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实验内 容

 病毒 学实 验
( 1 )病毒培 养法
( 2 )病毒形 态观 察
( 3 )病毒感 染致 细胞病 变效 应
( 4 )病毒感 染性 测定
( 5 )补体结 合试 验
 真菌 及其 他微生物 实习
病毒培 养法
鸡胚培 养法
鸡胚 培养为 常用 的病毒 培养 法之一 ,操 作简便
,管理容 易, 本身带 病毒 的情况 少见 。对某 些呼 吸
道病毒如 正粘 病毒、 副粘 病毒、 痘类 病毒、 疱疹 病
毒和某些 脑炎 病毒很 敏感 ,可用 来从 病人材 料中 分
离上述病 毒。
实验 室常用 的鸡 胚接种 法有 尿囊 接种 、绒毛 尿
囊膜接种 、卵黄囊接 种及羊膜 腔接种 。按 各类病 毒
在鸡胚中 的适 宜生长 部位 选用适 当方 法接种 。
组织培 养法
 组织培 养法 是目前 培养 病毒 应用最 广的 方法,
经济适 用, 结果正 确敏 感, 较实验 动物 易控制
和管理 。组 织培养 法是 用离 体的活 组织 或细胞
来培养 病毒 ,组织 来源 多种 多样, 如各 种动物
组织、 鸡胚 组织、 人胚 羊膜 组织或 人胚 组织等

 实验室 常用 的细胞 有原 代细 胞如鸡 胚单 层细胞
、人胚 肾及 猴肾细 胞; 传代 细胞如 HeIa 细胞及
二倍体 细胞 等。
病毒感 染致 细胞病 变效 应
 细胞 病变( Cytopathogenic effect ,CPE )
有很 多种病 毒在 敏感 细胞 内增殖 时,可 引起具 有
一定 特征的 细胞 病变 , CPE 可在 未固 定、未 染色 的
条件 下用低 倍镜 观察 ,是判 定病毒 增殖 的最常 用指
标。 单纯疱 疹病 毒的 CPE 是使细 胞变 圆、膨 大,细
胞相 互融合 形成 灶状 区。在 观察 CPE 时应与 正常 细
胞对 照管进 行比 较, 以免把 正常细 胞的 衰变误 认为
是由 病毒引 起的 CPE 。
病毒感 染性测定
 材料
1 .待 测病 毒液、 HeIa 细胞、 1640 维持液、 经紫 外线照 射
2h 的 40 孔塑 料组织 培养 板或细 胞瓶 及加样 器、 吸管、 试
管等
 方法
1 .待 测病 毒液按 10 倍系 列稀释 法稀 释
2 .各 稀释 度的病 毒接 种于形 成单 层的细 胞瓶 或培养 板
(每稀释 度接 种 4 瓶)。
3 .将 细胞 瓶或培 养板 置于温 箱 37℃ 培养 数日。
4 .观 察 CPE, 找出 能引起 半数 细胞瓶 或管 感染的 病毒 稀释
倍数,按 Reed Muench 法计 算出该 病毒 液的 TCID50 效
价。
滴定病 毒 TCID50 计算表

接种 无病变 有病变 累积总数 细胞 出现


病 毒
细胞 细胞 细胞 病变管 细胞
稀释度 无病 有病
管数 管数 管数 比例 病变率
变管 变管
10-1 4 0↓ 4 0 16 16/16 100%

10-2 4 0 4 0 12 12/12 100%

10-3 4 0 4 0 8 8/8 100%

10-4 4 1 3 1 4 4/5 80%

10-5 4 3 1↑ 4 1 1/5 20%

10-6 4 4 0 8 0 0/8 0%

正常对照 4 4 0
补体结 合实 验
 补体结 合试 验由两 个系 统组 成,即 反应 系统与
指示系 统。 反应系 统中 抗原 抗体结 合吸 附补体
后,其 反应 结果看 不见 ,必 须以绵 羊红 细胞和
溶血素 ( 溶血素 系统 ) 作为指示 系统 ,方能 证明
反应系 统中 是否有 特异 抗原 抗体结 合。 本反应
特异性 强, 最常用 于诊 断病 毒性疾 病。
 由于参 与本 反应的 各种 成分 之间要 求有 适当的
量的关 系, 因此做 本实 验之 前必须 通过 一系列
预备实 验来 确定补 体; 溶血 素、抗 原或 抗体的
使用量 。
 材料
① 脊髓灰质炎病毒免疫血清 (1 : 5 稀释 )
② 脊髓灰质炎病毒 ( 适当 稀释 )
③ 腺病毒 ( 适当 稀释 )
④ 补体 (1 : 25 稀释 )
⑤ 溶血系统 (2 %绵 羊红 细胞 +适 量溶 血
素)
⑥ 生理盐水
⑦ 吸管,小试管,水浴箱等。
按下表 操作


脊髓
试 免疫 腺病 生理 血 结
灰质炎 补体
管 血清 毒 盐水 系
病毒 ml
号 ml ml ml 统 果
ml 摇匀 摇匀
ml
1 0.2 0.2 - 0.2 - 后于 0.4 后置
37℃ 37℃
2 0.2 - 0.2 0.2 - 0.4
水浴 水浴
3 0.2 - - 0.2 0.2 15 至 0.4 15 至
4 - 0.2 - 0.2 0.2 30 分 0.4 30 分
钟 钟
5 - - - 0.2 0.4 0.4

6 - - - - 0.6 0.4
真菌形 态及生长 状态观察
 从形态上 分: 酵母菌 落、 酵母样 (型 )菌落 及丝 状菌落

1. 酵母 菌落( 观察 新生隐 球菌 培养物 ): 菌落为 圆形 、
较白色, 边缘 整齐表 面光 滑、湿 润, 假菌丝 不伸 入到培
养基内, 和表 皮葡萄 球菌 菌落相 似。
2. 酵母 样(型 )菌 落(观 察白 假丝酵 母菌 ):表 面和 酵
母菌落相 似, 但生成 的假 菌丝伸 入培 养基内 。
3. 丝状 菌落: 观察 各种皮 肤丝 状菌斜 面培 养物 , 菌落 表
面大都有 气生 菌丝 , 肉眼观 察呈绒 毛状 、粉状 、棉 花样
等,故称 丝状 菌落, 色泽 多种多 样, 红色毛 菌呈 紫红色
,铁锈色 毛菌 呈铁锈 色或 棕色等 ,菌 落底层 有营 养菌丝
伸入培养 基内 。
菌丝的 形态
① 梳状菌 丝: 菌丝 一侧有 多数 短的分 枝,间 距不 等, 形如
梳子, 故名 梳状 菌丝。 常见于 许兰 氏毛菌 。
② 螺旋状 菌丝 :菌 丝呈螺 旋状 弯曲, 常见于 石膏 样小 孢子
菌和许 兰氏 毛菌 。
③ 球拍样 菌丝 :在 菌丝分 节处 一端膨 大,如 网球 拍样 ,常
见于小 孢子 菌及 表皮癣 菌。
④ 结节状 菌丝 :菌 丝缠绕 成结 节样, 常见于 奥杜 盎小 孢子
菌等
⑤ 鹿角状 菌丝 :菌 丝末端 膨大 成鹿角 状,多 见于 许兰 氏毛
菌。
⑥ 假菌丝 :酵 母菌 (如: 白假 丝酵母 菌)的 菌体 细胞 延长
分枝后 并不 脱落 ,形成 类似菌 丝的 结构。
孢子的 形态
① 芽生孢子:从母细胞发芽而产生,如新生隐球菌(墨汁染
色)。
② 厚膜孢子:是从菌丝产生的一种大而圆形的孢子,于毛癣菌
及小孢子菌中常见。
③ 小分生孢子 : 孢子为单细胞性孢子,常直接或由小侧枝连接
而生长于菌丝的侧面。毛癣菌中常可见到小分生孢子群集中
在分枝菌丝末端,呈葡萄状。也有圆形小分生孢子位于菌丝
的旁侧。
④ 大分生孢子:是一种多细胞性孢子,常为梭形或棒形,多数
大分生孢子具有数个横隔,每个横隔即为一个细胞。如絮状
表皮癣菌的大分生孢子为粗棍型或卵圆形,末端较粗而钝圆
,单一或簇生于菌丝端,大小孢子菌则为梭形大分生孢子。
⑤ 关节孢子:由菌丝细胞分化成几个长方形的节段而成,胞壁
也稍厚些,在陈旧培养物中常可出现。