Universidade Federal da Bahia

Escola de Madicina Veterinária

Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos

A NEUROTOXICIDADE DE ALCALÓIDES EXTRAÍDOS DE

FOLHAS DE PROSOPIS JULIFLORA SWARTZ. D.C. EM
CULTURA PRIMÁRIA DE NEURÔNIOS E
NEURÔNIOS/CÉLULAS GLIAIS.

VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA

Salvador - Bahia
2008
 ii

VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA

A NEUROTOXICIDADE DE ALCALÓIDES EXTRAÍDOS DE FOLHAS DE

PROSOPIS JULIFLORA SWARTZ. D.C. EM CULTURA PRIMÁRIA DE NEURÔNIOS

E NEURÔNIOS/CÉLULAS GLIAIS.

Dissertação apresentada à Escola de

Medicina Veterinária, da Universidade
Federal da Bahia, como requisito para
obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal nos Trópicos, na área
de Saúde Animal.

Orientadora: Profª. Dra. Silvia Lima Costa

Co-orientador: Profº. Dr. Ramon dos Santos El-Bachá

Salvador-Bahia
2008
 iii

A NEUROTOXICIDADE DE ALCALÓIDES EXTRAÍDOS DE FOLHAS DE

PROSOPIS JULIFLORA SWARTZ. D.C. EM CULTURA PRIMÁRIA DE NEURÔNIOS
E NEURÔNIOS/CÉLULAS GLIAIS

VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA

Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária

Tropical.

Salvador, 15 de agosto de 2008.

Comissão examinadora:

____________________________________________

Prof. Dr. Ramon dos Santos El-Bachá ICS – UFBA

____________________________________________

Prof. Dr. Eduardo Luiz Trindade Moreira

____________________________________________

Prof. Dr. Eudes da Silva Velozo

 iv

Ao Laboratório de Neuroquímica, que

me inseriu e me guia na pesquisa
científica.
 v

AGRADECIMENTOS

Ao hemisfério cerebral esquerdo: Profª Drª Silvia Lima Costa. Por ter aberto as portas do
LabNq no momento que em 2002 lhe fui solicitar um estágio, pela simples vontade de
conhecer a rotina de um laboratório. Pela confiança e dedicação durante as bolsas de PIBIC.
Pela coragem de me orientar na monografia de conclusão de curso sobre condenações post-
mortem em matadouro de aves. Pelo convite para o Mestrado em Ciência Animal nos
Trópicos. Por ser uma referência para minha vida, como profissional, professora e pessoa.

Ao hemisfério cerebral direito: Prof. Dr. Ramon El-Bachá. Pelos socorros na hora do
desespero. Pelas sábias, sempre sábias palavras. Por ser o amado mestre.

Ao cerebelo: Profª. Ana Rita. Pelo equilíbrio que sempre nos passa. Pela boa vontade em
ensinar desde as funções básicas, como pipetar, até as funções complexas, como iniciar a
escrever a dissertação de mestrado. Pela didática que faz com que os ensinamentos sejam
absorvidos e nunca mais esquecidos.

À medula espinhal e barreira hematoencefálica: Profª Drª Maria de Fátima Dias Costa. Por
permitir ao longo desta trajetória, a entrada de substâncias essenciais para o desenvolvimento
e manutenção. Facilitar a difusão das informações geradas no sistema nervoso central para
outros órgãos. Por filtrar, trazendo sempre informações de caráter relevantes para o
crescimento profissional da equipe.

Aos astrócitos: Dalva (mãe), Nilo (pai), Daniela (irmã), Dulce (Tia), Keu (irmã), Igor
(amigo), Bruno (amigo), Fernanda (amiga) que fomentaram meu mestrado e dissertação, por
simplesmente me amarem. Sem eles não seria possível.

Às microgliais: Ilana (colega), Raquel (colega), Eliete (colega), Drª Ivani(colega) e Sr

Celso(chefe), por reagirem pela proteção à vida nos momentos de ataque.

Aos neuritos: Prof. Dr Alexandre, Prof Juliana Hughes, Prof Rafael Barreto, Prfa Érica,
Breno, Rute, Socorro, Sr Carlos, Débora, enfim a toda equipe do LabNq, pela troca de
informações,que garante o alto nível de conhecimento dentro daquela estrutura.

Também, aos alcalóides neurotóxicos: Aqueles que em doses subtóxicas me fizeram reagir
pelo sofrimento, e me tornar melhor do que era antes de conhecê-los.

A Deus, pelo perfeito funcionamento do sistema nervoso central.

 vi

“Se podes olhar, vê. Se podes ver, repara”.

(José Saramago)
 vii

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS..........................................................................................................ix

LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................xi

RESUMO.............................................................................................................................xii

SUMMARY...........................................................................................................................xiii

1.INTRODUÇÃO.................................................................................................................01

2.REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................03

2.1 Prosopis juliflora Swartz D.C.................................................................................03

2.1.1 A Prosopis juliflora SW DC: um recurso florestal valioso......................................05

2.1.2 A Prosopis juliflora: uma planta daninha................................................................07

2.1.2.1 Os alcalóides, principais componentes ativos da P. juliflora..................................08

2.2 Aspectos estruturais e funcionais dos principais componentes celulares do SNC ...12

2.2.1 Neurônio..................................................................................................................12

2.2.2 Macroglia................................................................................................................13

2.2.3 Microglia ................................................................................................................16

2.2.4 Relação entre neurônio e células gliais...................................................................17

2.3 A neurotoxicidade induzida por Prosopis juliflora................................................18

3 OBJETIVOS...........................................................................................................21

4. ARTIGO CIENTÍFICO..........................................................................................22

Efeito de alcalóides extraídos de folhas da Prosopis juliflora Swartz. D.C na

ativação de células gliais e sobrevida de células neuronais...................................22

RESUMO...............................................................................................................22

SUMMARY... .........................................................................................................23
 viii

4.1 INTRODUÇÃO.....................................................................................................24

4.2 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................25

4.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................31

4.4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................45

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS...............................................................................48

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................50

7. ANEXOS................................................................................................................61
 ix

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Foto da P. juliflora Sw. DC.........................................................................04

Figura 2 – Principais alcalóides piperidínicos isolados da P. juliflora. Em A,

juliprosopina. Em B, juliprosina. Estruturas químicas caracterizadas por um anel
indolizidínico e duas cadeias alifáticas que culminam com um anel piperidínico..... 11

Figura 3. Em A, neurônios com os núcleos corados pelo agente intercalante de DNA

Hoechst 33258 (Azul) e expressando β-III-tubulina (verde) através de
imunocitoquímica. Fonte: http://www.ehponline.org/members/2005/7793/fig2.jpg.
Em B, astrócitos reativos, com alta expressão de GFAP em imunocitoquímica
realizada após 24h de exposição a 3µg/mL de extrato bruto contendo acalóides de
folhas da P. juliflora, em estudo realizado por Silva et al (2007).............................. 15

Figura 4 – Análise do efeito de ETA e frações de alcalóides de folhas da P. juliflora

sobre a integridade da membrana plasmática de neurônios, após 24h de tratamento,
expressa em percentual de células impermeáveis ao Azul de Tripan, em relação ao
número total de células/campo. Em A, efeito de ETA; em B, efeito da F29/30; em C,
efeito da F31/33; em D, efeito da F32; em E, efeito da F34/35. A concentração 0
µg/mL representa a exposição das células ao veículo, na condição controle (DMSO
0,1%). * P < 0,05, em relação ao controle……...........................................................32

Figura 5 - Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e

em co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com ETA (1 – 3,4 µg/mL),
durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do
controle (células tratadas com veículo, DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao
controle........................................................................................................................33

Figura 6 – Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e

em co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F29/30 (3,4 – 11,5
g/mL), durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da
absorbância do controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05, em
relação ao controle.......................................................................................................34

Figura 7 – Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e

em co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F31/33 (1 – 3,4µg/mL),
durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do
controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao
controle........................................................................................................................34
 x

Figura 8 – Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e

em co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F32 (0,3 – 1µg/mL),
durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do
controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao
controle........................................................................................................................35

Figura 9 – Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e

em co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F34/35 (11,5 – 38,9
µg/mL), durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da
absorbância do controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%).........................35

Figura 10 – Teste de citotoxicidade (MTT) em cultura de neurônio após 24 h de

tratamento com 3 µg/mL de ETA e 1,5µg/mL F32 em meio de cultura fresco (sem
passagem em cultura de astrócitos) e com meio derivado de culturas de astrócitos
tratadas com os alcalóides nas mesmas concentrações (meio condicionado). Os
resultados são expressos em porcentagem da absorbância do controle (células em
veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05 comparado o tratamento com meio fresco e
tratamento com meio condicionado, para mesmo tratamento.....................................37

Figura 11 – Dosagem de óxido nítrico em co-cultura em condições controle (veículo

DMSO 0,01%) ou expostas ao ETA e F32 (1,5 e 3 μg/mL), durante um período de 24
h. Resultados expressos em concentração de nitrato de sódio do meio de cultura. * P
< 0,05 comparado o grupo tratado com o grupo controle (DMSO 0,01%).................38

Figura 12 – Fotomicrografia óptica de co-culturas coradas por método estabelecido

por Rosenfeld (1967). Em A, condições controle (veículo DMSO 0,01%). Em B,
expostas a 1,5 µg/mL de ETA. Em C, expostas a 3 µg/mL de ETA. Em D, expostas a
1,5 µg/mL de F32. Em E, expostas a 3 µg/mL, durante um período de 24 h. Seta
indica núcleo de neurônios. Estrelas indicam vacúolos citoplasmáticos. Obj. X
20..................................................................................................................................40

Figura 13 – Fotomicrografia em fluorescência de co-culturas em condições controle

(meio de cultura) marcadas por imunocitoquímica para GFAP, em A. E
imunocitoquímica para β-III-tubulina, em B. A seta indica neurônio expressando a β-
III-tubulina. Obj. X 20............................ ..............................................................41

Figura 14 – Fotomicrografia em fluorescência de co-culturas em condições controle

(DMSO 0,01%) e após 24 h de tratamento com ETA ou F32 (1,5 e 3µg/mL) marcadas
por imunocitoquímica para GFAP (A, B, C, D, E) ou para β-III-tubulina (A’, B’, C’,
D’, E’). Em A e A’, co-culturas em condições controle (DMSO 0,01%). Em B e B’,
co-culturas tratadas com ETA 1,5 µg/mL. Em C e C’, co-culturas tratadas com ETA
3µg/mL. Em D e D’, co-culturas tratadas com 1,5µg/mL de F32. Em E e E’ co-
culturas tratadas com 3µg/mL de F32. As estrelas indicam interrupçãoes na expressão
da β-III-tubulina. Obj. X 20……….............................................................................43
 xi

LISTA DE ABREVIATURAS

DMEM – Meio de Eagle modificado por Dulbecco.

DMSO – Dimetilsulfóxido

EC50– Efeito Citotóxico cinqüenta

EDTA - Ácido etileno diamino tetracético

ETA - Extrato Bruto contendo alcalóides de folhas da P. juliflora

F29/30 - União da vigésima nona e trigésima fração alcaloidal, oriundas do ETA

F31/33 - União da trigésima primeira e trigésima terceira fração alcaloidal, oriunda do ETA

F32 - Trigésima segunda fração alcaloidal, oriunda do ETA

F34/35 - União da trigésima quarta e trigésima quinta fração alcaloidal, oriunda do ETA

GFAP – Proteína ácida fibrilar glial

MHC –Complexo de Histocompatibilidade Maior

MTT - Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio

NGF – Fator de crescimento neuronal

NO - Óxido Nitrico

PBS – Tampão fosfato salino

SNC – Sistema Nervoso Central

 xii

SILVA,VDA. A neurotoxicidade de alcalóides extraídos de folhas de Prosopis juliflora

Swartz. D.C. em cultura primária de neurônios e neurônios/células gliais. Salvador, Bahia
2008. 46p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina
Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2008.

RESUMO

A Prosopis juliflora é uma árvore, que foi introduzida no nordeste do Brasil nos anos 40.
Devido a sua alta palatabilidade e valor nutricional, os seus frutos ou farelos são amplamente
usados na alimentação animal com bons resultados nutricionais e econômicos. Entretanto, esta
planta causa doença quando é o único alimento para os animais, especialmente quando é
oferecida durante seca extrema. Além disso, a intoxicação com a P. juliflora vem sendo descrita
nos EUA, Peru e no Brasil desde 1981. Esta doença é caracterizada por alterações como edema,
atrofia muscular do masseter e no SNC, alterações espongiformes e gliose. E, tem sido sugerido
que os sinais clínicos oriundos da ingestão de frutos da P. juliflora em espécies susceptíveis é
causado por uma seletiva toxicidade de neurônios dos núcleos dos nervos craniais. Estudos
prévios demonstram que alcalóides dos frutos da P. juliflora demonstram efeitos citotóxicos em
células gliais com redução da atividade mitocondrial em concentração de 30µg/mL, durante
24horas de exposição das células. O extrato bruto (ETA) e algumas frações de alcalóides
(F29/30, F31/33, F32, F34/35) de folhas da P. juliflora foram citotóxicos e induziram ativação
em cultura primária de astrócitos e microglia, com aumento da produção de NO, após 24 horas
de exposição. Neste estudo, investigou-se a citotoxicidade do ETA e frações de alcalóides em
neurônios corticais e o impacto da resposta glial. ETA e frações em concentrações de 0.3-
40µg/mL foram testadas por 24 horas em cultura primária de neurônios e co-cultura de
neurônio/células gliais. O MTT revelou que ETA, F29/30, F31/33, F32 foram citotóxicos para
neurônios corticais, entretanto a fração F34/35 não foi citotóxica até 40µg/mL. Contudo ETA e
todas as frações testadas não foram citotóxicas para co-cultura de neurônio/células gliais em
todas as concentrações adotadas. Este resultado foi confirmado usando um método de co-
cultura sem contato para tratamento com 3µg/mL de ETA. Entretanto, o ETA e F32 em co-
cultura foram capazes de induzir vacuolização em neurônio e células gliais. Através da
imunocitoquímica para β-III-tubulina foi revelado uma redução na expressão desta proteína em
neurônios expostos a 3µg/mL de F32. Por outro lado, coloração de Rosenfeld e
imunocitoquímica para GFAP revelaram alterações na morfologia dos astrócitos, que sugerem
uma regulação positiva da expressão desta proteína em co-culturas expostas ao alcalóide. Além
disso, a incubação das células com 3 µg/mL de F32 induziu o acúmulo de nitrito no meio,
indicando uma indução da produção de óxido nítrico em co-cultura. Juntos, esses resultados
mostram que ETA e frações agem diretamente em neurônios induzindo citotoxicidade e isso
pode causar os danos neuronais observados em animais intoxicados. Ademais, esses resultados
também sugerem que a neurotoxicidade de alcalóides da P. juliflora é atenuada pela presença e
resposta de células gliais a essas toxinas vegetais.

Palavras-chave: Prosopis juliflora; co-cultura; neurônio; células gliais; citotoxicidade

 xiii

SILVA,VDA. The neurotoxicity of alkaloids extracted from Prosopis juliflora Swartz.

D.C. leaves on neuron and neuron/glial cell primary cultures. Salvador, Bahia, 2008. 46p.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) – Escola de Medicina Veterinária,
Universidade Federal da Bahia, 2008.

SUMMARY

The Prosopis juliflora is a shrub, which was introduced in the northeast Brazil in the 1940’s.
Due to their palatability and nutritional value, the pods of P. juliflora or its bran are largely
used for animal feed with good nutritional and economic results. However, this plant causes
disease when it is the sole sustenance for the animal, especially when it is offered during
extreme drought conditions. Moreover, intoxication with P. juliflora has been reported in
USA, Peru, and Brazil. In the latter, the illness called “cara torta” has been demonstrated
periodically since 1981. The disease is characterized by neuro-muscular alterations like
emaciation, muscular atrophy of the masseter, spongiosis and gliosis. It has been suggested
that the clinical signs, from feeding P. juliflora pods in this more susceptible specie, were
caused by a selective toxicity to neurons of some cranial nerve nuclei. In a previous study it
was demonstrated that alkaloids from P. juliflora pods had cytotoxic effects on glial cells. The
mitochondrial activity, assayed by MTT test, showed cytotoxicity at 30 µg/mL of the
alkaloidal extract from P. juliflora pods after exposition of glial cells for 24 h . Furthermore,
an extract (TAE) and some alkaloidal fractions (F29/30, F31/33, F32, F34/35) from Prosopis
juliflora leaves were cytotoxic and induced activation of astrocytes and microglia in primary
cultures, inducing NO production after 24 h of glial cell exposition. In this study, the
cytotoxicity of the TAE and the alkaloidal fractions (AFs) on cortical neurons and the impact
of glial cells response were investigated. TAE and AFs at concentrations ranging between 0.3-
40µg/mL were tested for 24 h on neuron primary cultures and on neurons/glial cell primary
co-cultures. The MTT test revealed that TAE, F29/30, F31/33, F32 were cytotoxic to cortical
neurons. The fraction F34/35 was not cytotoxic until 40µg/mL. However, TAE and all AFs
tested were not cytotoxic to neuron/glial cell primary co-cultures at all concentrations
adopted. This result was confirmed using a non-contact co-culture method exposed to 3µg/mL
TAE. However, the TAE and F32 induced vacuolation on neuron and glial cells. The
immunocytochemistry for β-III-tubulin on co-cultures revealed a reduction of β-III-tubulin
expression on neurons exposed to 3µg/mL F32. On the other hand, Rosenfeld staining and
western blotting for GFAP revealed alterations on astrocyte morphology related to up
regulation of GFAP expression on co-cultures. Moreover, incubation of cell with 3 µg/mL
F32 induced accumulation of nitrite in co-culture medium indicating induction of NO
production. Taken together, these results show that the TAE and the AFs act directly on
neurons inducing citototoxicity and it may be related to neuronal damages observed on
intoxicated animals. Furthermore, these results also suggest that the neurotoxicity of alkaloids
from P. juliflora is attenuated by the presence and response of glial cells to these vegetal
toxins.

Keywords: Prosopis juliflora; co-culture; neuron; glial cells; cytotoxicity

 1

1 - INTRODUÇÃO GERAL

A Prosopis juliflora Sw. D.C., conhecida como Algaroba, pertencente à família leguminosae,
é uma planta presente nos países tropicais e subtropicais de climas áridos e semi-áridos (Silva,
1986). Esta planta foi introduzida no Nordeste do Brasil na década de 40 e vem sendo
cultivada na região semi-árida como forrageira arbórea e como espécie para reflorestamento.
Desde então a P. juliflora tem sido uma alternativa viável para solucionar os problemas
advindos da seca concernentes à nutrição animal, principalmente pela riqueza nutricional de
seus frutos (Lima, 1986). No entanto, o consumo de vagens de algaroba, como elemento
principal da ração animal provoca danos à saúde dos animais levando-os a um estado clínico-
patológico denominado de “cara-torta”. Essa patologia foi induzida experimentalmente e
caracterizada em bovinos, observando-se, entre outros, danos no sistema nervoso central
(SNC), caracterizados por congestão das meninges, áreas de hemorragia difusa e lesões
características de espongiose e gliose (Figueiredo et al., 1995). Mais tarde, caprinos e bovinos
intoxicados em condições experimentais semelhantes também apresentaram lesões no SNC
(Tabosa et al., 2000; Tabosa et al., 2006).

A neurotoxicidade é um dos eventos toxicológicos mais graves, pois danos gerados, até
mesmo a um pequeno número de neurônios, podem ter profundas conseqüências para o
desempenho global do organismo (Ushakova et al., 1995). Neste contexto, as células gliais,
que compõem a população de células mais abundante do SNC, desempenham uma importante
função no controle da ação de neurotoxinas endógenas e exógenas através da capacidade de
reagir a insultos celulares, por um fenômeno denominado gliose reativa (Mead & Pentreath,
1998; Raine, 1999).

Dentre as diversas substâncias que já foram extraídas, isoladas e purificadas de diferentes

partes da algaroba, os alcalóides piperidínicos têm obtido destaque em diversos estudos
farmacológicos, nos quais os pesquisadores acreditam que tais compostos sejam os princípios
ativos causadores dos efeitos tóxicos provocados pela ingestão desta planta (Nakano et al.,
2004; Choudhary et al., 2005; Michael, 2002). Estudos recentes demonstraram que alcalóides
extraídos de folhas e frutos da P. juliflora agem diretamente em células gliais em cultivo,
induzindo ativação e citotoxicidade, acompanhados do aumento da produção de óxido nítrico
(Hughes et al., 2005; 2006; Silva et al., 2007). No entanto sabe-se que na presença de
 2

neurônios, as células gliais apresentam uma inibição na liberação de fatores inflamatórios e

tornam-se capazes de modular respostas a insultos, mesmo quando ativadas, o que pode
reduzir o nível de sua resposta a agentes xenobióticos (Chang et al., 2000).

Desta forma, neste estudo, após uma abordagem das propriedades biológicas e toxicológicas
da P. juliflora e seus componentes farmacologicamente ativos já descritos, bem como das
principais propriedades funcionais e estruturais das células gliais e neuronais no SNC,
buscamos contribuir para a elucidação dos impactos neurológicos observados em animais
intoxicados por esta planta, através de um estudo in vitro sobre o efeito citotóxico de seus
compostos alcalóides em um sistema complexo de células gliais e neuronais.
 3

2 - REVISÃO DE LITERATURA

2.1 - Prosopis juliflora Swartz D.C.

Plantas do gênero Prosopis, família Fabaceae (leguminosae) e subfamília Mimosodae

(Garibaldi, 2008; Torres, 1991) são árvores perenes, com extraordinária resistência às
adversidades de regiões áridas e semi-áridas (Choge & Pasiecznik, 2008). Apresentam rápido
crescimento, em geral são arbustos espinhosos e têm raízes profundas (Garibaldi, 2008). Seu
caule é considerado de alto potencial para o fornecimento de lenha e carvão, e seu fruto
apresenta importância para a alimentação tanto do homem como para a dos animais (Passos &
Ferreira, 1991).

Segundo Torres (1991) existem no nordeste brasileiro seis espécies de plantas do gênero
algaroba, são elas: P. juliflora (Figura 1); P. Palida, P. glandulosa, P. chillensis, P. alba e P.
velutina. Existem também relatos da existência da P. affinis, que descrita pela primeira vez
em 1991, teve como hipótese de seu aparecimento a introdução acidental junto a sementes de
P. juliflora, em 1942 (Lima & Silva, 1991).

A P. juliflora Sw DC. (algaroba) também é conhecida como algarobeira, algarobo e mesquita,

não é uma planta nativa do Brasil, e sim originária dos Andes no Peru. Está presente nas
regiões do semi-árido e nos subtrópicos, nas Américas do Norte, Central e do Sul, Ásia e
África e, embora sua origem seja inexata, acredita-se que seja proveniente da América do Sul
e que se expandiu ao México e aos Estados Unidos (EUA). No entanto, esta planta também
cresce abundantemente em Sind e Punjab, províncias do Paquistão (Silva, 1986; El-
Merzabani et al., 1979). No Brasil, foi introduzida pelo estado de Pernambuco e do Rio
Grande do Norte, em 1942 e 1948 respectivamente, com sementes oriundas do Peru e Sudão
(SPA, 1989). No entanto, devido a sua excelente adaptação às regiões áridas e semi-áridas,
hoje é encontrada em todos os estados do nordeste brasileiro.
 4

Figura 1. Foto da P. juliflora Sw. DC. Fonte: http://www.flickr.com/photos/kyllercg/38

7295431/in/set-72157594242184514/.
 5

A introdução da P. juliflora no Brasil tem sido objeto de polêmicas, pois opositores

argumentam tratar-se de uma espécie invasora, enquanto defensores a consideram um recurso
florestal valioso, e alternativa de aproveitamento de solo pobre encontrado em regiões semi-
áridas brasileiras (Figueredo, 2008).

2.1.1 A Prosopis juliflora SW DC: um recurso florestal valioso.

O Nordeste Brasileiro apresenta cerca de 56% de sua superfície coberta com uma vegetação
denominada caatinga, que se caracteriza por uma baixa produtividade e pequena diversidade
de espécies em relação à floresta tropical úmida. Nessa região os solos são rasos e de baixa
fertilidade, por apresentarem características físico-químicas desfavoráveis ao plantio
resultantes dos tipos climático árido e semi-árido, com um período seco de aproximadamente
nove meses e precipitações anuais de 250 a 1000 mm (Santos & Tertuliano, 1998). Neste
contexto a algaroba passou a servir como recurso alternativo para esta região pela sua
resistência a estas adversidades (Pires & Kageyama, 1985).

Pouco exigente em água, cuja ocorrência, em sua forma natural, se dá em zonas tropicais
áridas, a espécie tem capacidade de crescer em áreas muito quentes, suportando temperatura
ambiente de 48 °C e precipitação anual entre 150 e 750 mm. Além disso, apresenta
capacidade de medrar em solos de baixa fertilidade e de condições físico-químicas
imprestáveis a outras culturas (Santos & Tertuliano, 1998; Silva, 2008; Garibaldi, 2008).
Outro fator que tornou a algaroba extremamente importante para o nordeste brasileiro foi o
seu potencial em produzir vagens com alta palatabilidade e valor nutricional, que fizeram
desta, uma fonte geradora de alimentos para o homem e para os animais desta região (Silva,
2008; Silva, 1981). Além das vagens, as folhas também são usadas na alimentação animal.
Juntas geram uma capacidade produtiva de ração de 20 a 40 toneladas por hectare por ano
(Garibaldi, 2008).

Hoje se sabe que 100g de vagens, proporciona 333 calorias, 13g de água, 16g de proteínas,
3,2g de gorduras, 65,8g de hidratos de carbono, 108g de fibra bruta, 3,3g de cinzas, 450mg de
cálcio, 627mg de fósforo e 6,6mg de ferro, além de 0,33mg de vitaminas B1 e 2,6mg de
 6

vitamina B6. Os altos níveis de carboidratos fazem com que as vagens apresentem sabor
adocicado e também, torna possível a produção de álcool etílico a partir delas (Silva et al.,
2003). Os níveis de macronutrientes em folhas novas e folhas velhas na presença de todos os
nutrientes são: N 2,59-1,90%; P 0,23-0,14%; K 1,93-2,04%; Ca 0,45-0,64%; Mg 0,49-0,63%;
S 0,20-0,21% (Haag et al., 1986).

As vagens da algaroba são sugeridas como fonte de proteína para a formulação de ração usada
na psicultura (Bastos & Façanha, 1985). E como substituto do milho desintegrado com palha
e sabugo em dietas para eqüinos em mantença (Stein et al., 2005). Entretanto, quando usadas
na composição de ração para ovinos contribuem para baixa conversão alimentar, que segundo
Moreno et al. (2005), seria promovida pelo alto teor de tanino presente neste fruto. Araújo et
al. (2002) demonstram que uma possível alteração na estrutura de globulinas dessas vagens,
com o processo de cozimento aumenta a digestibilidade das mesmas pela tripsina, entretanto,
ainda assim considera os índices de digestibilidade baixos em análise comparativa com os
resultados obtidos com a Vigna unguiculata (Cowpea), outra leguminosa usada na região
nordeste como alternativa para alimentação animal.

Ainda hoje, o melhor aproveitamento do potencial nutricional desta planta tem sido objeto de
diversos estudos, que visam principalmente a sua utilização como matéria-prima industrial
para a fabricação de alimentos. A parede dos frutos da algarobeira com alto teor de sacarose,
se transformadas em farinha, pode ser utilizada na fabricação de bolos, pães, biscoitos,
geléias, mel, pudins, sopas e outros alimentos com alto teor nutritivo usados na alimentação
humana (Silva et al., 1997; Silva et al, 2001; Silva et al., 2003). Também, a espécie é uma
planta fixadora de nitrogênio no solo, portanto serve para recomposição de áreas degradadas
(Victor et al., 2007), e produz madeira de qualidade para fazer cercas e outras construções
rurais, além de gerar carvão de boa qualidade para usos industriais (Farias Sobrinho et al.,
2005; Embrapa, 2002; Reynol, 2008).

A importância medicinal da P. juliflora está nas evidências de efeitos farmacológicos

demonstrados com o uso de extratos de folhas e frutos de P. juliflora, tais como efeito
antibacteriano (Aqeel et al., 1989; Ahmad et al., 1986; Ahmad et al., 1995; Kanthasamy et al.,
1989; Cá-Ceres et al., 1995; Al-Shakh-Hamed & Al-Jammas, 1999; Satish et al., 1999),
antifúngico (Ahmad et al., 1989a; Kanthasamy et al., 1989; Kaushik et al., 2002),
antiinflamatório (Ahmad et al., 1989b), estimuladora do sistema imune (Ahmad et al., 1992) e
 7

inibidor da acetil-colinesterase (Choudhary et al., 2005). Estas propriedades têm sido

atribuídas aos alcalóides piperidínicos (Ahmad et al., 1992; Ahmad et al., 1995; Batatinha,
1997) existentes em diversas partes desta planta.

2.1.2 A Prosopis juliflora: uma planta daninha.

Por outro lado, se mal manejada, a algaroba, por ser "extremamente agressiva", capaz de
"invadir" habitats naturais e inibir a regeneração de outras espécies, reduzindo a
biodiversidade vegetal (Vilar, 2006; Pegado et al., 2006; Andersson, 2008).

Em todo o mundo, várias espécies do gênero Prosopis se tornaram daninhas em áreas de

vegetação nativa, principalmente em regiões onde foram introduzidas como na Austrália,
Índia, Paquistão, África do Sul, Sudão e parte do Sahel. As espécies invasoras mais comuns
nos trópicos secos são Prosopis juliflora e P. pallida de forma que algumas regiões têm
criado medidas de controle ou mesmo erradicação destas espécies (Choge & Pasiecznik,
2008; Lima & Pasiecznik, 2008; Pasiecznik, 2008).

Na caatinga da região nordeste do Brasil, a introdução da algaroba com a intenção de

construir uma alternativa econômica resultou em um processo de expansão intensa desta
espécie que passou a ser caracterizada como invasão. Isto refletiu numa redução da
diversidade e a riqueza taxonômica de espécies, afetando também os parâmetros estruturais
das comunidades vegetais invadidas (Farias Sobrinho et al., 2005; Oliveira, 2006).
Possivelmente um dos mecanismos usados por esta planta para inibir o crescimento de outras
espécies é através dos alcalóides Juliprosina e Juliprosopina presentes em suas folhas,
caracterizados por Nakano et al. (2004) como inibidores de crescimento vegetal.

A P. julifora, devido a sua capacidade de adaptação a ambientes adversos, tem sido usada
para reverdecer áreas afetadas pela atividade extrativa de carvão mineral na Índia, no entanto
Singh (2007) considera o seu uso para este fim danoso ao ecossistema e sugere a sua
substituição por plantas nativas da região, apesar das mesmas apresentarem um menor
potencial de adaptação ao ambiente hostil.
 8

Apesar de não haver relatos de enfermidades humanas causadas pelo consumo de algaroba, e
tomando como base o extenso uso das vagens para este fim, pesquisadores avaliaram no
Quênia o potencial nutricional e a seguridade relativa à contaminação microbiológica e
presença de micotoxinas na farinha das vagens da algaroba. Concluíram que apesar de
apresentar propriedades nutricionais satisfatórias, a farinha apresentou altos índices de
aflatoxina e ocratoxina (Choge et al., 2007). Além disso, a algaroba tem causado doenças
respiratórias alérgicas por proteínas constituintes do seu pólen. Killian & McMichael (2004)
detectaram treze proteínas alergênicas ao homem no pólen da P. juliflora e Dhyani et al.
(2006) demonstraram que dentre as proteínas alergênicas do pólen existem algumas
específicas para a espécie, que podem ser usadas para diagnosticá-la como agente causador da
enfermidade. Essas proteínas têm gerado diversos casos de doenças respiratórias já descritas
no sudoeste dos Estados Unidos, México, Arábia Saudita, África do Sul, Kuwait, Emirados
Árabes e Índia (Al-Frayh et al., 1999; Killian & McMichael, 2002; Dhyani et al., 2006;
Dhyani et al., 2007).

Desde a década de 50, esta planta tem sido descrita como causadora de intoxicação em
animais nos EUA (Dollahite & Anthony, 1957), Peru (Baca et. al., 1967) e no Brasil
(Figueiredo et al., 1995). Mais tarde a doença em bovinos, provocada pela sua ingestão, veio a
ser chamada de doença da cara torta, caracterizada por edema, alterações neuromusculares,
incluindo atrofia do masseter e lesões histológicas como espongiose e gliose, pouca
substância de Nills, vacuolização de neurônio de núcleo de nervo cranial (Figueiredo et al,
1995).

2.1.2.1 Os alcalóides, principais componentes ativos da P. juliflora

Tabosa et al. (1998) sugerem que o efeito tóxico das vagens da algaroba possa estar
relacionado aos alcalóides piperidínicos. A partir das vagens, foi extraída uma mistura de
alcalóides, a qual foi testada intraperitonealmente em camundongos Swiss. A mistura total na
dosagem de 6,25 mg/kg e a juliprosopina, isolada por cromatografia, na dose de 25 mg/kg,
inoculadas por via intraperitoneal, mataram 100% e 80% dos camundongos, respectivamente.

Os alcalóides são aminas e reagem com os ácidos para dar sais solúveis. Os átomos de
nitrogênio da maior parte dos alcalóides estão em anéis heterocícliclos (Figura 2a). Em alguns
 9

casos, estes átomos de nitrogênio podem estar presentes como grupo amônio quaternário
(Figura 2b) (Solomos, 1996). Alcalóides da classe dos piperidínicos são considerados
complexos e, no caso dos alcalóides da P. juliflora, apresentam configuração semelhante: um
anel indolizidínico e duas cadeias alifáticas que culminam com um anel piperidínico (Figura
2a e 2b).

Cada anel piperidínico possui o grupo 2-metil-3-hidroxi (Daetwyler et al., 1981). Os

principais alcalóides piperidínicos já caracterizados em diferentes partes da P. juliflora são a
juliprosina, juliprosinina, juliprosopina (juliflorina), julifloridina, julifloricina, juliflorinina.
Ahmad & Mohammad (1979) tentaram elucidar a estrutura da juliflorina (C40H75N3O2),
encontrando este composto também na P. glandulosa. A juliprosopina (C40H75N3O2) (Ott-
Longoni et al., 1980) e a juliprosina (C40H72N3O2) (Daetwyler et al., 1981) foram isoladas das
folhas da P. juliflora, obtidas como uma resina incolor e um óleo, respectivamente. Ahmad et
al. (1985) e Aqeel et al. (1989) concluíram, através de dados espectrométricos, que a
juliflorina e a julifloricina são alcalóides isômeros. A comparação da estrutura proposta para a
juliprosopina, com base nos dados espectrométricos da juliflorina, revelou que os dois
alcalóides são idênticos (Ahmad et al., 1986). Em 1989, Ahmad et al. (1989b) determinaram
dois novos alcalóides, denominados juliprosinina (C40H70N3O2), um sal clorado obtido como
uma resina, e juliflorinina (C40H75N3O2), que possui a mesma configuração da juliflorina
(juliprosopina).

O potencial mutagênico da juliflorina foi avaliado num sistema teste Salmonella/microssomo,

sendo que não foram observados resultados significativos em comparação ao etil-metano
sulfonato (Khursheed et al., 1986). Entretanto, em outro estudo, alcalóides piperidínicos
isolados das flores e dos frutos verdes da Cassia spectabillis demonstraram ser capazes de
induzir danos ao DNA através de mutagênese (Viegas, 2004).

A atividade tóxica de alcalóides piperidínicos, isolados de frutos da P. juliflora, em culturas

celulares foi também estudada por Batatinha (1997). O extrato metanólico de vagens, a fração
alcaloidal, bem como dois alcalóides isolados (juliprosopina e juliprosina) foram testados
quanto a sua citotoxicidade em culturas de tumor epitelial humano (HeLa), tumor hepático
(HepG2) e duas linhagens de fibroblastos: uma cultura primária de fibroblasto epitelial
humano (F26) e uma linhagem de tumor sinovial (F57). Neste estudo foi verificado que todas
as amostras utilizadas apresentaram efeitos citotóxicos quando avaliadas após coloração com
 10

o corante de exclusão Azul de Tripan e que houve lesão de membrana em mais de 90% das
células tratadas por 3mg/mL do extrato metanólico, 3 a 300 µg/mL da fração alcaloidal ou 30
µg/mL juliprosina e juliprosopina.

Acredita-se que a atividade biológica dos alcalóides piperidínicos correlaciona-se ao

posicionamento de determinados grupos químicos funcionais ligados aos átomos de carbono
dos anéis heterocíclicos componentes da estrutura da molécula, além da presença de um anel
indolizidínico bem estruturado unindo as duas cadeias alifáticas do alcalóide e condição do
átomo nitrogênio no anel heterocíclico. Observou-se que a presença do anel indol no centro
da estrutura é de extrema importância para que a molécula do alcalóide possua um mínimo
efeito tóxico. Dentre os alcalóides que possuem o anel indol bem estruturado e ciclizado,
observou-se que a presença de grupos químicos funcionais (radicais carbonila e hidroxila) nos
carbonos 3 e 3´ no esqueleto piperidínico e indolizidínico são decisivos para o potencial
tóxico da molécula. Também evidenciou-se uma maior atividade biológica de alcalóides com
o nitrogênio do anel heterocíclico apresentando-se como grupo amônio quaternário
(NAKANO et al., 2004).
 11

2A

2B

Figura 2 – Principais alcalóides piperidínicos isolados da P. juliflora. Em A,

juliprosopina. Em B, juliprosina. Estruturas químicas caracterizadas por um anel
indolizidínico e duas cadeias alifáticas que culminam com um anel piperidínico.
 12

2.2 – Aspectos estruturais e funcionais dos principais componentes celulares do SNC

O sistema nervoso central é constituído de neurônio, unidade sinalizadora, especializada,

dotada de vários prolongamentos para a recepção de sinais e um único para emissão de sinais;
e de um conjunto polivalente de células chamado de neuroglia ou glia (Lent, 2005).
As células da glia estão em número superior aos neurônios (cerca de dez a cinqüenta vezes no
SNC de vertebrados) e encontram-se distribuídas em dois grupos extensos: a microglia e a
macroglia. Dispõem-se circundando o corpo celular, axônio e dendritos dos neurônios para
interagir extensivamente, influenciando suas atividades. Também estão envolvidas na
detoxificação e manutenção da homeostasia (Field & Stevens-Graham, 2002; Lent, 2005).

2.2.1 Neurônio

Como unidade fundamental do sistema nervoso central, capaz de receber, processar e enviar
informações, o neurônio apresenta a particularidade de apresentar processos polarizados
especializados denominados de neuritos (axônios e dendritos) capazes de propagar potenciais
de ação, fazer junções sinápticas com outros neurônios e células, formando locais de liberação
para neurotransmissores estocados em vesículas membranosas (Morest & Silver, 2003; Lent,
2005).

Para a formação das junções sinápticas faz-se necessário um alongamento e maturação

ordenada dos neuritos, resultando em alterações morfológicas determinadas por regulação do
citoesqueleto, que são estimuladas por sinais externos, dentre eles o fator de crescimento
neuronal (NGF), ou o 2,4-dinitrofenol (DNP), um bloqueador da formação do peptídeo
β-amilóide, que age pela via de sinalização do AMPc (Wasilewska-Sampaio et al., 2005).

O citoesqueleto dos neurônios é constituído por duas estruturas principais: os microtúbulos,

presentes no corpo celular, alongado para os axônios e dendritos (Figura 3A); e os
neurofilamentos, que são componentes constantes dos axônios, apresentando-se raramente em
dendritos (Machado & Figueredo, 1996; Siegel et al., 1999). Dentre os fatores que podem
influenciar a composição protéica dos prolongamentos neuronais, destaca-se o ambiente em
que o mesmo está situado. Isso foi comprovado por Sonderegger et al. (1985), que revelaram
 13

diferença em doze proteínas componentes dos axônios, comparando neurônios cultivados na

presença de outras células do sistema nervoso central com neurônios cultivados na presença
de outras células do sistema nervoso periférico.

Assim como os constituintes protéicos do citoesqueleto são influenciados pelo meio em que o
neurônio se encontra, a quantidade e tamanho dos neuritos também podem sofrer alterações.
Isso foi demonstrado in vitro por Wang & Cynader (1999), que comparando culturas de
neurônios sobre o efeito da poli-L-lisina, com o efeito do meio condicionado, do soro fetal
bovino (10%) e da fibronectina, evidenciaram a importância das células gliais (meio
condicionado) para constituição de um ambiente que melhor proporciona o desenvolvimento
e a sobrevida de neurônios.

Os neurônios são células bastante susceptíveis a condições de hipóxia e desafios por espécies
reativas de oxigênio. No entanto, no sistema nervoso central, existem famílias de proteínas
estruturais e funcionais que auxiliam na proteção e desenvolvimento dos neurônios. Dentre
estas, a família das anexinas, que compreendem moléculas com capacidade de se ligar a Ca2+
e fosfolipídeos e apresentarem efeito positivo para a sobrevida de neurônios e células gliais in
vitro frente a desafios por hipóxia e danos causados por peróxido de hidrogênio (Han et al.,
2004).

2.2.2 Macroglia

A macroglia, de origem embrionária neuroepitelial, inclui os oligodendrócitos e os astrócitos.

Os oligodendrócitos são responsáveis pela mielinização dos axônios neuronais, com o intuito
de promover a condução saltatória do potencial de ação, impedindo que o impulso elétrico
alastre-se para outras células que não sejam o alvo, possibilitando assim maior eficiência e
rapidez na condução do impulso nervoso (Kriegstein & Götz, 2003; Lent, 2005). Mais
recentemente, outras propriedades biológicas têm sido atribuídas aos oligodendrócitos tais
como a atividade imunoefetora, pelo fato destas células expressarem moléculas de MHC
classe I e II em suas membranas plasmáticas (Siegel et al., 1999).

Os astrócitos, assim denominados pela morfologia estrelada, constituem cerca da metade de

toda a população glial e são fundamentais para a captação de nutrientes e de oxigênio do
 14

sangue para os neurônios, para a manutenção da homeostasia do SNC, compõem o arcabouço

tecidual que fornece sustentação ao SNC, e participam ainda dos mecanismos de defesa
imunitária do tecido nervoso e dos fenômenos de detoxificação cerebral (Tardy, 1991; Lent,
2005; Tardy, 2003).

Os astrócitos participam do processo fundamental de eliminação de peróxidos,

predominantemente pela ação das enzimas catalase e glutationa peroxidase (Dringen et al.,
2005). Através de moléculas receptoras nos pedículos das extremidades dos prolongamentos
astrocitários, que rodeiam as sinapses centrais, os astrócitos igualmente detoxificam o
excedente de neurotransmissores acumulados nas fendas sinápticas, tais como o ácido gama-
aminobutírico (GABA) e o glutamato, que são metabolizados em glutamina. Este aminoácido,
por sua vez, pode ser disponibilizado para os neurônios e utilizados para reformulação de
neurotransmissores (Cajal, 1995; Kirchhoff et al., 2001; Nakase & Naus, 2004).

Sendo também células apresentadoras de antígeno, os astrócitos são capazes de exteriorizar

em suas membranas, antígenos e provocar uma ação defensiva do sistema imunitário contra
agentes patogênicos (Siegel et al., 1999).

Estudos in vitro têm revelado que os astrócitos representam uma população celular capaz de
reagir a insultos químicos, constituindo um bom modelo de estudo para neurotoxicidade de
diversos agentes (Cookson et al., 1994), dentre eles os alcalóides (Barreto et al, 2006; Hughes
et al., 2006; Barreto et al., 2008). Esta reação pode ser representada por alterações na sua
morfologia, ou por modificações nos padrões de expressão de fatores neurotróficos e/ou
neurotóxicos, ou ainda, pela associação desses dois fatores (Streit et al., 1999).

A reatividade astrocitária, também conhecida como astrogliose, é caracterizada por

hiperplasia e hipertrofia celular, com formação de processos citoplasmáticos e pelo aumento
da expressão do sensível marcador denominado proteína ácida do gliofilamento (GFAP), que
é uma proteína constituinte do filamento intermediário dos astrócitos (Figura 3B) (Cookson et
al., 1994; Cookson & Pentreath, 1994; Mead & Pentreath, 1998; Gomes et al., 1999; Hughes,
2006).
 15

Figura 3. Em A, neurônios com os núcleos corados pelo agente intercalante de DNA

Hoechst 33258 (Azul) e expressando β-III-tubulina (verde) através de imunocitoquímica.
Fonte: http://www.ehponline.org/members/2005/7793/fig2.jpg. Em B, astrócitos reativos,
com alta expressão de GFAP em imunocitoquímica realizada após 24h de exposição a
3µg/mL de extrato bruto contendo acalóides de folhas da P. juliflora, em estudo
realizado por Silva et al (2007).
 16

2.2.3 Microglia

A microglia, de origem embrionária hematopoiética, é composta por células consideradas

imuno-efetoras, as quais apresentam atividade fagocítica semelhante à dos macrófagos
(Kandel, 2000), e que, portanto, realizam no sistema nervoso central funções similares
àquelas desempenhadas pelos macrófagos em outros órgãos, incluindo fagocitose, indução à
inflamação e apresentação de antígenos, constituindo, dessa maneira a primeira linha de
defesa contra patógenos invasores (Aloisi, 2001).

Estas células tanto podem facilitar a sobrevivência dos neurônios, pela secreção de
substâncias neurotróficas e ativação dos astrócitos (Giulian et al., 1994), como, também,
podem estar associadas a doenças neurodegenerativas como mal de Alzheimer, doença de
Parkinson, esclerose múltipla e demência associada a AIDS (Dickson et al., 1993).

As células microgliais assumem várias aparências morfológicas que podem ser

correlacionadas a estágios funcionais distintos de repouso e ativação. A ativação da microglia
foi caracterizada pela modificação da morfologia, passando de uma forma ramificada (em
repouso) para uma forma amebóide (ativada). Esta ativação foi também caracterizada pelo
aumento da expressão de moléculas do sistema principal de histocompatibilidade (MHC
classe I e classe II), e de outras moléculas de membrana como CD11B (receptor do fator 3 do
sistema complemento), de forma que a imunomarcação destes receptores nos permite detectar
a ativação de microglia (Gehrmann et al., 1995; Butovsky et al., 2007). Além da mudança
morfológica, a ativação microglial altera seu comportamento proliferativo e migratório, como
também a produção de citocinas, tais como IL-1, IL-6, TNF-α, IFN-3 e TGF-β (Gehrmann et
al., 1995). Tais alterações morfológicas e/ou funcionais destas células caracterizam sua
reatividade, num fenômeno conhecido como microgliose.

A microgliose pode igualmente induzir a produção de fatores neurotóxicos, como visto pelo
estudo desenvolvido por Gao et al. (2002), usando co-cultura de neurônio-células gliais. Este
estudo demonstrou que baixa concentração de lipopolissacarídeo induz ativação microglial e
produção de óxido nítrico (NO), radical livre de vida curta que medeia uma variedade de
funções biológicas, incluindo homeostasia vascular e neurotransmissão, mas que, no entanto,
pode se combinar com o superóxido, produzindo peroxinitrito altamente reativo (Abbas et al.,
2003; Manning et al., 2001; Dawson & Snyder 1994).
 17

2.2.4 Relação entre neurônio e células gliais.

Os neurônios e as células gliais podem comunicar-se através de fluxo de íons,

neurotransmissores, moléculas de adesão celular e moléculas de sinalização especializadas.
Esta extensa relação entre neurônio e glia é denominada neurobiologia (Field & Stevens-
Graham, 2002). Sabe-se que através desta interação os neurônios são capazes de comunicar às
demais células do sistema nervoso central o acontecimento de injúrias teciduais, usando
moléculas comunicantes como o fator de crescimento de fibroblasto (FGF), potássio e ATP.
Por outro lado, os astrócitos são capazes de produzir fatores tróficos, como NGF, que
liberados em áreas de lesão, auxiliam a sobrevida dos neurônios (Tardy, 2002).

O próprio desenvolvimento do sistema nervoso central depende da interação entre neurônios e

células gliais. Alguns componentes da matriz extracelular, especialmente a laminina
produzida pelos astrócitos, servem de substrato para o crescimento neuronal e orientação
axonal (Costa et al., 2002; Faria et al., 2006). Durante esta fase, os astrócitos atuam como um
tipo de estrutura que guia a migração dos neurônios, denominada glia radial, e posteriormente,
eles não apenas tornam-se os principais provedores de nutrientes e fatores de crescimento para
os neurônios, como também colaboram com a transmissão do impulso nervoso entre
neurônios vizinhos (Kirchhoff et al., 2001; Lent, 2005).

A interação entre neurônios e células gliais é essencial para a condução de impulsos nervosos
pelos axônios, transmissão sináptica e processamento de informações (Field & Stevens-
Graham, 2002). Não se pode afirmar que as células gliais estejam envolvidas no processo de
transmissão do impulso nervoso. No entanto, já é sabido que estas células favorecem a
sinalização entre os neurônios, além de serem capazes de liberar neurotransmissores e
expressar proteínas receptoras de neurotransmissores na superfície de suas membranas
(Verkhratsky & Steinhauser, 2000).

A microglia pode promover ou comprometer a viabilidade neuronal, dependendo do seu nível

de ativação: em lesões leves, ela pode ser um suporte para processos benéficos, tais como
reorganização sináptica, enquanto que, em condições mais severas ou crônicas, estas células
podem contribuir para mecanismos neurotóxicos (Salimi & Humpel, 2002; Streit et al., 1999).
Gehrmann et al. (1995) citam que após insultos no sistema nervoso central estas células são
ativadas, podendo gerar dois tipos de microglia reativa, a primeira, não-fagocítica,
 18

caracterizada pelo aumento na capacidade de apresentar antígeno e a segunda, fagocítica,

caracterizada pela capacidade de fagocitar e liberar fatores citotóxicos. O fato que determina o
tipo de resposta a ser apresentado pela microglia é justamente a ocorrência de degeneração
nos neurônios ou mesmo nas suas terminações nervosas.

A complexidade destas interações entre neurônios e células gliais pode ser estudada in vitro
através de co-culturas, que podem ser realizadas diretamente plaqueando neurônios
dissociados sobre uma monocamada de células gliais (Faria et al., 2006); ou por método sem
contato usando meio condicionado de cultura de células gliais (Wang & Cynader, 1999).

2.3 A neurotoxicidade induzida por Prosopis juliflora

A P juliflora tem sido uma alternativa viável para solucionar os problemas advindos da seca
concernentes à nutrição animal, principalmente pela riqueza nutricional de seus frutos (Lima,
1986). No entanto, o consumo de vagens de algaroba, como elemento principal da ração
animal provoca danos à saúde de ruminantes com comprometimento do SNC. Tabosa et al.
(2000) demonstraram toxicidade para caprinos que ingeriram uma dieta composta de 60 a
90% de matéria seca de vagens de P. juliflora. Os animais apresentaram sinais clínicos
semelhantes àqueles que foram observados na intoxicação de bovinos pelo consumo de
vagens de algaroba e na microscopia, foram observadas lesões histológicas caracterizadas por
vacuolização dos neurônios do núcleo oculomotor do nervo trigeminal, degeneração
walleriana dos nervos mandibulares e trigeminais e atrofia muscular por degeneração de
nervos periféricos.

A avaliação histológica realizada por Tabosa et. al (2006) do sistema nervoso de bovinos
intoxicados experimentalmente com P. juliflora revelou vacuolização e perda de neurônios do
núcleo de nervos craniais, degeneração walleriana nos nervos craniais, atrofia por
degeneração do nervo do músculo masseter e músculos da mastigação. E a análise por
microscopia eletrônica revelou mitocôndrias de neurônios do núcleo trigeminal apresentando
suas cristas dispersas perifericamente e desintegradas.
 19

Estudos in vitro têm sugerido o envolvimento de alcalóides, presentes nos frutos e folhas da
planta, nos distúrbios do sistema nervoso central observados em animais intoxicados por P.
juliflora. Dentre eles destaca-se o estudo de Hughes et al. (2005) que revela a ação citotóxica
em células de origem glial humanas, da linhagem GL-15, após 24 horas de exposição a um
extrato de alcalóides obtido dos frutos de algaroba, desde a concentração de 0,03 µg/mL. Este
efeito foi evidenciado pela redução dose-dependente da atividade mitocondrial e lesão de
membrana celular com aumento da atividade da enzima lactato desidrogenase (LDH), que é
essencialmente citossólica, no meio de cultura das células, assim como pela redução da
quantidade de células capazes de excluir o corante azul de tripan, por não apresentarem a
membrana plasmática integra.

Por outro lado, testes in vitro também desenvolvidos por Hughes et. al. (2006) em cultura
primária de astrócitos murinos revelaram que estas células são mais resistentes aos efeitos
tóxicos do extrato bruto contendo alcalóides obtido de frutos da P. juliflora. Este estudo
demonstrou que os alcalóides são capazes de induzir redução da atividade mitocondrial de
astrócitos e lesão significativa em membrana celular, apenas em concentrações igual ou
superior a 30 µg/mL.

Ainda, em um estudo mais recente desenvolvido por Silva et al. (2007), foi evidenciado o
efeito citotóxico do extrato bruto e de quatro frações de alcalóides isolados de folhas de P.
juliflora em cultura de células gliais. Observou-se que, após 24 horas de tratamento com o
extrato bruto contendo alcalóides (ETA), as células apresentaram redução de atividade
mitocondrial desde a concentração de 0,3 µg/mL e lesão em membrana celular desde
exposição a 3 µg/mL. Por outro lado, observou-se a ativação da microglia presente em
culturas tratadas com concentrações de 30 µg/mL. Contudo, nem todas as frações de
alcalóides obtidas a partir do ETA apresentaram o efeito citotóxico similar àquele observado
em células expostas ao extrato bruto, e algumas frações não apresentaram efeito citotóxico
relativo. No entanto, outras frações, como as frações F29/30, F31/33, F32 e F34/35, revelaram
importante ação citotóxica. A fração 32 (F32) se destacou por ser a mais tóxica, e pela
propriedade em induzir a produção de óxido nítrico (NO) pelas células gliais em altos níveis
(Silva et al., 2007). Estes resultados indicam que alcalóides da P. juliflora agem diretamente
em células gliais induzindo a sua ativação e citotoxicidade, e que os componentes alcaloidais
da F32 são aqueles mais ativos.
 20

O estudo apresentado nesta dissertação é pioneiro na avaliação citotóxica de alcalóides da P.

juliflora sobre neurônios cultivados. E vem contribuir, para elucidar os impactos neurológicos
observados em animais intoxicados por uma planta de grande importância na alimentação de
animais da região Nordeste do Brasil, o que o torna de alta relevância ao Programa de
Mestrado em Ciência Animal dos Trópicos.
 21

3 - OBJETIVOS

Pelo exposto, diante das propriedades tóxicas da P. juliflora, objetivou-se neste estudo,
realizar análises dos efeitos citotóxicos do extrato de folhas da P. juliflora e suas frações
contendo alcalóides sobre neurônios e células gliais.

São objetivos específicos:

• estudar os efeitos neurotóxicos in vitro do extrato de folhas da P. Juliflora e suas

frações contendo alcalóides através de análises de modificações morfológicas e
bioquímicas induzidas em culturas primárias de células neuronais e co-culturas de
neurônios/células gliais;

• estudar a influência da interação entre neurônios e células glias na resposta ao insulto

gerado por extrato de folhas de P. juliflora e suas frações contendo alcalóides.
 22

4 – ARTIGO CIENTÍFICO

Efeito do extrato de folhas da Prosopis juliflora Swartz. D.C e suas frações contendo
alcalóides na ativação de células gliais e sobrevida de células neuronais.

Silva, V.D.A.; Pitanga, B.P.S.; Souza, C.S.; Fragomeni, B.O.; Souza, M.F.; Silva, A.R.; Silva,
A.M.M.; Costa, M.F.D.; El-Bachá, R.S.; Costa, S.L.

RESUMO

A Prosopis juliflora é amplamente utilizada na alimentação animal. No entanto, intoxicações

pelo seu consumo têm sido descritas em animais, e caracterizadas por alterações
neuromusculares. Nesse trabalho investigou-se a citotoxicidade do extrato bruto de P. juliflora
(ETA) e frações desse extrato contendo alcalóides em neurônios corticais e o impacto da
resposta glial. ETA e frações em concentrações de 0,3 – 40 µg/mL foram testados por 24 horas
em cultura primária de neurônios e neurônio/células gliais. O MTT revelou que ETA, F29/30,
F31/33, F32 foram citotóxicos para neurônios corticais. Porém, a fração F34/35 não foi
citotóxica até 40 µg/mL. Entretanto, ETA e todas as frações testadas não foram citotóxicas para
co-cultura em todas as concentrações adotadas. Este resultado foi confirmado usando um
método de co-cultura sem contato, tratada com 3 µg/mL de ETA. No entanto ETA e F32
induziram vacuolização neuronal e glial. Através da imunocitoquímica para β-III-tubulina e
GFAP foi revelado uma redução e aumento, respectivamente, na expressão destas proteínas em
co-culturas expostas a 3 µg/mL de F32. Além disso, a incubação das células com 3 µg/mL de
F32 induziu aumento na produção de óxido nítrico em co-cultura. Juntos, esses resultados
mostram que ETA e frações agem diretamente em neurônios induzindo citotoxicidade e isso
pode retratar os danos neuronais observados em animais intoxicados. Entretanto, a
neurotoxicidade de alcalóides da P. juliflora é atenuada pela presença e resposta de células
gliais.

Palavra-chave: Prosopis juliflora; neurônio; células gliais; citotoxicidade, NO

 23

Effects of the extract from leaves of Prosopis juliflora Swartz. D.C. and its fractions
containing alkaloids on glial activation and neuronal cells survival.

Silva, V.D.A.; Pitanga, B.P.S.; Souza, C.S.; Fragomeni, B.O.; Souza, M.F.; Silva, A.R.; Silva,
A.M.M.; Costa, M.F.D.; El-Bachá, R.S. and Costa, S.L.

SUMMARY

The Prosopis juliflora is largely used for animal feed. Intoxication with the plant has been
characterized by neuromuscular alterations. In this study we investigated the cytotoxicity of
the (TAE) and the alkaloidal fractions (AFs) on cortical neurons and the impact of glial cell
responses. TAE and AFs at concentrations ranging between 0.3 – 40 µg/mL were tested for
24 h on neuron primary cultures and on neuron/glial cell primary co-cultures. The MTT test
revealed that TAE, F29/30, F31/33, and F32 were cytotoxic to cortical neurons. The fraction
F34/35 was not cytotoxic until 40 µg/mL. However, TAE and all AFs tested were not
cytotoxic to co-cultures at all concentrations adopted. This result was confirmed using a non-
contact co-culture method exposed to 3 µg/mL TAE. TAE and F32 induced neuronal and glial
vacuolation. Immunocytochemistry for β-III-tubulin and GFAP of co-cultures exposed to
3µg/mL F32 revealed, respectively, a reduction and increase in the expression of these
proteins. Moreover, incubation of cells with 3 µg/mL AF32 induced NO production. Taken
together, these results show that TAE and AFs act directly on neurons inducing cytototoxicity
and it may be related to neuronal damages observed on intoxicated animals However, the
neurotoxicity was attenuated by the presence and response of glial cells.

Keywords: Prosopis juliflora; neuron; glial cells; cytotoxicity, NO

 24

4.1 - INTRODUÇÃO

Prosopis juliflora é uma árvore, que foi introduzida no nordeste brasileiro em 1940 (SPA,
1989). Por possuir alta palatabilidade e valor nutricional vem sendo largamente utilizada na
alimentação animal (Silva, 1981). No entanto, o consumo em excesso desta planta pode
causar enfermidade nos animais (Dollahite & Anthony, 1957; Baça et al., 1967). No Brasil, a
enfermidade foi caracterizada como doença da “cara torta”, que reúne características como
edema e atrofia do músculo masseter, espongiose e gliose (Figueiredo et al., 1995). A
ingestão de rações contendo altas concentrações dos frutos da P. juliflora por caprinos e
bovinos tem gerado como efeito para estes animais alterações neuro-musculares
caracterizadas por formação de vacúolos na região do pericário, degeneração walleriana e
danos mitocondriais em neurônios dos nervos craniais (Tabosa et al., 2000; Tabosa et al.
2006).

As células da glia, em especial os astrócitos, são responsáveis pela defesa imunológica,

detoxificação e manutenção da homeostasia, para tanto são capazes de reagir a insultos
químicos e a estímulos gerados por danos neuronais (Cookson et al., 1994; Gao et. al., 2002).
Estudos prévios revelaram, em um modelo de cultura primária de astrócitos corticais murinos,
que alcalóides extraídos dos frutos da P. juliflora induzem de forma dose-dependente uma
diminuição da função mitocondrial desde 24 h após a exposição (Hughes et al., 2006). Em
outro estudo, evidenciou-se igualmente, que um extrato bruto contendo alcalóides (ETA) e
frações alcaloidais do mesmo (F29/30, F31/33, F32, F34/35) extraídos de folhas da P.
juliflora são também citotóxicos para as células em culturas primárias de astrócitos e
microglia corticais murinas, além de induzir a ativação dessas células, acompanhada do
aumento na produção de óxido nítrico (Silva et. al., 2007).

Diversos estudos têm demonstrado a complexidade das interações entre neurônios e células
gliais como moduladoras da proteção glial a danos neuronais (Field & Stevens-Graham, 2002;
Wang & Cynader, 1999; Romão et al., 2008). Neste estudo objetivou-se estudar a
citotoxicidade do extrato bruto de folhas da P. juliflora e suas frações contendo alcalóides
sobre neurônios corticais, bem como o impacto da resposta glial sobre este efeito, usando
como modelos experimentais cultura primária de neurônios e co-cultura de neurônios/células
glias originados de córtex murino.
 25

4.2 - MATERIAIS E MÉTODOS

O extrato bruto de P. juliflora (ETA) e as frações contendo alcalóides utilizadas neste estudo
foram obtidos conforme descrito por Silva et al. (2007). A obtenção do ETA ocorreu através
do método de extração ácido/base de extração: uma amostra de dois gramas deste extrato foi
submetida a cromatografia em coluna em sílica gel, onde a fase móvel consistiu em sistema
clorofórmio/metanol 99:1 até 5:5, no total, foram obtidas 35 frações do ETA, essas frações
foram submetidas a cromatografia em camada delgada em sílica gel para realização do teste
de Dragendorff, reagente de identificação de alcalóides, e do teste de reatividade ao iodo. O
teste de Dragendorff foi realizado para detectar as frações que possivelmente conteriam os
alcalóides. O teste de reatividade ao iodo foi realizado para agrupar as frações com o mesmo
perfil cromatográfico, sendo agrupadas as frações 29 e 30, 31 e 33, assim como as frações 34
e 35. Conforme o estudo desenvolvido por Silva et al. (2007), as frações alcaloidais que
induziram citotoxicidade em células gliais foram F29/30, F31/33, F32 e F34/35, as quais
foram, portanto utilizadas neste estudo, além do ETA

Cultura primária de células gliais, cultura primária de neurônios e co-cultura de células

gliais e neurônios.

Culturas primárias de células gliais foram preparadas de acordo com o método de Cookson &
Pentreath (1994) modificado e conforme descrito por Silva et al. (2007). Foram utilizados
ratos Wistar neonatos (0 - 1 dia), obtidos do Biotério do Laboratório de Neurociências do
Instituto de Ciências da Saúde da UFBA (ICS-UFBA). O procedimento foi realizado de
acordo com as normas do Comitê de Ética em Experimentação Animal. Após serem
anestesiados com éter, os animais foram decapitados e seus hemisférios cerebrais expostos e
removidos assepticamente. As meninges e os vasos sangüíneos foram retirados dos córtices
cirurgicamente e, em seguida, forçados a passar por uma membrana de Nitex estéril com
malha de 75 µm. As células dissociadas foram suspensas em meio Dulbecco (DMEM/HAM
F12, Cultilab, SP, Brasil), suplementado com 6,25 μg/mL de gentamicina, 2 mM de L-
glutamina, 0,011 g/L de piruvato, 3,6 g/L de Hepes, glicose 0,6 % e 10 % de soro fetal bovino
(Gibco, Grand Island, NY).
 26

As células gliais foram semeadas em placas de cultura de poliestireno (Cultilab, SP, Brasil) de
100 mm de diâmetro a uma densidade de 5 x 104 células/cm2, cultivadas em câmara úmida
com 5% CO2 a 37 ºC. A cada 48 h o meio de cultura foi trocado. Após 15 dias, quando se
esperava que a glia tivesse atingido maturidade, as células foram descoladas com solução de
tripsina (EC 3.4.21.4) a 0,05 % e EDTA a 0,02 % diluídos em PBS. As células foram então
replaqueadas em placas de poliestireno de 35 mm de diâmetro a uma densidade de 1 x 104
células/cm2 e cultivadas por mais oito dias.

Culturas primárias de neurônio foram preparadas de acordo com o método de Tetsuya et al.
(1999) modificado. Foram utilizados fetos de ratos Wistar (15 - 18 dias), obtidos do Biotério
do Laboratório de Neurociências do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA (ICS-UFBA). O
procedimento foi realizado de acordo com as normas do Comitê de Ética em Experimentação
Animal. Após serem anestesiadas com éter, as fêmeas gestantes foram sacrificadas por
deslocamento da articulação atlanto-occipital e sofreram cirurgia cesariana para retirada do
útero gravídico. Os fetos foram retirados do útero e foram decapitados. Seus hemisférios
cerebrais foram expostos e removidos assepticamente. As meninges e os vasos sangüíneos
foram retirados dos córtices cirurgicamente e, em seguida, após dissociação mecânica,
forçados a passar por uma membrana de Nitex estéril com malha de 75µm. As células
dissociadas foram suspensas em meio Dulbecco (DMEM/HAM F12, Cultilab, SP, Brasil)
suplementado com 6,25 μg/mL de gentamicina, 2 mM de L-glutamina, 0,011 g/L de piruvato,
3,6 g/L de Hepes, glicose a 0,6 % e 10 % de soro fetal bovino (Gibco, Grand Island, NY).

Nas culturas simples, os neurônios foram semeados em placas de cultura de poliestireno

(Cultilab, SP, Brasil) de 96 poços previamente tratadas, por 40 min, com poli-D-lisina a 0,01
% (Sigma), a uma densidade inicial de 5 x 104 células/cm2, cultivadas em câmara úmida com
5% CO2 a 37 ºC por 8 dias. A cada 48 h o meio de cultura foi trocado.

As co-culturas de células foram realizadas de acordo com método de Chang et. al. (2000)
modificado, em que duas etapas foram realizadas. Na primeira foi realizado um cultivo de
células gliais como descrito anteriormente na densidade de 1 x 104 células/cm2 em placa de 35
mm de diâmetro, ou 4 x 104 células/cm2 em placas de 96 poços, previamente tratadas por 40
minutos com poli-D-lisina 0,01% (Sigma). Três dias após o replaquemaneto, iniciou-se a
segunda etapa, que consistiu em cultivo de neurônio sobre a monocamada de células gliais
numa densidade de 2,5 x 103 células/cm2 em placa de 35 mm de diâmetro ou 1 x 104
 27

células/cm2 em placas de 96 poços. Os neurônios foram cultivados por oito dias na presença
de células glias.

Tratamento das células com o extrato e as frações contendo alcalóides

Após os respectivos períodos de cultivo, as culturas de glia, neurônio e co-culturas foram

expostas diretamente às concentrações finais do extrato e das frações contendo os alcalóides,
por um período de 24 horas.

O ETA e as frações positivas a Dragendorff foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO,

Sigma, St. Louis, MO) obtendo-se soluções-mãe a uma concentração de 30 mg/mL, as quais
foram estocadas ao abrigo da luz a –20 ºC. No momento do tratamento, o ETA e suas frações
29/30, 31/33, 32 e 34/35 foram diluídos diretamente em meio de cultura suplementado em
concentrações finais entre 0,3 a 40 µg/mL para testes de citotoxicidade, tomando como base
estudos prévios realizados por Silva et al. (2007). Após estudos de citotoxicidade, foram
utilizados para as demais metodologias apenas o ETA e a fração F32 em concentrações
próximas a valores de EC50 para neurônios (doses sub-tóxicas) devido ao alto potencial
neurotóxico apresentado.

Culturas primárias tratadas por 24 h com o veículo de diluição DMSO, em volume

equivalente à mais alta concentração do ETA e das frações testadas (0,1%), foram adotadas
como controle, e não mostraram qualquer efeito significativo nos parâmetros analisados,
quando comparado com culturas que não foram expostas a este solvente.

Tratamento de neurônios com meio condicionado

Este método foi usado com a finalidade de avaliar a influência de células gliais ativadas pelo
extrato e frações contendo alcalóides sobre a sobrevida de neurônios também tratados .
Após 24 horas de tratamento de células gliais com o extrato ou as frações contendo os
alcalóides, foram recolhidos os sobrenadantes, os quais passaram a ser denominados de meio
condicionado. O meio condicionado (MC) foi usado para tratamento de neurônios cultivados
também por 24horas.
 28

Avaliação da Citotoxicidade

Danos na membrana plasmática causados pelos alcalóides foram inicialmente avaliados

através do teste da exclusão do azul de tripan em culturas de neurônio cultivadas em placas de
96 poços tratadas com ETA e frações contendo alcalóides (F29/30, F31/33, F32 e F34/35) em
concentrações que variaram entre 0,1 a 10 µg/mL. Após tratamento, o meio contendo os
alcalóides foi substituído por um novo meio de cultura com 10% do corante azul de tripan.
Após dez minutos a 37°C, as culturas foram analisadas por microscopia óptica (Nikon TS-
100) e a quantidade de células não-coradas, por excluírem o corante devido à integridade de
sua membrana plasmática, foi quantificada e expressa em resultado percentual em função da
quantidade total de células no campo.

A atividade mitocondrial foi avaliada pelo teste do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-

difeniltetrazólio (MTT). Após período de cultivo em placas de 96 poços, as culturas de
neurônio e co-cultura de neurônio/células gliais foram expostas ao ETA e suas frações por 24
h, a fim de avaliar a viabilidade celular através do teste do MTT. O teste do MTT (HANSEN
et al., 1989) baseia-se no princípio da conversão do substrato amarelo em cristais de
formazan, de cor violácea, pelas desidrogenases mitocondriais de células vivas. Três horas
antes do término do tempo de exposição, o meio de cultura foi removido e substituído por
uma solução de MTT a uma concentração final de 1 mg/mL diluído em DMEM/HAM F12
sem suplementação (Sigma, St Louis, MO). Após as três horas em contato com o MTT, foi
acrescido um volume de 100 µl/poço de um tampão contendo
20 % de Duodecil Sulfato de Sódio (SDS), 50 % de Dimetil Formamida (DMF), pH 4,7,
mantendo-se as placas por 12 h a 37 ºC, para completa dissolução dos cristais de formazan. A
absorbância óptica de cada amostra foi medida usando um espectrofotômetro em um
comprimento de onda de 492 nm. Os dados foram apresentados como porcentagem da
absorbância do controle, considerada como 100 %.

Reatividade glial e alterações morfológicas

O estudo da morfologia e ativação celular foi observado através da coloração de Rosenfeld e

marcação imunocitoquímica das proteínas β-III-Tubulina (marcador de neurônios) e GFAP
(marcador de astrócitos). A reatividade das células gliais ao extrato e à fração F32 contendo
 29

alcalóides de P. juliflora foi também avaliada através da dosagem de nitrito no meio de

cultura, que reflete a produção de óxido nítrico. Para realização destas análises, co-culturas
foram previamente tratadas por 24 h com as concentrações de 1,5 e 3 µg/mL do ETA e F32.

a) Dosagem de óxido nítrico

Para investigar se o extrato e fração F32 contendo alcalóides da P. juliflora interferiram no

funcionamento de células gliais, os níveis do neuromediador reativo óxido nítrico (NO),
aferido pelos níveis de nitrito, foram medidos nos meios de cultura das células em condições
controle e tratadas com o ETA e F32 sob concentrações de 1,5 e 3 µg/mL. Para mensuração
da concentração de nitrito acumulado no meio de cultura das células foi utilizada uma reação
colorimétrica baseada na reação de Griess (Wang et al., 2002). Cinqüenta microlitros do
sobrenadante das amostras foram incubados com um volume igual de um reagente de cor (1%
de sulfanilamida e 0,1% de naftil-etilenodiamina em 2,5 % de ácido fosfórico). Após 10 a 15
minutos de incubação em temperatura ambiente, a absorbância foi medida a 560 nm usando-
se um leitor fotocolorimétrico (Thermo Plate TP-Reader). As concentrações de nitrito foram
calculadas por comparação a uma curva de calibração padrão obtida por dosagem de nitrito de
sódio diluído em meio de cultura (NaNO2, 1,26 - 100 mmol/L).

b) Coloração de Rosenfeld

As células foram semeadas em placas de cultura de poliestireno (Cultilab, SP, Brasil) de

35 mm de diâmetro, conforme já descrito. Após o período de tratamento, as células foram
lavadas três vezes com PBS, fixadas e permeabilizadas com metanol a –20 ºC por 10 minutos.
As células fixadas foram coradas segundo protocolo estabelecido por Rosenfeld (1947). O
reagente de Rosenfeld foi adicionado às placas contendo as células previamente tratadas em
volume suficiente para cobrir completamente o tapete celular. Decorridos 3 minutos,
adicionou-se 20 gotas de água destilada à solução corante, deixando agir por 20 minutos em
temperatura ambiente. As placas foram então lavadas com água corrente em pequeno fluxo,
secadas ao ar, analisadas por microscopia óptica (Nikon TS-100) e fotografadas por uma
câmara digital (Nikon E-4300).
 30

c) Imunocitoquímica

As células foram semeadas em placas de cultura de poliestireno (Cultilab, SP, Brasil) de

35 mm de diâmetro, conforme já descrito. Após o período de tratamento, as células foram
lavadas três vezes com PBS, fixadas e permeabilizadas com metanol a –20 ºC por 10 minutos.
Após re-hidratação das células com PBS por 30 mim, as co-culturas foram incubadas com
anticorpo monoclonal de camundongo anti-β-III-Tubulina conjugado com CY3 (1:500 em
PBS, Sigma, EUA) por uma hora à temperatura ambiente, sob agitação lenta. Os anticorpos
em excesso foram removidos realizando três lavagens com PBS durante 10 minutos, também
sob agitação lenta.

Para a marcação imunocitoquímica de GFAP, as co-culturas foram incubadas com anticorpo

policlonal de coelho anti-GFAP (1:500 em PBS, Sigma, EUA) por três horas. Após este
tempo, elas foram incubados durante uma hora com anticorpos de caprinos conjugados com
isotiocianato de tetrametilrodamina anti-IgG de coelho (Biomakor, 1:500 em PBS, Israel). A
incubação dos anticorpos foi realizada à temperatura ambiente e os anticorpos em excesso
foram removidos realizando três lavagens com PBS durante 10 minutos, ambos os
procedimentos sob agitação lenta. Em seguida, as células foram analisadas por microscopia de
fluorescência (Olympus BX70) e 10 campos escolhidos aleatoriamente para cada placa foram
fotografados.

Análise Estatística

Os resultados do teste de azul de tripan foram expressos em percentual de células

viáveis/campo. A significância da diferença estatística entre os grupos tratados e controle foi
avaliada através do teste one-way-ANOVA, seguido do pós-teste Student-Newmann-Keuls.
Os resultados das análises de MTT foram expressos em valores percentuais, considerando os
valores de absorbância das culturas expostas apenas ao veículo DMSO como 100 %. Os
resultados da dosagem de óxido nítrico foram expressos como média ± desvio padrão. Para
determinar a diferença estatística entre o grupo controle e cada grupo tratado isoladamente
nestas análises, foi realizado o teste estatístico t-Student. Valores de P < 0,05 foram
considerados como estatisticamente significativos.
 31

4.3 – RESULTADOS E DISCUSSÃO

Citotoxicidade do extrato de folhas de P. juliflora e suas frações contendo alcalóides em

cultura de neurônios e co-cultura de neurônio/glia.

O estudo do efeito citotóxico do ETA e frações contendo alcalóides F29/30; F31/33; F32 e
F34/35 sobre a integridade da membrana celular, através do teste de exclusão ao corante vital
azul de tripan revelou que tanto o ETA, quanto as frações de alcalóides induzem lesão de
membrana celular em células neuronais, quando comparadas com o grupo controle, numa
resposta dose-dependente (Figura 4A, 4B, 4C, 4D e 4E). O ETA e F32 apresentaram uma
maior atividade citotóxica com redução na quantidade de células viáveis desde a concentração
de 1 µg/mL. Apesar da fração F31/33 não gerar danos na membrana de células moduladas
com concentrações abaixo de 1 µg/mL, esta também se destacou por apresentar uma redução
acentuada na quantidade de células viáveis a partir da concentração de 3µg/mL. Para as
contagens de neurônios tratados com ETA a 3 e 10µg/mL; F29/30 a 10µg/mL; F31/33 a 3 e
10µg/mL e F32 a 1; 3 e 10µg/mL não foi encontrada nenhuma célula capaz de excluir o
corante azul de tripan, portanto não houve desvio padrão para estas contagens, o que significa
que houve lesão de membrana plasmática em 100% das células expostas a estes tratamentos.
 32

* *

B C

* * *

D E

*
*
* *

Figura 4 - Análise do efeito de ETA e frações de alcalóides de folhas da P. juliflora sobre

a integridade da membrana plasmática de neurônios, após 24h de tratamento, expressa
em percentual de células impermeáveis ao Azul de Tripan, em relação ao número total
de células/campo. Em A, efeito de ETA; em B, efeito da F29/30; em C, efeito da F31/33;
em D, efeito da F32; em E, efeito da F34/35. A concentração 0 µg/mL representa a
exposição das células ao veículo, na condição controle (DMSO 0,1%). * P < 0,05, em
relação ao controle.
 33

Estes achados revelaram o alto potencial do ETA e frações, dentre elas destacando-se a F32,
para induzir lesão na membrana plasmática dos neurônios. Estudos prévios têm revelado que
um extrato bruto contendo alcalóides do fruto da P. juliflora atua lesionando a membrana
plasmática de células do sistema nervoso central (tumor glial, linhagem GL-15) desde
concentração bastante baixa, 0,03 μg/mL, após 24 horas de exposição (Hughes et al., 2005).

ETA e as frações F29/30; F31/33 e F32 induziram uma redução da atividade mitocondrial
dose-dependente em cultura de neurônios (Figura 5 à figura 9). Sendo que o ETA e a F32
demonstraram um maior potencial neurotóxico (Figura 5 e figura 8). A fração F34/35 não
induziu redução da atividade mitocondrial para nenhuma das concentrações testadas (<
40µg/mL) (Figura 9). As mesmas concentrações de ETA e frações, que geraram
citotoxicidade em cultura de neurônio foram incapazes de alterar significativamente a
atividade mitocondrial da co-cultura de células gliais/neurônio.

ETA
120

100

*
80
(Teste do MTT)
% Viabilidade

*
60
Neurônio
40 Co-cultura

20

0
1 1,5 2,2 3,4

Concentração (µg/mL)

Figura 5: Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e em

co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com ETA (1 – 3,4 µg/mL), durante
um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do controle
(células tratadas com veículo, DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao controle.
 34

F29/30
120

100

80
*

(Teste do MTT)
% Viabilidade
*
60
Neurônio
40 Co-cultura

20 *

0
3,4 5,1 7,7 11,5

Concentração (µg/mL)

Figura 6: Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e em

co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F29/30 (3,4 – 11,5 µg/mL),
durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do
controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao controle.

F31/33
120

100

80
(Teste do MTT)
% Viabilidade

*
* *
60
* Neurônio
40 Co-cultura

20

0
1 1,5 2,2 3,4

Concentração (µg/m L)

Figura 7: Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e em

co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F31/33 (1 – 3,4 µg/mL),
durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do
controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao controle.
 35

F32
120

100

80 *
(Teste do MTT)
% Viabilidade

60 Neurônio
*
Co-cultura
40

20

0
0,3 0,4 0,7 1

Concentração (µg/mL)

Figura 8: Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e em

co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F32 (0,3 – 1µg/mL), durante
um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do controle
(células tratadas com veículo DMSO 0,1%). * P < 0,05, em relação ao controle.

F34/35

120

100

80
(Teste do MTT)
% Viabilidade

60 Neurônio
Co-cultura
40

20

0
11,5 17,3 25,9 38,9

Concentração (µg/m L)

Figura 9: Teste de citotoxicidade pelo teste do MTT em culturas de neurônio (azul) e em

co-culturas neurônios/astrócitos (vermelho) tratadas com F34/35 (11,5 – 38,9 µg/mL),
durante um período de 24 h. Resultados expressos em porcentagem da absorbância do
controle (células tratadas com veículo DMSO 0,1%).
 36

A redução da atividade mitocondrial visualizada em cultura de neurônio significa que as

desidrogenases mitocondriais envolvidas na cadeia respiratória destas células tornaram-se
incapacitadas de quebrar o anel de tetrazólio no teste de MTT, revelando a sua inativação
induzida por ETA e frações de folhas da P. juliflora contendo alcalóides (Mosman, 1983;
Shearman et al., 1995). Estudos têm revelado que o ETA e frações de alcalóides da P.
juliflora induzem redução da atividade mitocondrial em células gliais cultivadas, com valores
de EC50 de 2,87µg/mL para ETA, 2,82µg/mL para F31/33 e 3,01µg/mL para F32 (Silva et
al., 2007), entretanto nosso estudo revela, que essas células quando cultivadas na presença de
neurônios não reduzem a sua atividade mitocondrial ao serem expostas a estes compostos
contendo alcalóides.

O estudo da influência de células gliais ativadas sobre a viabilidade de neurônios usando meio
condicionado e teste de MTT revelou que as células gliais promoveram a proteção de
neurônios tratados com extrato bruto contendo alcalóides. Houve uma redução da atividade
mitocondrial dos neurônios em tratamentos com ETA e F32 diretamente ou em meio
condicionado. A F32 demonstrou um maior potencial citotóxico tanto no tratamento direto,
quanto após passagem por cultura de astrócitos (Figura 10), não havendo diferença
significativa entre estes. No tratamento com o extrato bruto, o neurônio apresentou uma maior
sobrevida quando tratado com o alcalóide após passagem por células gliais (Figura 10).

O estudo da interação entre neurônio e células gliais, sem o contato direto destes dois tipos
celulares e conseqüentemente a interferência das desidrogenases mitocondriais de células
gliais sobre a conversão do MTT exposto, revelaram que a passagem dos alcalóides por
cultura de células gliais reduz a intensidade da citotoxicidade dos mesmos. Estudos revelam
que as células gliais são células potencialmente capazes de metabolizar drogas (Meyer et al.,
2007). A redução da atividade citotóxica de alcalóides presentes no ETA, após passagem por
células gliais, pode estar relacionada a possível metabolização dos mesmos antes de
interagirem com os neurônios.
 37

Figura 10: Teste de citotoxicidade (MTT) em cultura de neurônio após 24 h de

tratamento com 3 µg/mL de ETA e 1,5µg/mL F32 em meio de cultura fresco (sem
passagem em cultura de astrócitos) e com meio derivado de culturas de astrócitos
tratadas com os alcalóides nas mesmas concentrações (meio condicionado). Os
resultados são expressos em porcentagem da absorbância do controle (células em veículo
DMSO 0,1%). * P < 0,05 comparado o tratamento com meio fresco e tratamento com
meio condicionado, para mesmo tratamento.

Células gliais ativadas são capazes de produzir fatores solúveis que contribuem à sobrevida de
neurônios (Wang & Cynader, 1999). Estudos prévios têm revelado que alcalóides da P.
juliflora induzem a ativação de células gliais (Hughes et al., 2006; Silva et al., 2007), o que
poderia estar contribuindo para a sobrevida dos neurônios expostos ao meio condicionado de
culturas de células gliais, enriquecidas de astrócitos, expostas ao ETA. Por outro lado, o
estudo desenvolvido por Silva et al. (2007) igualmente demonstrou que o tratamento de
culturas primárias de astrócitos com a F32 induz produção de NO, sugerindo o envolvimento
deste neuromediador no mecanismo de neurotoxicidade da P. juliflora. Este fenômeno
poderia de certa forma estar relacionado à incapacidade das células gliais em proteger a
sobrevida de neurônios em culturas à exposição da F32, para confirmação desta hipótese
realizamos dosagem de NO em co-cultura tratada com ETA e F32.
 38

Efeitos de ETA e fração citotóxica na reatividade glial e na morfologia de neurônio e

células gliais.

Em condições controle, o meio sobrenadante das co-culturas tratadas com o veículo DMSO à
0.01% apresentaram níveis muito baixos de nitrito: 0,41 ± 0,02 mM. O meio sobrenadante das
culturas tratadas com 1,5 e 3 µg/mL de ETA e 1,5 µg/mL de F32 apresentou um pequeno
aumento na concentração de nitrito, com valores de 1,19 ± 0,03; 1,26 ± 0,01 e 2,22 ± 0,01
respectivamente, contudo esta alteração não foi estatisticamente significante. No entanto, a
exposição das células a 3µg/mL de F32 induziu um aumento significativo nos níveis de nitrito
no meio de cultura que atingiram 7,42 ± 0,03 mM, que pode estar associado à permanência da
toxicidade neuronal desta fração de alcalóides após a passagem por células gliais (Figura 11).

8
*
7

6
NaNO2 [mM]

5
ETA
4
F32
3

0
D MS O 1 ,5 ug /m L 3u g /m L

Figura 11: Dosagem de óxido nítrico em co-cultura em condições controle (veículo

DMSO 0,01%) ou expostas ao ETA e F32 (1,5 e 3 μg/mL), durante um período de 24 h.
Resultados expressos em concentração de nitrato de sódio do meio de cultura. * P < 0,05
comparado o grupo tratado com o grupo controle (DMSO 0,01%).
 39

Nossos dados corroboram com achados de Silva et al. (2007) que descrevem um aumento de
nitrito no meio de cultivo de células gliais após exposição das mesmas a 3µg/mL de F32.
Estes autores evidenciaram igualmente a ativação e proliferação de microglia, que poderia
estar relacionada à indução de NO. Estudo de Gao et al. (2002) demonstrou que baixa
concentração de lipopolissacarídeo induz ativação microglial e produção de óxido nítrico
(NO). O NO é um radical livre de vida curta que medeia uma variedade de funções
biológicas, incluindo homeostasia vascular e neurotransmissão, mas que, no entanto, pode se
combinar com o peróxido ou o superóxido de hidrogênio, produzindo radicais peroxinitritos
altamente tóxicos (Dawson & Snyder, 1994; Manning et al., 2001; Abbas et al., 2003). Um
estudo sobre ativação desta população de células no sistema de co-cultura e sua relação como
a produção de NO e outros fatores neurotóxicos deverá contribuir para esclarecer a
neurotoxicidade de alcalóides de P. juliflora presentes na F32.

A coloração de Rosenfeld em co-cultura sob condições controle (meio de cultura e DMSO

0,01%, Figura 12A) permitiu a visualização de uma monocamada de astrócitos com núcleos
bem definidos por uma coloração mais escura (roxa), citoplasma em formato poligonal; por
cima da monocamada de astrócitos, a presença de neurônios dispersos, apresentando corpo
celular esferoidal e refringente emitindo dois ou mais prolongamentos (neuritos), e núcleo
compacto (seta). Esta morfologia foi também vista em co-cultura tratada com ETA 1,5μg/mL,
porém com os astrócitos apresentando vacuolização citopasmática (estrela), também
evidenciados nos neurônios (corpo celular e axônio) (Figura 12B). Esta vacualização foi mais
extensa nas co-culturas tratadas com ETA 3 μg/mL, que também apresentaram redução no
tamanho dos neuritos e modificação na morfologia dos astróctios, com perda de seu aspecto
tipicamente estrelado (Figura 12C). Em tratamentos com F32 1,5 μg/mL, foram visualizados
astrócitos apresentando contração do corpo celular e emissão de prolongamentos espessos, e
neurônio alterando a conformação do corpo celular de esférica para uma forma alongada, bem
como encurtamento de neuritos, além de extensa vaculização em ambas populações de células
(Figura 12D). A redução de células aderidas e a vacualização celular foi mais intensa em co-
cultura tratada com F32 3μg/mL, onde também foi visualizada a presença de astrócitos com a
conformação indefinida e outros com formato bipolar (Figura 12E).
 40

10 µm

B D

* *
*
*

10 µm 10 µm

C E

10 µm 1 0 µm

Figura 12 - Fotomicrografia óptica de co-culturas coradas por método estabelecido por

Rosenfeld (1967). Em A, condições controle (veículo DMSO 0,01%). Em B, expostas a
1,5 µg/mL de ETA. Em C, expostas a 3 µg/mL de ETA. Em D, expostas a 1,5 µg/mL de
F32. Em E, expostas a 3 µg/mL, durante um período de 24 h. Seta indica núcleo de
neurônios. Estrelas indicam vacúolos citoplasmáticos. Obj. X 20.
 41

A presença de vacúolos em corpos de neurônios e axônios tem sido descrita na literatura

como alteração histológica presente em intoxicações de animais por plantas neurotóxicas, que
apresentam alcalóides como princípio ativo (Furlan et al., 2008) dentre elas a P. juliflora
(Figueiredo et al 1995; Tabosa et al., 2000; Tabosa et al., 2006). Um importante mecanismo
para a formação desses vacúolos é a inibição das enzimas alfa-manosidase lisossômica e
alfamanosidase II do complexo de Golgi, que causa acúmulo de oligossacarídeos nos
lisossomos (Furlan et al., 2008). Um outro mecanismo para a formação de vacúolos é a
inibição de β-glicosidase. Esta atividade tem sido descrita como efeito da ação dos alcalóides
juliprosina e juliprosopina (Tapia et al., 2000). As alterações fenotípicas visualizadas em
astrócitos tratados corroboram com achados de Hughes et al. (2006) que os caracterizam
como reatividade glial induzida pelo extrato bruto de alcalóides dos frutos da P. juliflora.

A figura 13 revela que através da imunocitoquímica para GFAP, proteína marcadora de

astrócitos, e da imunocitoquimíca para β-III-tubulina, proteína marcadora de neurônios, em
co-culturas nas condições de controle (meio de cultura), evidenciou-se uma monocamada de
astrócitos com fenótipo poligonal e neurônios expressando a β-III-tubulina em todo o corpo
celular e nos prolongamentos citoplasmáticos de forma homogênea e ininterrupta (seta).

A B

10 µm 10 µm

Figura 13 – Fotomicrografia em fluorescência de co-culturas em condições controle

(meio de cultura) marcadas por imunocitoquímica para GFAP, em A. E
imunocitoquímica para β-III-tubulina, em B. A seta indica neurônio expressando a β-
III-tubulina. Obj. X 20.
 42

A marcação imunocitoquímica para GFAP e β-III-tubulina em co-culturas revelou que não

houve alterações fenotípicas em astrócitos e neurônios tratados por 24 horas na condição
controle (DMSO 0,01%) (Figura (14 A e A’), quando comparados com as células expostas
apenas ao meio de cultura (Figura 13). Também foi revelado que após 24 h de tratamento de
co-cultura com 1,5 μg/mL de ETA a monocamada de astrócitos apresentou um aumento na
expressão de GFAP, no entanto alguns neurônios apresentando interrupções na expressão da
β-III-tubulina nos neuritos (Figura 14 B’, estrela). Por outro lado, nas culturas tratadas com 3
μg/mL ETA ou 1,5 e 3 μg/mL F32 por 24 horas (Figura 14 C-E), os astrócitos GFAP
positivos foram raros, e apresentaram a proteína expressa na forma heterogênea. Nestas
condições foram visualizado nos neurônios agrupados, uma expressão da β-III-tubulina
completamente desestruturada, e quase ausente nas culturas expostas a 3µg/mL F32 (Figura
14 E’).

Estudos prévios revelaram que juntamente às alterações fenotípicas induzidas pela P. juliflora
em células gliais, há um aumento da expressão da proteína GFAP (Hughes et. al., 2006; Silva
et al., 2007). A literatura descreve que astrócitos reativos são capazes de produzir fatores
tróficos que prejudicam o crescimento axonal, assim como revelam uma relação inversa entre
a expressão de GFAP com a laminina, que é o principal componente da matrix extracelular
usado como substrato para o desenvolvimento axonal (Costa et al., 2002; Tardy, 2002). Esses
relatos esclarecem os dados de redução da expressão da β-III-tubulina visualizados nas
análises por imunocitoquímica das co-culturas tratadas com 1,5 µg/mL de ETA e F32.
 43

A A’

10 µm 10 µm

B B’

10 µm * 10 µm

C C’

10 µm 10 µm

D D’

10 µm 10 µm

E’ E’

10 µm 10 µm

Figura 14. Fotomicrografia em fluorescência de co-culturas em condições controle

(DMSO 0,01%) e após 24 h de tratamento com ETA ou F32 (1,5 e 3µg/mL) marcadas
por imunocitoquímica para GFAP (A, B, C, D, E) ou para β-III-tubulina (A’, B’, C’, D’,
E’). Em A e A’, co-culturas em condições controle (DMSO 0,01%). Em B e B’, co-
culturas tratadas com ETA 1,5 µg/mL. Em C e C’, co-culturas tratadas com ETA
3µg/mL. Em D e D’, co-culturas tratadas com 1,5µg/mL de F32. Em E e E’ co-culturas
tratadas com 3µg/mL de F32. As estrelas indicam interrupçãoes na expressão da β-III-
tubulina. Obj. X 20.
 44

Concluímos com este estudo que compostos alcaloidais extraídos de folhas da P. juliflora
agem diretamente em neurônios corticais induzindo redução da atividade mitocondrial, que é
inibida pela presença de células gliais ativadas pelos mesmos. No entanto, esta proteção não é
suficiente para inibir o surgimento de vacúolos neuronais, e desestruturação de proteína
estrutural β-III- tubulina. Os estudos de citotoxicidade revelaram igualmente a fração F32,
como a de maior potencial citotóxico e contribuinte para o aumento no nível de NO quando
comparada com o efeito das demais frações de alcalóides da P. juliflora em células do sistema
nervoso central. Como as análises cromatográficas revelaram que a fração F32 possa se tratar
de um composto puro, somado ao fato de que claramente, pelo conjunto de experimentos
realizados e resultados obtidos, esta fração também, induz a ativação de células gliais,
podemos ainda sugerir que entre os componentes biologicamente ativos, presentes no ETA de
folhas da P. juliflora, aquele pertencente à fração F32 seria o principal responsável pela
citotoxicidade em neurônios e reatividade das células gliais revelado em tratamentos com o
ETA.
 45

4.5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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 48

5. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Sabe-se que o efeito em resposta aos insultos neuronais no sistema nervoso central são
modulados pela interação entre o neurônio e as células gliais, uma vez que as células gliais
são as responsáveis pelo desenvolvimento, homeostasia e detoxificação do SNC. Estas, por
sua vez, cultivadas in vitro, constituem modelos confiáveis e elegíveis para estudos
neurotóxicos (Cookson & Pentreath, 1994; Cookson et al., 1995). Células gliais podem
interagir com neurônios quando cultivadas em co-culturas diretas, plaqueando neurônios
dissociados numa superfície contendo uma monocamada de células gliais (Faria et al., 2006),
ou por método sem contato usando meio condicionado (Wang & Cynader, 1999).

Nossos estudos a respeito dos efeitos neurotóxicos de P. juliflora foram realizados com a
finalidade de estudar in vitro a citotoxicidade das moléculas de alcalóides da P. juliflora em
células do SNC, mediante modificações morfológicas e bioquímicas induzidas em culturas
primárias de células neuronais e co-culturas de neurônios/células gliais. Determinamos os
efeitos in vitro destas moléculas na sobrevida neuronal e na ativação de células gliais bem
como observamos a influência da interação entre neurônios e células gliais na resposta ao
insulto gerado por alcalóides da P. juliflora. Foi possível assim, observar que o conjunto de
alcalóides extraídos da P. juliflora, bem como de suas frações isoladas agem diretamente
sobre neurônios induzindo citotoxicidade em concentrações subtóxicas para as células gliais,
que por outro lado são capazes de induzir astrogliose. Também, foi evidenciado que as células
gliais dão suporte à sobrevida neuronal após a exposição desses alcalóides, ainda que tenham
sido visualizados vacúolos em neurônios e células gliais expostas aos acalóides. Esses
achados contribuem para confirmar a hipótese levantada em estudos prévios, também
realizados no Laboratório de Neuroquímica do ICS-UFBA (LabNq), que sugerem que a
reação glial induzida em cultura por alcalóides de P. juliflora teria a finalidade de proteger as
células do sistema nervoso central, especialmente, os neurônios de danos mais graves. Mais
estudos sobre a ativação glial e interação entre neurônio e células gliais devem ser realizados,
com a finalidade de elucidar mecanismos pelos quais as células gliais podem atuar seja na
proteção neuronal seja na toxicidade de alcalóides de P. juliflora.
 49

Finalmente, considerando que os efeitos observados em intoxicações experimentais in vivo

revelaram lesões em neurônios e reatividade glial e estes efeitos foram também evidenciados
no nosso modelo de estudo in vitro, sugerimos que as co-culturas de neurônios/células gliais
consistem um bom modelo de estudo de agentes neurotóxicos. No entanto, faz-se necessária a
caracterização da ativação das células gliais (astrócitos e microglia) e mesmo a caracterização
do componente alcaloidal da F32, que apresentou em nossos estudos alto potencial
neurotóxico, para trazermos maiores esclarecimentos sobre o mecanismo de ação e inativação
de alcalóides de P. juliflora em células do SNC.
 50

6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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7- ANEXOS

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PUBLICAÇÕES EM CONRESSOS

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XXXVII Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular/
Reunião Anual da SBBq e XI Congress of Pan American Society of Biochemistry and
Molecular Biology, 2008.