Hibridación In Situ

Fluorescente
Características generales y
aplicaciones en Citogenética
Técnica molecular usada en la detección
de secuencias de ADN o ARN específicas,
mediante el uso de anticuerpos y
fluoróforos.

FISH
 Células Metafásicas

FISH
Células Interfásicas
En células metafásicas
En células metafásicas
En células metafásicas
En metafase
En células Interfásicas
Painting cromosómicon (M – FISH)
Inmunodetección Directa
Inmunodetección indirecta
 Una sonda es un fragmento monocatenario de
ADN, ARN o PNA’s (ácido nucleico péptido) unidos a
moléculas marcadoras.

 Se emplean para el reconocimiento específico de

un segmento determinado del ácido nucleico de
cadena sencilla, en un proceso de hibridación.

¿Qué es una sonda?

Fragmentos de ADN

- Fáciles de hacer.

- Desde oligonucleótidos a megabases.

- Mejor caracterizadas (cinética y propiedades).

- Gran disponibilidad.

Tipos de sondas
Fragmentos de ARN (ribosondas)

- No necesitan denaturación inicial.

- Hibridizan mejor que las sondas de ADN.

- Desde oligonucleótidos a varios kilobases.

- Son muy inestables.

Tipos de sondas
PNA’s
- Bases nitrogenadas unidas entre sí por enlaces
peptídicos.
- Hibridizan mas rápido que las sondas ADN.
- Hibridizan regiones envueltas en estructuras
secundarias.
- Poseen solubilidad baja y se producen de forma
sintética.

Tipos de sondas
NICK – TRANSLATION

RANDOM PRIMER EXTENSION

OLIGONOCLEOTIDES PROBES

Tipos de marcaje de sondas

Longitud del fragmento
marcado: 200 – 500 d NTP

Marcaje de SONDAS “Nick translation”

 Longitud del fragmento
marcado: 200 – 2000 d NTP

Marcaje de SONDAS “Random primer extension”

 (TdT)

Marcaje de SONDAS “Marcaje de oligonucleótidos”

Radiactivas (32P, 35S)

De afinidad (Biotina, Digoxigenina)

Enzimáticas (Fosfatasas, Peroxidasas)

Quimioluminiscentes (ésteres de acridina)

Moléculas marcadoras
Elaboración de una sonda
 Menor 16 bases Mayor
especificidad especificidad

500 bases = límite máximo

Longitud de una sonda

Moléculas
Marcadoras
(Digoxigenina,
Bioina)

Sonda

FISH
Realización de FISH
Moléculas que pueden
emitir luz visible de
longitudes de onda de
diferente naturaleza.

Fluorocromos
Fluorocromos
 Proteína que por oxidación y ciclación, sufre un cambio
conformacional permitiéndole emitir fluorescencia.
El lugar específico corresponde al tripéptido Ser – Tir – Gli.

Green Fluorescente Protein

- Concentración del ácido nucleico.
- Complementariedad sonda-ácido nucleico.
- Concentración de la sonda.
- Longitud de la sonda
- Actividad específica de la molécula marcadora.
-Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica,
temperatura de hibridación)

¿Qué factores afectan a la sensibilidad y

especificidad de la reacción de hibridación?
FISH

Translocación 9;22. Cromosoma Filadelfia en la leucemia mieloide crónica

Translocación 4;8 Telómeros

46,XX,der(1) t(1:12) (q43;p13.3)
Cromosoma 1 derivado con material extra
47,XY, +psu idic(15) (q11)
Cromosoma 15 isodicéntrico adicional
FISH de regiones centroméricas
(sondas alfoides)
  Autosómica dominante
 No hay secreción de
GnRH del hipotálamo
 Síntomas:
- Paladar hendido y labio leporino
Ausencia de pubertad
- Deficiencia olfatoria (hiposmia o
anosmia)
- Cuarto metacarpio corto
- Daltonismo
- Ocasionalmente se ven anomalías
cardíacas y

convulsiones cereberales.

Síndrome de Kallman
 denaturación
ADN + Sonda + Digoxigenina Incubación en:

-Anti-digoxigenina

-Anti-fluoresceína
peroxidasa

CISH (Hibridación In Situ Cromogénica)