สารบัญ

หน้ า

กิตติกรรมประกาศ ก
บทคัดย่อภาษาไทย ข
บทคัดย่อภาษาอังกฤษ ค
สารบัญ ง
สารบัญภาพ ฉ
บทที่ 1 บทนำและวัตถุประสงค์ 1
1.1. ความสำคัญและที่มาของปั ญหา 1
1.2. วัตถุประสงค์ของการวิจยั 5
1.3. ผลที่คาดว่าจะได้ รับ 5
บทที่ 2 ทบทวนเอกสาร 6
2.1 หนอนตายหยาก (Stemona collinsae Craibr) 6
2.2 โพลีคไี ทด์ ซินเทส ที่พบในธรรมชาติ 10
2.3 RT-PCR (Reverse transcription-PCR) 11
2.4 Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) 12
2.5 เอกสารและงานวิจยั ที่เกี่ยวข้ อง 13
บทที่ 3 อุปกรณ์และวิธีการวิจยั 15
3.1. อุปกรณ์และเครื่ องมือ 15
3.2. สารเคมีที่ใช้ ในการทดลอง 16
3.3. วิธีการวิจยั 19
บทที่ 4 ผลการทดลองและวิจารณ์ผลการทดลอง 29
4.1 การโคลนและศึกษาคุณลักษณะของยีนโพลีคีไทด์ ซินเทส 29
4.2 การโคลนยีน PKS บริเวณกลางยีนโดยวิธี Polymerase Chain Reaction (PCR) 32
4.3 การโคลนยีน PKS บริเวณปลาย 3’ โดยวิธี RACE (Rapid amplification of cDNA end) 37
4.4 การโคลนยีน PKS บริเวณปลาย 5’ โดยวิธี RACE (Rapid amplification of cDNA end) 40
4.5 การวิเคราะห์ ยีนโพลีคไี ทด์ ซินเทส ที่โคลนได้ จากหนอนตายหยาก 43
บทที่ 5 สรุปผลและวิจารณ์สรุปผล 50
เอกสารอ้ างอิง 52

ภาคผนวก 55

สารบัญภาพ
หน้ า

ภาพที่ 1 วัฏจักรไกลโคลิซิส (Glycolysis Cycle) ในการผลิตเมแทบอไลต์ปฐมภูมิ 2

ภาพที่ 2 ตัวอย่างสารประกอบจำพวก อะโรมาติก (Aromatics) 3
ภาพที่ 3 ตัวอย่างสารประกอบจำพวก แมคโครี ด (macrolides) 3
ภาพที่ 4 ตัวอย่างสารประกอบจำพวก โพลีอีเธอร์ (polyethers) 4
ภาพที่ 5 ตัวอย่างสารประกอบจำพวก โพลีอีนน์ (polyenes) 4
ภาพที่ 6 ลักษณะทางพฤกษศาสตร์ของต้นหนอนตายหยาก 7
ภาพที่ 7 กระบวนการ Reverse transcription-PCR (RT-PCR) 11
ภาพที่ 8 ภาพแสดงกระบวนการสังเคราะห์ 5’ RACE 13
ภาพที่ 9 การเปรี ยบเทียบลำดับกรดอะมิโนของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส จากพืชจำนวน 5 ชนิด 20
ภาพที่ 10 การเปรี ยบเทียบลำดับกรดอะมิโนของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส จากพืชจำนวน 5 ชนิด
และแสดงบริ เวณอนุรักษ์ที่ใช้ออกแบบไพรเมอร์ 30
ภาพที่ 11 การเปรี ยบเทียบลำดับกรดอะมิโนของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส จากพืชจำนวน 5 ชนิด
และแสดงบริ เวณอนุรักษ์ที่ใช้ออกแบบไพรเมอร์ 31
ภาพที่ 12 การวิเคราะห์ PCR product ใน 0.8% agarose gel electrophoresis โดยใช้ DNA marker
ขนาด 1Kb (13 bands, 250-10000 bp) ซึ่ งพบแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดประมาณ 600 bp 32
ภาพที่ 13 การวิเคราะห์พลาสมิดใน 0.8% agarose gel electrophoresis โดยใช้ DNA marker
ขนาด 1Kb (13 bands, 250-10000 bp) ซึ่ งพลาสมิดที่ได้มีขนาดประมาณ 3000 bp 33
ภาพที่ 14 แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์และลำดับกรดอะมิโนที่คาดว่าจะเป็ นบริ เวณกลางยีน
ของยีนโพลีคีไทด์ ซินเทส ในหนอนตายหยาก ที่ได้จากวิธี RT-PCR 34
ภาพที่ 15 แสดงผลการนำลำดับนิวคลีโอไทด์ที่คาดว่าจะเป็ นบริ เวณกลางยีนของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส
ที่ได้จาก วิธี RT-PCR 35
ภาพที่ 16 แสดงผลการนำลำดับกรดอะมิโนที่คาดว่าจะเป็ นบริ เวณกลางยีนของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส
ที่ได้จากวิธี RT-PCR 36

ภาพที่ 17 แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์และลำดับกรดอะมิโนที่คาดว่าจะเป็ นบริ เวณกลางยีนของยีน

โพลีคีไทด์ ซินเทส ในหนอนตายหยาก ที่ได้จากวิธี RT-PCR และแสดงบริ เวณอนุรักษ์
ที่ใช้ออกแบบไพรเมอร์ 37
ภาพที่ 18 แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์และลำดับกรดอะมิโนบริ เวณปลาย 3’ ของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส
ในหนอนตายหยาก ที่ได้จากวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์ AP และไพรเมอร์ 3’PKSR ได้ชิ้นยีน
ที่มีขนาด 666 bp สามารถถอดรหัสให้กรดอะมิโน 222 ตัว 39
ภาพที่ 19 แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์และลำดับกรดอะมิโนที่คาดว่าจะเป็ นบริ เวณกลางยีนของยีน
โพลีคีไทด์ ซินเทส ในหนอนตายหยาก ที่ได้จากวิธี RT-PCR และแสดงบริ เวณอนุรักษ์ที่ใช้
ออกแบบไพรเมอร์ 40
ภาพที่ 20 การวิเคราะห์ PCR product ใน 0.8% agarose gel electrophoresis โดยใช้ DNA marker
ขนาด 1Kb (13 bands, 250-10000 bp) ซึ่ งพบแถบดีเอ็นเอที่มีขนาดประมาณ 900 bp 41
ภาพที่ 21 แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์และลำดับกรดอะมิโนบริ เวณปลาย 5’ ของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส
ในหนอนตายหยาก ที่ได้จากวิธี PCR ได้ชิ้นยีนที่มีขนาด 774 bp สามารถถอดรหัสให้
กรดอะมิโน 258 ตัว 43
ภาพที่ 22 แสดงการหาบริ เวณ Coding sequence ที่สมบูรณ์ของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส 43
ภาพที่ 23 แสดงลำดับนิวคลีโอไทด์และลำดับกรดอะมิโน ของยีนโพลีคีไทด์ ซิ นเทส ในหนอนตายหยาก
ที่ได้จากวิธี PCR ได้ชิ้นยีนที่มีขนาด 1185 bp สามารถถอดรหัสให้กรดอะมิโน 393 ตัว 45
ภาพที่ 24 แสดงผลการเปรี ยบเทียบความเหมือนของลำดับกรดอะมิโนของยีน PKS กับลำดับ
กรดอะมิโนอื่นๆ ในฐานข้อมูลจาก www.ncbi.nlm.nih.gov 46
ภาพที่ 25 แสดงผลการเปรี ยบเทียบความเหมือนของลำดับกรดอะมิโนของยีน PKS กับลำดับ
กรดอะมิโนอื่นๆ ในฐานข้อมูลจาก www.ncbi.nlm.nih.gov 47
ภาพที่ 26 แสดงการเปรี ยบเทียบลำดับกรดอะมิโนส่ วน coding region จำนวน 393 กรดอะมิโน
ของ PKS gene จากหนอนตายหยาก Stemona collinsae กับพืช 5 โดยใช้โปรแกรม
Clustalw2 49
ภาพที่ 27 แสดง phylogenetic tree ที่ได้จากการนำลำดับกรดอะมิโนส่ วน coding region ของ
PKS gene ที่โคลนได้จากหนอนตายหยาก Stemona collinsae เปรี ยบเทียบกับพืช 5 ชนิด 49