradford (mL)
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Cada una de las diluciones se realiza por triplicado. Después de 5 min de agregado el
reactivo de Bradford, se lee la absorbancia a 595 nm, ajustando el equipo con un “blanco
de reactivos” (el que no contiene proteína) y se calcula la ecuación de la recta.
ANEXOS
5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
• Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram quantitites of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:
248-254. 1976.
• Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69
(1990).
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PRÁCTICA 5
1. INTRODUCCIÓN
2. OBJETIVOS
3. MATERIALES Y REACTIVOS.
Cámara de electrotransferencia
Fuente de Poder
Papel filtro Whatman 3mm
Papel de Nitrocelulosa
Ambos papel de nitrocelulosa y papel filtro hay que cortarlos del mismo tamaño del gel de
porteinas (SDS-PAGE).
Vasos de precipitado
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Micropipetas
Matraces aforados
Matraces erlenmeyer
3.2. Reactivos
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
3. Colocar el peine con cuidado de no formar burbujas y dejar polimerizar por 20 min.
4. Preparar las muestras y el marcador de peso molecular.
5. Montar las placas de vidrio en su base y ésta en la cámara de electrofóresis.
6. Preparar el amortiguador de corrida al 1X.
7. Llenar la cámara interna con amortiguador de corrida hasta el límite y la parte
externa hasta cubrir los electrodos.
8. Cargar el gel con las muestras y el marcador de peso molecular.
9. Tapar y conectar los electrodos a la fuente de poder.
10. Iniciar con un voltaje de 50 V hasta que las muestras pasen del gel concentrador,
posteriormente aumentar a 100 V hasta que el frente alcance la parte inferior del
gel.
11. Apagar la fuente de poder y recuperar el amortiguador de corrida (se puede
utilizar hasta 3 veces)
12. Desmontar la cámara y extraer con cuidado el gel. Colocar el gel en un recipiente
adecuado y teñirlo con la sol. correspondiente. Colocar en agitación orbital durante
1 hora aprox. Retirar el gel y sumergirlo en la sol. desteñidora hasta desteñir bien
el gel.
1.- Colocar fibras Scotch y papeles Whatman (grosor 0.16 mm) en un recipiente con
suficiente amortiguador de transferencia, 30 minutos antes de transferir.
2.- Cortar la membrana de nitrocelulosa (NC) de acuerdo al tamaño del gel (utilizando
guantes) y colocarla en otro recipiente que contenga amortiguador de transferencia.
3.- Colocar dos fibras Scoth en un “cassette” para electrotransferencia, sobre las cuales
se colocan dos porciones de papel filtro teniendo cuidado que no queden burbujas
atrapadas entre los papeles; después colocar el gel y sobre este la membrana de NC;
eliminar las burbujas.
4.- Con un lápiz marcar el frente de electroforesis del gel, sobre el papel de NC y señalar
el número de carril de acuerdo a la colocación de las muestras, colocar otros dos papeles
filtros sobre la NC y otras dos fibras. Cerrar el “cassette” e insertarlo en el contenedor.
5.- Colocar el contenedor en la cámara y llenarla con el amortiguador de transferencia,
tapar y conectar los electrodos de tal manera que el ánodo (-) quede del lado del gel y el
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cátodo (+) del lado de la NC; conectar a la fuente de poder y transferir durante 1 hora a
100 V, cuidando de que la temperatura del líquido no se eleve a más de 60° C.
6.- Al terminar la transferencia tomar la membrana de NC con guantes y colocarla en un
recipiente con solución para teñir (durante 20 minutos)
7.- Observar en la membrana si se distinguen las proteínas que fueros transferidas, lavar
con agua destilada para retirar el exceso de colorante y secar; si no se alcanzan a
distinguir las bandas teñir otros 20 min.
ANEXOS
Sol. teñidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de
agua desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Commasie en el
metanol y adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.
Sol. desteñidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.
SOLUCIONES DE ELECTROTRANSFERENCIA
Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2M
y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200mL de metanol aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar
hasta 3 veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.
Solución de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20.
Guardar a -20° C.
5. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1. Fundenberg, Hugh, Stites Daniel, Caldwell, Joseph, Wells, Vivian, Manual de
Inmunología clinica, segunda edición, editorial el Manual Moderno, Mexico, 1980, pp. 50-
60.
2. Towbin H., Staehelin, Gorgon J.. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc Natl
Sci USA, 1979, 76:4350.
3. Peferoen M. R., Huybrechts R., De Loof A. Vaccum-blotting: A new simple and efficient
transfer of proteins from sodium docedyl sulfate-polyacrylamide gels to nitrocellulose.
FEBS Lett. 1982, 145:369.