Analytical methods for determination of mycotoxins: A review Metode de analiză pentru

determinarea de micotoxine: O trecere în revistă

Nicholas W. Turner a , Sreenath Subrahmanyam b , Nicholas W. Turner o , Subrahmanyam

Sreenath b , , , and Sergey A. Piletsky b şi Sergey A. Piletsky b
a
Centre for Organic Electronics, University of Newcastle, Callaghan, NSW 2308, Australia unui
Centru de Electronica organice, Universitatea din Newcastle, Callaghan, NSW 2308, Australia
b
Cranfield Biotechnology Centre, Cranfield Health, Cranfield University, Bedfordshire, MK 43
OAL, United Kingdom b Cranfield Centrul de Biotehnologie, Sanatate Cranfield, Universitatea
Cranfield, Bedfordshire, MK 43 OAL, Regatul Unit

Received 7 August 2008; A primit 7 august 2008;

revised 3 November 2008; 3 revizuit noiembrie 2008;
accepted 6 November 2008. Acceptăm 6 noiembrie 2008.
Available online 14 November 2008. Disponibile online 14 noiembrie 2008.

Abstract Abstract

Mycotoxins are small (MW Micotoxinele sunt mici (MW 700), toxic chemical products
formed as secondary metabolites by a few fungal species that readily colonise crops and
contaminate them with toxins in the field or after harvest. 700), produse chimice toxice format ca
metaboliţi secundari de câteva specii fungice, care colonizeaza uşor culturilor şi a le contamina
cu toxine în domeniul sau după recoltare. Ochratoxins and Aflatoxins are mycotoxins of major
significance and hence there has been significant research on broad range of analytical and
detection techniques that could be useful and practical. Ochratoxins şi Aflatoxinele sunt
micotoxine de importanţă majoră şi, prin urmare nu a fost de cercetare semnificativ asupra gamă
largă de tehnici de analiză şi de detectare care ar putea fi utile şi practice. Due to the variety of
structures of these toxins, it is impossible to use one standard technique for analysis and/or
detection. Având în vedere varietatea structurilor de aceste toxine, este imposibil să se utilizeze o
tehnică standard pentru analiza şi / sau de detectare. Practical requirements for high-sensitivity
analysis and the need for a specialist laboratory setting create challenges for routine analysis.
cerinţele practice pentru analiza de înaltă sensibilitate şi nevoia de un laborator de specialitate de
stabilire a crea provocări pentru analize de rutină. Several existing analytical techniques, which
offer flexible and broad-based methods of analysis and in some cases detection, have been
discussed in this manuscript. Mai multe tehnici analitice existente, care oferă modalităţi flexibile
şi ample de analiză şi, în unele cazuri de detectare, au fost discutate în acest manuscris. There are
a number of methods used, of which many are lab-based, but to our knowledge there seems to be
no single technique that stands out above the rest, although analytical liquid chromatography,
commonly linked with mass spectroscopy is likely to be popular. Există o serie de metode
utilizate, dintre care mulţi sunt de laborator pe baza, dar la cunostintele noastre nu pare să existe
nici o tehnica singur care iese în evidenţă mai sus de restul, deşi analitică cromatografie de
lichid, de obicei legată de spectroscopie de masă este probabil să fie popular. This review
manuscript discusses (a) sample pre-treatment methods such as liquid–liquid extraction (LLE),
supercritical fluid extraction (SFE), solid phase extraction (SPE), (b) separation methods such as
(TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), and
capillary electrophoresis (CE) and (c) others such as ELISA. Acest manuscris discută
reexaminare (a) proba-metode de tratament, cum ar fi pre-solvent de extracţie lichid (LLE),
extracţia lichid supercritice (SFE), fază solidă de extracţie (SPE), (b) metode de separare, cum ar
fi (TLC), lichid de înaltă performanţă (HPLC), gaz (cromatografie GC), cromatografie şi
electroforeză capilară (CE) şi (c), altele, cum ar fi ELISA. Further currents trends, advantages
and disadvantages and future prospects of these methods have been discussed. Mai mult
tendinţele curenţi, avantajele şi dezavantajele şi perspectivele de viitor ale acestor metode au fost
discutate.

Keywords: Mycotoxins; Aflatoxin; Ochratoxin; High performance liquid chromatography;

Liquid–liquid extraction; Gas chromatography; Thin layer chromatography; Enzyme linked
immunosorbent assay Cuvinte cheie: micotoxine; Aflatoxina, Ochratoxina, lichid cromatografie
de înaltă performanţă;-solvent de extracţie lichid, gaz cromatografie, cromatografie în strat
subţire; Enzyme legate de testul immunosorbent

Abbreviations: APCI, atmospheric pressure chemical ionization; BEN, Balkan Endemic

Nephropathy; C-18, octadecylsilane column; CCα, decision limit [in food quality analysis]; CCβ,
decision capability [in food quality analysis]; CE, capillary electrophoresis; CI-ELISA,
competitive indirect enzyme linked immunosorbent assay; CO 2 , carbon dioxide; DAD, diode
array detection; DNA, deoxyribonucleic acid; ECD, electron capture detection; ELISA, enzyme
linked immunosorbent assay; ELSD, evaporative laser scattering detector; FAO, food and
agricultural organisation; FI, flame ionisation; FID, flame ionisation detector; FD, fluorescence
detection; FTIR, fourier transform infrared spectroscopy; GC, gas chromatography; GC–ECD,
gas chromatography coupled with electron capture detection; GC–MS, gas chromatography–
mass spectroscopy; HPLC, high performance liquid chromatography; HPLC–DAD, high
performance liquid chromatography coupled with diode array detection; HPLC–ELSD, HPLC
coupled with an evaporative laser scattering detector; HPLC–FD, high performance liquid
chromatography coupled with fluorescence detection; HT-2, HT-2 toxin; IA, immuno affinity;
IAC, immuno affinity columns; IARC, International Agency for Research on Cancer; IgG,
antibody; LC–MS, liquid chromatography–mass spectrometry; LLC, liquid–liquid
chromatography; LLE, liquid–liquid extractioin; LOD, limits of detection; LOQ, limits of
quantification; MAbs, monoclonal antibodies; McAb, monoclonal antibody; MEECK,
microemulsion electrokinetic chromatography; MIP, molecularly imprinted polymers; MS, mass
spectroscopy; MW, molecular weight; nano-RP-HPLC–ESI–MS, nano-reversed-phase HPLC–
electrospray ionization–mass spectrometry; NICI, negative ion chemical ionisation; NIP, non-
imprinted polymer; OPA, o -phthaldialdehyde; PCA, principal component analysis; pH, power of
hydrogen; PLS, partial least squares; ppb, parts per billion; ppm, parts per million; RNA,
ribonucleic acid; RP, reverse phase; SAX, strong anion exchange; SFE, supercritical fluid
extraction; SIIA, sequential injection immunoassay; SPE, solid phase extraction; SPME, solid
phase microextraction; SPME–LC–MS/MS, solid phase micro extraction- coupled with liquid
chromatography–mass spectroscopy–mass spectroscopy; SPR, surface plasmon resonance; T-2,
T-2 toxin; TLC, thin layer chromatography; TRL, time resolved luminescence; WHO, World
Health Organisation; 15-ADON, 15-acetyl-deoxynivalenol; 3-ADON, 3-acetyl-deoxynivalenol
aka Vomitoxin; AFB-1, Aflatoxin B1; AFM1, Aflatoxin-M1; AFT, Aflatoxin; BEA,
beauvericin; CIT, citrinin; CPZ, cyclopiazonic acid; DAS, diacetoxyscirpenol; DDB, 1,2-
diamino-4,5-dichlorobenzene; DES, diethylstilbestrol; DHES, dihydroergosine; DIS,
diphenylindenone sulphonyl ester of trichothecene mycotoxins; DON, deoxynivalenol; FB1,
fuminosin B1; FB2, fuminosin B2; MPA, mycophenolic acid; NIV, nivalenol; OTA, ochratoxin;
PAT, patulin; STE, sterigmatocystin; TRC, trichothecenes; ZEA, zearalone; ZEL, zearalenol;
Zeranol, zearalanol; ZON, zearalanone Abrevieri: APCI, presiunea atmosferică ionizare
chimice; BEN, endemice balcanice Nephropathy; C-18, coloana octadecylsilane; CCα, limita de
decizie [în analiza calităţii produselor alimentare]; CCβ, capacitatea de decizie [în analiza
calităţii produselor alimentare]; CE, electroforeza capilara; CI -ELISA, indirect enzimatic
competitive legate de testul immunosorbent; de CO 2, dioxid de carbon; DAD, detectarea de
diode; ADN-ului, acidul dezoxiribonucleic, CED, de detectare a captură de electroni; ELISA,
enzimă legate de testul immunosorbent; eLSD, împrăştierea laser detector de evaporare; FAO,
produse alimentare şi organizarea agricole; FI, ionizare cu flacără; FID, detector de ionizare cu
flacără; FD, detectie fluorescenta, FTIR, transformata Fourier spectroscopie în infraroşu; GC,
cromatografie de gaz; GC-ECD, gaz-cromatografia cuplată cu detecţie prin captură de electroni;
GC-MS, cromatografie de gaz -masa spectroscopie; HPLC, cromatografie lichidă de înaltă
performanţă; HPLC-DAD, cromatografia lichidă de înaltă performanţă cuplată cu detecţie cu
grup de diode; HPLC-eLSD, HPLC cuplată cu un detector de laser prin evaporare imprastiere;
HPLC-FD, cromatografia lichidă de înaltă performanţă cuplată cu detecţie prin fluorescenţă ;
HT-2, toxina HT-2; IA, afinitate imuno; IAC, coloane imuno afinitate; IARC, Agenţia
Internaţională de Cercetări asupra Cancerului, IgG, anticorpi; LC-MS, lichid cromatografie,
spectrometrie de masă; LLC, cromatografia lichid-lichid ; LLE, extractioin lichid-lichid; LOD,
limitele de detectare; LOQ, limitele de cuantificare; MAK, MAB, anticorpi monoclonali; McAb,
anticorp monoclonal; MEECK, cromatografie microemulsie electrocinetica; PMI, molecular
polimeri imprimat; MS, spectroscopie de masă; MW, moleculară greutate; nano-RP-HPLC-ESI-
MS, nano-fază inversă HPLC-ionizare electrospray-spectrometrie de masă; Nici, ionizare negativ
ioni chimice; PNI, non-imprimate polimer; OPA, o-phthaldialdehyde; APC, analiza
componentelor principale ; pH-ul, puterea de hidrogen; PLS, mici pătrate parţiale; ppb, părţi pe
miliard, ppm, părţi per milion, ARN, acidul ribonucleic; RP, fază inversă; SAX, schimbătoare de
anioni puternic; SFE, extracţia de fluide supercritice; SIIA, secvenţial imunodozarea de injectare;
extracţie SPE, fază solidă; SPME, microextraction fază solidă; SPME-LC-MS/MS, fază solidă
micro-extracţie cuplat cu lichid cromatografie spectroscopie de mass-spectroscopie-masă; SPR,
plasmonilor rezonanta suprafaţă; T-2, T -2 toxina; TLC, cromatografie în strat subţire; TRL, timp
rezolvat luminescenţă; OMS, Organizaţia Mondială a Sănătăţii, 15-Adon, 15-acetil-
deoxinivalenol, 3-Adon, acetil-deoxinivalenol aka Vomitoxin-3; AFB-1, Aflatoxina B1 ; AFM1,
Aflatoxina-M1; AFT, Aflatoxina; BEA, beauvericin; CIT, citrinin; CPZ, acid cyclopiazonic;
DAS, diacetoxyscirpenol; DDB, 1,2-diamino-4 ,5-diclorbenzen; DES, dietilstilbestrol; DHES,
dihydroergosine; DIS, ester diphenylindenone sulphonyl de micotoxine trichothecene, DON,
deoxinivalenol; FB1, fuminosin B1, B2 FB2, fuminosin; MPA, acidul micofenolic, NIV,
nivalenol; OTA, ochratoxina; patulină PAT,; sterigmatocystin STE,; TRC, tricotecene; ZEA,
zearalone; Zel, zearalenol; zeranol, zearalanol; Zon, zearalanone

Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC) este o tehnică de laborator

foarte utilizată, fiind introdusă ca metodă sigura de control a produselor alimentare în
legislaţia  mai multor state. Dozarea diversilor compuşi din alimente implică tehnici
preparative, separarea cromatografică şi detectia (pe baza indicelui de refractie, prin
spectroscopie UV/VIS, fluorimetric, conductometric etc.) Au fost stabilite proceduri
pentru numeroase clase de compuşi organici. În prezent se foloseşte pentru:

           identificarea şi dozarea glucidelor. Prin metoda HPLC se pot determina simultan
monoglucide (glucoză, fructoză etc.), diglucide (zaharoză, maltoză etc.), precum şi
oligozaharuri. Astfel, determinarea simultană a glucozei, fructozei şi zaharozei permite
detectarea adăugării ilegale de zahăr invertit în produsele alimentare. Metoda poate fi
folosită pentru determinarea lactozei din laptele praf degresat, astfel putându-se evalua
indirect conţinutul de grăsime. Se foloseşte la determinarea rafinozei şi stahiozei,
prezenţa lor indicând adăugarea de făină de soia în preparatele de carne. Determinarea
prezenţei unor oligozaharuri permite  selectarea surselor de compuşi cu proprietăţi
prebiotice necesari dezvoltării unei game importante  şi interesante de alimente
funcţionale şi anume probioticele.

           determinarea compoziţională a lipidelor. Prin această metodă se poate

determina natura şi cantitatea procentuală de acizi graşi saturaţi şi nesaturaţi din uleiuri
sau grăsimi. De asemenea, analiza cromatografică este utilă pentru determinarea
conţinutului de acid linoleic conjugat (CLA) în produsele de origine animală (carne de
vită, lapte, unt ).  Acidul linoleic conjugat  este în ultimul timp în atenţia nutriţioniştilor
datorită proprietăţilor sale benefice în bolile cardiovasculare, maligne, în stimularea
sistemului imunitar.

           compoziţia în aminoacizi. Tehnica HPLC este cea mai bună metodă de separare
a aminoacizilor din alimente şi, în special, a aminoacizilor esenţiali.  Investigarea
prezenţei şi proporţiei aminoacizilor esenţiali este obligatorie pentru evaluarea calităţilor
nutriţionale ale proteinelor din diverse alimente mai ales, ale proteinelor din alimentele
obţinute prin utilizarea unor proteine de  diferite calităţi  (ex. introducerea derivatelor
proteice din soia, sau a cărnii dezosate mecanic – MDM - în preparatele de carne.).
Totodată, folosind HPLC se poate determina autenticitatea şi tipul unor proteine. Astfel,
concentraţia şi proporţia relativă a aminoacizilor sunt două criterii după care se poate
identifica tipul de proteină dintr-un preparat de carne.  Această determinare se bazează
pe faptul că există mici variaţii ale cantităţilor de L-aminoacizi din diverse surse proteice.

           determinarea tipului si cantitatii de proteine, a diferitelor peptide

           dozarea  vitaminelor: hidrosolubile şi liposolubile, alte substante cu actiune

vitaminica

           alte tipuri de substanţe. HPLC este o tehnică utilă pentru determinarea
componenţilor minori şi a metaboliţilor. Se pot determina: coloranţii din sucurile de
fructe sau vin, diacetilul din unt, flavonoidele din sucurile  de fructe, antioxidanţii din
vegetale etc.

Tehnicile spectrofotometrice sunt indispensabile pentru dozarea compuşilor care absorb

în UV (antioxidanţi, vitamine, aminoacizi aromatici, acizi nucleici, nucleotide etc.). Pe
baza indicilor de refracţie se detectează glucide (xiloză, fructoză, glucoză, manoză,
zaharoză, maltoză, lactoză, maltotrioză etc), acizi organici (citric, tartric, malic, lactic,
acetic etc.), metanol, etanol etc.

      Analiză gaz cromatografică, deosebit de utilă, în special, pentru:

-          determinarea falsurilor în alimentele bogate în carbohidraţi, precum sucuri de fructe

şi miere, prin stabilirea exactă a profilului glucidic;

-          amprentarea băuturilor şi a produselor lactate, ca dovadă a autenticităţii şi originii

controlate.

      Analize microbiologice: Leuconostoc mesenteroides (calitatea zaharului),

Bifidobacterium sp. (produse lactate functionale) etc.
      Etichetarea nutriţională.

Proiectul propus nu se va incheia o data cu expirarea celor 18 luni alocate.

Echipamentele achizitionate prin acest program vor susţine diversificarea gamei de
analize acreditate RENAR, analize care vor deveni obligatorii pentru etichetarea
nutriţională, libera circulaţie a alimentelor în spaţiul UE şi pentru controlul alimentelor
importate.   

Etuva Stericell cu
înregistrator

- convecţie forţată;
-  control digital si display
al temperaturii si timpului;
- camera de
preamestecare din inox
pentru omogenizarea
rapida a temperaturii in
interiorul etuvei;
- timp foarte scurt de
revenire la temperatura
setată (după deschiderea
uşii timp de un minut
revenirea la 100ºC se
face in
10 minute);
- temperatura reglabila
intre: ambiental +5ºC si
250ºC;  
- stabilitate termica: ±
 
0,25ºC;
- omogenitate termica: ±  

2% din temperatura de
lucru;
- permite 12 cicluri/h.
Autoclave AE 75 DRY cu
înregistrator
- model vertical;
- capacitate 75 L;
- autoclavă complet
automată, cu posibilitate
de alimentare automată
cu apă la începutul
operaţiei de sterilizare,
de eliminare a apei la
sfârşitul programului de
sterilizare, de lucru la vid;
- posibilitatea uscării
solidelor sterilizate;
- înregistrarea şi tipărirea
condiţiile de lucru
(temperatura, presiune,
timp) şi a modului de
lucru;
- domeniul de
temperatură:
105 - 134 °C;
- timp de sterilizare
selectabil între: 1 - 99
minute;
- timp de uscare
selectabil între:
1 - 60 minute;
- posibilitate de reglare a
presiunii între 0,2 - 2 bar;
- capacitate rezervorului
cu apă:
30 L;
- ciclu automat de vidare,
purjare şi uscare;
- permite eliminarea
automată a aerului din
interior la începutul
sterilizării;
- prevăzută cu filtru
interior de vid;
- indicator pentru
închiderea corectă a
capacului;
- capac izolat termic
pentru protecţia
operatorului;
- procesele de sterilizare
si uscare controlate de un
microprocesor;
- permite trei moduri de
operare: sterilizare
lichide, sterilizare solide,
sterilizare solide cu
uscare;
- 9 programe în memorie.
Instalaţie HPLC care
conţine:

1. sistem gradient binar

de înaltă presiune

2. coloane
cromatografice pentru
detecţia următorilor
compuşi:

 amine biogene –
coloana Nucleosil
100-5 C 18
 hormoni de
creştere – coloană
şi precoloană TSK-
GEL Carbon
500/TSK-GEL
ODS-80 TM
 vitamine
hidrosolubile –
coloană Vydac
201SP 54, C18
5µm
 vitamine
liposolubile –
coloană Vydac
201TP 54, C18
 aditivi – coloană
Nucleosil 100-3 C
18

3. detector fluorescenţă
Unitate pentru determinarea fibrelor alimentare din
alimente conform metodei AOAC 985.29
1. Echipament de filtrare pentru
determinarea fibrelor din alimente
prin metoda enzimatica AOAC-
dozare de celuloze,
hemiceluloze, lignine, pectine,
gume ca fibre brute, ADF, NDF,
fibre totale
 2.  Digestor enzimatic

Unitatea de termostatare are

următoarele caracteristici
tehnice:

- cap de încălzire imersat

- agitator magnetic cu 6 locuri

- control precis al temperaturii

pe parcursul digestiei enzimatice

- magneţi pentru agitare.

Pipete automate

- piston rezistent (inox sau

teflon pentru pipetele de 2 si 20
µl, ceramic
 pentru 200 si 5000 µl);

- modificare lejera si
rapida a volumului,
precizie înaltă a reglării;

- afişare numerică, vizibilă

a volumului;

- sistem de blocare a
butonului de reglare
volum, pentru evitarea
modificării accidentale a
volumului;

- certificat de calibrare cu
posibilitatea recalibrării de
către utilizator;

- sistem pentru ejecţia

vârfului din materiale
necorodabile;

- compatibilitate cu vârfuri
de diferite tipuri;

- autoclavabile şi
rezistente la radiaţii UV;

- compatibile cu diverse
soluţii de pipetat.
  Generator de gaze

Generator de azot / aer de înaltă

puritate:

- puritate azot: >99,999%;

- conţinut oxigen in azot: < 10

ppm;

- debit azot: 600 cm3/min.;

- debit aer: 1500 cm3/min.;

- presiune: 5 bar (72.5 psi);

- prevăzut cu compresor intern;

- calitate aer: in conformitate cu

ISO 8573.1, Class 1.2.1;
 Generator de hidrogen de înaltă
puritate:

- puritate: >99,99999%;

- debit: 160 cm3/ min.;

- presiune: 0 - 7 bar (0 - 100 psi);

- prevăzut cu filtre pentru

prevenirea pătrunderii în sistem a
hidrocarburilor din aer;

- prevăzut cu sistem de detecţie

a pierderilor de hidrogen;

- sistem de avertizare sonoră a

creşterii conductivităţii apei şi
scăderea calităţii acesteia;

- sistem de avertizare sonoră a

scăderii nivelului de apa.

Sistem Real Time PCR

Bio Rad

  Centrifuga cu refrigerare Mikro

22R Hettich

- viteza variabila pana la 14000

 rot/min, 20800xg;

- temperatura de lucru: -4 -
40°C;

- programabila, cu scriere
protejata;

- 18 poziţii pentru tuburi de

capacitate 2 si 1,5 ml;

- recunoaştere automată a
rotorului/sensului de rotire;

- 10 viteze de accelerare şi
frânare;

- buton Short Spin cu viteza

reglabilă;

- control digital timp/

temperatură/ viteză.
Luminometru portabil
Hy Lite

- dozare luciferază,
fosfatază alcalină, hGH,
ATP;

- bio- şi chemo-
luminiscenţă;

- auto-injector integrat, 50-

200 μl, şi cu posibilitate de
injectare manuală;

- sensibilitate: 0,1 pg de
ATP;
 - domeniu de măsurare
până la 106 RLU;

- tuburi de măsurare Ø 12
x 47 mm;

- posibilitate de memorare
a datelor şi imprimantă
portabilă dedicată.
  Software Chrom-card 32 BIT
Laptop DELL Latitudine
 
D820
  Calculatoare IBM
 

© 2007 CENTRU BIAA. All rights reserved.

Built with XHTML and CSS that validates. WEBDESIGN BY ALLEX RADU.