Artículo Original
Estandarización de una Técnica para la Detección de
Salmonella spp. útil para Manipuladores de Alimentos
Mediante Técnica de Amplificación Molecular
STANDARDIZATION OF A TECHNIQUE FOR THE DETECTION OF SALMONELLA SPP. USEFUL FOR FOOD
HANDLERS BY MOLECULAR AMPLIFICATION TECHNIQUE
Mauricio Urrutia1 T. M.; Eugenio Reyes1 T.M. PhD (c) Tecnología; Cecilia Melo2 E.U; Manuel Henríquez3 T.M.; Jorge Pineda4;
Andrea Sakurada5; MD
1. Laboratorio de Biotecnología FUCYT-ACHS, Santiago Chile.
2. Servicio Exámenes Preventivos Hospital del Trabajador-ACHS, Santiago, Chile.
3. Laboratorio Microbiología NESTLE Chile.
4. Laboratorio ACHS ARAUCO, Santiago, Chile.
5. Hospital JJ Aguirre, Santiago, Chile.
RESUMEN
El problema de las toxoinfecciones alimentarias es un problema de
salud a nivel mundial, entre las que se encuentran las producidas por
Salmonella spp.; la prevalencia de sus especies ha cambiado en los
últimos años, además del bajo nivel de sensibilidad de los métodos
tradicionales de aislamiento como es el caso del coprocultivo. Debido
a esto el objetivo de este trabajo fue estandarizar una metodología
molecular (PCR) para este patógeno a partir de muestras fecales; los
resultados mostraron gran sensibilidad y especificidad, haciendo
factible su utilización en manipuladores de alimentos.
(Urrutia M, Reyes E, Melo C, Henríquez M, Pineda J, Sakurada A.2006.
Estandarización de una Técnica para la Detección de Salmonella spp.
Útil para Manipuladores de Alimentos Mediante Técnica de
Amplificación Molecular. Cienc Trab. Oct-dic;8(22): 164-166).
Descriptores: SALMONELLA, INTOXICACIÓN ALIMENTARIA POR
SALMONELLA/EPIDEMIOLOGIA, REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA, MANIPULACIÓN DE ALIMENTOS/RECURSOS
HUMANOS; TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR;CHILE.
INTRODUCCIÓN
Múltiples patógenos han sido involucrados en las Toxoinfecciones
alimentarias; entre éstas, una enterobacteria involucrada en
grandes problemas de salud a nivel mundial, tanto en países indus-
trializados como en países en vías de desarrollo es Salmonella spp.
Según el CDC, la incidencia de Salmonella spp. es de 14,43 casos
por 100.000 habitantes (CDC 2006). En Chile es endémica y está
asociada principalmente a consumo de alimentos y aguas conta-
minadas. Esta bacteria es causante de enfermedades gastrointesti-
Correspondencia / Correspondence:
Eugenio Reyes Arenas
Laboratorio de Biotecnología Fundación Científica y Tecnológica
Asociación Chilena de Seguridad
Diagonal Paraguay 29, piso 4, Santiago
Tel.: (56-2) 685 3604 • Fax (56-2) 6852963
e-mail: fctera@achs.cl
Recibido: 02 de octubre de 2006 / Aceptado: 11 de diciembre de 2006.
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ABSTRACT
Alimentary toxicoinfections is a global level health problem. Among
these we find those produced by Salmonella spp. Prevalence of
Salmonella species has changed in the last years, as well as the low
sensitivity level of traditional methods of isolation such as the case
of coproculture. Due to this, the objective of this work was to stan-
dardize a molecular methodology (PCR) for this pathogen from feces
samples. The results showed a great sensitivity and specificity, mak-
ing its use feasible in food handlers.
Descriptors: SALMONELLA; SALMONELLA FOOD POISONING/EPI-
DEMIOLOGY; POLYMERASE CHAIN REACTION; FOOD HANDLING/
MANPOWER TECHNIQUES; MOLECULAR DIAGNOSTIC; CHILE.
nales, principalmente diarreas, que incluso pueden llevar a la
muerte si no son tratadas debidamente (Álvarez et al. 2004).
Las diarreas por Salmonella spp., llamadas salmonelosis, son
causadas principalmente por especies zoonóticas, con brotes de
origen alimentario; en un 50% hay productos avícolas involu-
crados. Pueden causar generalmente diarreas secretoras, aunque
puede haber casos disentéricos; en América Latina las diarreas por
Salmonella corresponden de 0,5 a 4% de los episodios. Desde 1994
la frecuencia de aislamientos de Salmonellas cambió de S. thypi a
S. Enteritidis. Actualmente esta última especie posee la de mayor
frecuencia de aislamiento, con un 47%, aproximadamente
(Woodward et al. 1997; Fica et al. 2001).
En la Región Metropolitana la ocurrencia de brotes de enferme-
dades transmitidas por alimentos es de 20 brotes mensuales, y la
realidad puede superar la cifra, debido a la subnotificación existente
(Prado et al. 2002).
Salmonelosis es una enfermedad que puede ser asintomática, lo que
genera un gran problema porque es una enfermedad altamente
contagiosa, debido a la baja dosis infectante necesaria.
Principalmente, esto es de gran interés en manipuladores de
alimentos, los cuales podrían ser portadores y diseminar la enfer-
medad (Fica et al. 2001).
Ciencia & Trabajo
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Se ha demostrado la excreción fecal de Salmonella spp. Buchwald
y Blazen, encontró que pacientes que presentaron Salmonella spp.,
luego de cuatro semanas, seguían excretándola (Buchwald y Blazer
1984). Murase y cols. 2000 realizó un estudio de una toxicoinfec-
ción por Salmonella spp. en un casino de colegio en Japón y
demostró la presencia de Salmonella spp. en personas sin sintoma-
tología. (Murase et al. 2000)
Los métodos tradicionales de detección están basados en el uso de
medios de cultivo selectivos y posterior caracterización de colonias
sospechosas por test bioquímicos y serológicos. El método estándar
de oro es el coprocultivo, el cual tiene gran valor en estudios epide-
miológicos; sin embargo, estudios de síndromes diarreicos en todo
paciente son cuestionados, ya que la gran mayoría de los cuadros
son autolimitados.
El coprocultivo es una muestra que por su carga de trabajo, costo y
volumen, suele ser de bajo rendimiento y bajo costo-efectividad. La
positividad es de 1,8% a 4,4%. De esta misma forma el porcentaje
de recuperación de los medios de cultivo (Mac Conkey - Hektoen)
es de 4% a 10%. Los métodos de identificación tradicional sólo
detectan una pequeña fracción de los casos de salmonelosis. La baja
sensibilidad de los métodos tradicionales es debida a un bajo
número de microorganismos causales, debido a la competición de
los otros organismos comensales, como también a unos inapro-
piados cambios en la temperatura medioambiental y pH durante el
transporte del espécimen. Además se debe tomar en cuenta que se
necesita individuos altamente entrenados en el diagnóstico de estos
patógenos.
Actualmente las técnicas moleculares han sido utilizadas amplia-
mente como herramienta epidemiológica y clínica. La utilidad de la
amplificación genómica (PCR) como herramienta diagnóstica de
identificación de patógenos ha sido bien documentada en la litera-
tura mundial, siendo utilizada ampliamente en muestras de
matrices alimentarías, medioambientales y clínicas en forma
creciente. La PCR ha sido utilizada como herramienta de investiga-
ción de focos de brotes alimentarios y la identificación de agentes
etiológicos responsables. Esta técnica presenta alta sensibilidad,
especificidad y menor tiempo de proceso. La realización de la detec-
ción por el método de la PCR depende, en parte, de la extracción
del DNA, y la especificidad de los partidores. Las matrices ambien-
tales, alimentarías y clínicas son muy complejas, debido principal-
mente a la elevada cantidad de proteínas, glúcidos y lípidos exis-
tentes, como la presencia de otros microorganismos presentes; esto
contribuye a limitaciones de la técnica. Para eliminar o disminuir la
cantidad de inhibidores, se han probado distintos tipos de extrac-
ción; entre ellos existe la utilización de diferentes detergentes para
romper las membranas celulares, como Tritón, SDS, CTAB,
β−mercaptoetanol, entre otros. Las concentraciones de los dife-
rentes reactivos deben ser probadas de acuerdo a experimentos
empíricos, puesto que las matrices utilizadas son diferentes y se
debe priorizar una técnica que deba ser costo/efectiva.
Los inhibidores son una de las problemáticas mayores dentro de los
análisis hechos por la PCR; para esto se han ideado pasos de preen-
riquecimiento de las muestras a analizar, el Selenito es de elección
en clínica. Tetrationato y Rappaport-Vassidialis han sido utilizados
principalmente en los laboratorios de alimentos. La finalidad de
estos medios es diluir los interferentes y aumentar la cantidad de
microorganismos viables, con lo cual aumentan el número de
copias de DNA aumentando la sensibilidad de la técnica (Carli et al.
2001; Gentry-Weeks et al. 2002; Fukushima et al. 2003; Aranda et
al. 2004).
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Debido a las causas antes mencionadas es necesario validar una
técnica para la detección de Salmonella spp. en portadores (mani-
puladores de alimentos) más sensible y más rápida que las actuales
disponibles en laboratorios de rutina.
OBJETIVO
El trabajo fue estandarizar la técnica de PCR y objetivar su sensi-
bilidad, especificidad, valor predictivo positivo, negativo y repro-
ducibilidad en el estudio de muestras clínicas (coprocultivos)
obtenidas de manipuladores de alimentos de empresas asociadas
a la ACHS.
MATERIAL Y MÉTODO
Se recolectaron 208 coprocultivos en el laboratorio ACHS-
ARAUCO, provenientes del Servicio de Exámenes Preventivos
(SEP) en el primer semestre del período 2005.
Todas las muestras eran de manipuladores de alimentos y otras
de la rutina del laboratorio.
Las muestras fueron preenriquecidas 15 a 18 horas en Selenito y
se ensayó, en paralelo, a partir de una alícuota, la técnica tradi-
cional (coprocultivo) y la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) a partir de las heces de los pacientes,
Se utilizaron medios de cultivo tradicionales (Mac Conkey y
Hecktoen), además de medios selectivos (XLD y S-S), se incu-
baron por 15 a 18 horas y a 5 colonias sospechosas presentes en
la placa se les realizó aislamiento e identificación por pruebas
bioquímicas (TSI, LIA, MIO, UREA de Christensen, CITRATO de
Simmons).
Se extrajo el DNA de 1mL del Selenito previamente enriquecido
y se amplificó con un partidor escogido de la literatura.
El partidor es específico para Salmonella spp. y codifica para una
porina de membrana externa (proteína) de todas las Salmonellas.
Se estandarizaron las condiciones de reacción de la Técnica de
Amplificación Genómica (MgCl2, KCl, dNTPs, Primers, y pH del
buffer).
Los DNAs fueron amplificados en un termociclador Eppendorf. La
electroforesis fue realizada en una cámara tipo, y se corrió con
una fuente de poder a 120 volts por 40 minutos.
Se reveló la electroforesis previa exposición en Bromuro de
Etidio 1 ug/mL en transluminador uv.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES:
La especificidad comparativa de la técnica con el Gold Estandar
resultó en un 98% (Figura 1). La PCR no tuvo reacción cruzada con
ningún DNA de otras enterobacterias.
La sensibilidad comparativa de la técnica con el Gold Estándar
resultó en un 100% (Figura 2). La capacidad de resolución de la
técnica de PCR es una unidad formadora de colonia previo enri-
quecimiento en Selenito, tras las 15 a 18 horas.
De las 208 muestras procesadas, 204 fueron negativas por ambas
metodologías y 1 fue positiva por ambas técnicas. El valor predic-
tivo positivo fue de 25% y el valor predictivo negativo 100%. Hubo
3 discordancias, siendo positivas por PCR y negativas por copro-
cultivo (Tabla1).
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Artículo Original | Urrutia Mauricio
Figura 1.
Especificidad de la técnica de amplificación molecular PCR con cepas
de referencias ATCC:
1.Salmonella enteritidis 2.Shigella flexneri 3.Salmonella typhi
4.Klebsiella oxytoca 5.Escherichia coli 6.Enterococcus fecalis.
7.Providencia stuartii 8.Pseudomonas aeruginosa. 9.Proteus mirabilis
10.Control negativo de amplificación 11.Control positivo de amplificación.
Tabla 1.
Comparación de la técnica tradicional para el diagnóstico de Salmonella
spp versus la técnica de amplificación genómica.
COPROCULTIVO Total
Positivo Negativo
P Positivo 1 3 4 los casos positivos la técnica molecular mostró mayor número
C respecto a la técnica tradicional que presenta baja sensibilidad. La
R Negativo 0 204 204
Total 1 207 208
REFERENCIAS
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Figura 2.
Sensibilidad de la técnica de amplificación molecular desde concen-
traciones de 108 UFC hasta 1 UFC. 1-16 PM= Estándar 100bp; C (+)
Control positivo; C(-) Control negativo.
CONCLUSIONES
La técnica de PCR estandarizada a partir de muestras de heces
demostró alta sensibilidad y especificidad. La correlación con las
muestras procesadas por ambos métodos evidenció buena correla-
ción con los resultados negativos; en relación a las discordancias de
biología molecular permitirá al laboratorio de rutina disminuir el
costo de material, personal y tiempo dedicado al diagnóstico de
Salmonella disminuyendo el tiempo de respuesta. La caracterización
en forma precoz de Salmonella es de utilidad tanto en clínica como
en estudios de manipuladores de alimentos para implementar los
tratamientos y medidas preventivas en forma adecuada.
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Salmonella enteritidis. Rev Chil Infect 18 (2): 85-93.
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Gentry-Weeks C, Hutcheson HJ, Kim LM, Bolte D, Traub-Dargatz J, Morley P. et al.
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