You are on page 1of 22

细菌 形态 学检查 法

 油镜的 使用方法
 革兰氏 染色法

 抗酸染 色法

 示教标 本
油镜的使 用方 法
 使用前 必须对 所用 显微镜 进行 详细检 查

 调光: 检查未 染色 标本时 ,以 弱光线 为宜 ,此


时可将 集光器 下降 或缩小 光栅 ,检查 染色 标本
时,以 光线强 为宜 ,此时 应适 当升高 集光 器或
将光栅 打开。
 标本观 察:将 标本 置于载 物台 上,先 用低 倍镜
观察。 用粗螺 旋调 至看出 物象 后,再 调节 微螺
旋,使 物像更 加清 晰。在 换高 倍镜观 察前 ,鉴
于高倍 镜视野 范围 比低倍 镜小 ,故须 将被 观察
内容移 至视野 中央 后再换 之。 有时显 微镜 本身
存在偏 心现象 ,此 时要记 住其 偏心的 方向 和距
离。
 用油浸镜观察前,应 先转开低倍镜或高倍镜
镜头 ,在玻片上加一滴镜油,再转换油镜头。
眼从侧方看,调节粗螺旋,使镜头浸入镜油
中至接近玻片时为止(注意勿压碎玻片)。
眼看目镜,调节粗螺旋提升镜筒,至看到物
象,再调节细螺旋,至可清楚看到标本为止。
观察完毕,应先提高镜筒,并将高倍镜(或
油浸镜)头扭向一侧,再取下玻片。
革兰氏染 色法
 原理
细菌经结 晶紫 初染染 成蓝 色。 革兰氏 染
色阳性 菌( G+ )细胞 壁肽 聚糖 层数 多,且
肽聚糖 为空 间网状结构 ,再 经乙 醇脱水 ,网
状结构 更为 致密 ,染料 复合 物不易 从细胞 内
漏出, 仍为 蓝色 。
 革兰氏 染色 阴性 菌( G- )细胞 壁脂 类含量
多,肽 聚糖 层数 少,且 肽聚 糖为 平面片层 结
构, 易被乙 醇溶 解,使 细胞壁 通透性 增高 ,
结合的 染料 复合 物容易 泄漏 ,细菌 被脱色 为
无色, 再经 石炭 酸复红 稀释 液复染 成红色 。
 材料
1 、金黄 色葡 萄球菌 24h 斜面培养 物
2 、大肠 杆菌 24h 肉汤培养 物
3 、革兰 氏染 色液
4 、 生 理盐水
5 、载物 玻片 、接种 环等
革兰氏 染色 方法
涂片→干燥→固定 →染色 →镜检
1 涂片:按 无菌 操作 取材法 进行, 具体 步骤如
下( 用肉 汤培养 物涂片 ):
① 右手拿接 种环 的黑色 塑料柄 部分 ,
左手 托持 试管。
② 将接种环 按 15° 角放在 煤气 灯的 外
焰中 烧灼 灭菌, 直到把 金属 丝烧 红,然 后将
铝制 的银 色柄部 也通过 火焰 略加 烧灼。
③ 用右 手小 指和 手掌的 前内缘 拔掉 左
手所持 试管 的棉 塞,并 立即 将试管 口用火 焰
烧灼灭 菌。

④ 用灭 菌后 已冷 却的接 种环伸 入试 管
中取出 材料 ,此 时注意 勿使 沾有材 料的接 种
环触碰 试管 壁及 试管口 。
⑤ 将试 管口 、棉 塞再次 灭菌, 塞好 棉
塞,放 回原 处。

⑥ 将接 种环 上之 材料涂 于载物 片上 ,
随后立 即将 接种 环用火 焰烧 灼灭菌 。
 为防止 细菌 溅散 污染环 境, 接种环 灭菌前 ,
须先将 接种 环靠 近火焰 或放 内焰中 烤干, 然
后再在 外焰 中烧 红灭菌 ,杀 死残留 的细菌 。
2 .干燥 :放空 气中 自然 干燥。 如欲 加速,
也可 把涂 片置于 火焰上 部的 热气 层中烘 烤
,但 切勿 将涂膜 烤焦。
3 .固定 :用染 色夹 子夹 住涂片 ,在 火焰的
最热 部分 连续通 过三次 ,以 固定 之。此 时
杀死 大部 分细菌 ,并使 标本 固定 于玻片 上
,以 免在 染色或 水洗过 程中 被冲 掉。
4 .染色 :
① 初染 : 将结晶 紫染 液加于 涂膜上 ,染 色
1min 。
② 媒染 : 水洗后 加芦 戈氏碘 液处理
1min 。
③ 脱色 : 水洗后 用 95 %酒 精脱 色, 脱色
时频频 摇动 玻片 ,直至 流下 的液体 无色为 止
( 约需 0.5min) 。
④ 复染 : 水洗后 加石 炭酸复 红稀释 液染
1min 。

⑤ 镜检 : 水洗, 用滤 纸轻轻 吸干, 待标 本


充分干 燥后 进行 镜检。
注意事 项:
 酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节

,如脱色过度,则革兰氏阳性菌可能
被误染为革兰氏阴性菌,如脱色不够
,则革兰氏阴性菌可能被误染为革兰
氏阳性菌,所以脱色时间要很好掌握。
脱色时间的长短还受涂片厚薄的影响
,一般涂片时取菌要少,涂片薄而均
匀为好。
 被检菌的培养条件、培养基成分、菌龄的

不同等原因会影响染色结果,如革兰氏阳
性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴性的
几率,所以被检菌的菌龄一般最好在
18~24h 之内。
抗酸 染色
 材料

1 .结核病人的喀痰
2 .抗酸染色液
3 . 3% 盐酸 酒精
4 .碱性美兰染液
5 .生理盐水
6 .滤纸片
7 .载物玻片,接种环等
 方法

1 .涂膜
2 .干燥
3 .固定
4 .染色
染色方 法
① 在已固定好的 涂片上放 置滤纸片(滤 纸的作
用是滤 去染液中的 沉渣,使标 本清晰), 滴
加抗酸 染液于滤纸 片上,将整 个滤纸片滴 满

② 将加有染液的 滤纸片加 温:在火焰上 方保持
一定高 度,加热至 出现蒸气( 注意不能使 染
液沸腾 ),如此反 复 2~3 次(约 5min )。
在加热 过程中要防 止将染液烘 干,应及时 添
加染液 。
③ 去掉滤纸片,待玻片 冷却 后,水洗。
④ 用 3% 盐酸 酒精脱 色,直 到流下 的液体
无色为止,进行水洗。
⑤ 用碱性美兰染液复染 30s ,水洗,干燥
,镜检。
结果观 察

 结核杆 菌染成 红色 ,细长 、直 的或微 弯曲 杆菌


,偶尔 有杆菌 着色 不均, 呈颗 粒状者 。标 本的
其余部 分及非 抗酸 性细菌 染成 兰色。 必须 逐一
观察各 个视野 ,直 到全部 涂片 找不到 结核 杆菌
时,才 可报告 阴性 。