Guía Nº 4

SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

Objetivos:

- Comprender los conceptos de siembra y cultivo de

microorganismos
- Aprender las técnicas asépticas de siembra de microorganismos
- Realizar siembras en medios líquidos y sólidos aplicando las
técnicas aprendidas

1. Concepto de siembra:

En Microbiología se entiende como siembra el proceso mediante el

cual se deposita una pequeña cantidad de microorganismos
(inóculo) en un medio de cultivo estéril. El inóculo puede proceder
de una muestra o de un cultivo previo. (al crecimiento de
microorganismos obtenido, se le denomina cultivo)
La finalidad de la siembra es permitir la multiplicación de los
microorganismos, al proporcionarles las condiciones óptimas para
su desarrollo, dentro de las cuales, se debe considerar:
temperatura, nutrientes, pH, disponibilidad de oxígeno, entre otros.
La siembra de microorganismos debe llevarse a cabo con
instrumentos y medios previamente esterilizados trabajando
siempre bajo condiciones de asepsia, lograda por medio de un
mechero Bunsen que, debido a las corrientes de convección
verticales que genera, es capaz de crear un ambiente estéril en la
zona inmediatamente alrededor y debajo de la llama.

2 Técnicas de siembra:

a) Siembra de medios líquidos: ésta se realiza en tubos de

ensayo o en matraces. El crecimiento se observa por la turbidez
del medio, por la formación de velo o película superficial, o por
acumulación de microorganismos en el fondo del tubo (Figura 1).
El inóculo se toma con el asa de loop, pipetas o micropipetas. Se
utiliza para el enriquecimiento de microorganismos, algunas
técnicas de recuento, pruebas bioquímicas, etc.
 a b c d

Figura 1: crecimiento de microorganismos en medios de

cultivo líquido a: velo superficial; b: crecimiento en el fondo
del tubo;
c: turbidez en todo el tubo; d: tubo control
b) Siembra en medios sólidos: se realiza en tubos de ensayo o
en placas de Petri, tiene distintos usos, según el objetivo del
cultivo a realizar.

 Siembra por estría en tubos: se utilizan tubos con agar inclinado y

con el asa de loop se siembra sobre la superficie del agar con un
movimiento en zigzag desde el fondo hasta la parte superior del
tubo. Se observa el crecimiento sobre la superficie del agar.
(Figura 2)

Figura 2: siembra por estría en tubo

 Siembra por picadura: se utilizan tubos con agar , y se agrega el

inóculo con el asa en punta. El asa se introduce en el centro del
agar con un solo movimiento. Se observa el crecimiento en la linea
de inoculación. En agar semisólido, se utiliza para la prueba de
movilidad. (Figura 3)
 Figura 3: siembra en picadura en medio semisólido

 Siembra por extensión en placas: consiste en poner un inóculo en

la superficie del agar y luego extenderlo sobre el medio. La
extensión del inóculo se puede hacer con asa de loop, técnica
denominada “siembra en estrías” o el asa de Drygalsky, técnica
denominada “siembra homogénea”

Siembra en estrías: con un asa de loop previamente esterilizada

a la llama del mechero, se deposita un pequeño inóculo y se
extiende, en estrias, sobre un área pequeña de la placa. Se
esteriliza el asa, se enfría en la tapa de la placa y a partir de la
siembra realizada anteriormente, se estría la zona contigua. El
proceso se repite sucesivamente, hasta sembrar en cuatro
zonas (Figura 4). Los microorganismos se adhieren a la
superficie del medio y se multiplican formando colonias. Este
tipo de siembra se utiliza para aislar bacterias y obtener
cultivos puros
 Figura 4: siembra de estrías en placa

Siembra homogénea: se toma un pequeño volumen a partir de un

cultivo o muestra líquida. Generalmente y dependiendo del objetivo
de la siembra, se toman inóculos desde 0,1 a 2ml. Luego se distribuye
homogéneamente sobre el agar con el asa de Drygalsky. Se utiliza
para recuento de microorganismos y como técnica de aislamiento,
previa dilución de la muestra. (Figura 5)

Figura 5: Dilución y siembra homogénea

 Siembra en profundidad: en una placa de Petri se vacía un

pequeño volumen (1 ml) de muestra y a continuación se agrega el
medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y temperado a 45º C. Se
mezclan por rotación suave de la placa. (Figura 6) Los
microorganismos se distribuirán en forma homgénea en el medio
de cultivo, permitiendo, así el desarrollo de colonias separadas en
el agar. Se deja enfriar la placa hasta que solidifique el medio. Esta
técnica se utiliza para determinar el número de bacterias viables,
anerobias facultativas y microaerófilas, presentes en la muestra
 Figura 6: Siembra en profundidad

Las siembras realizadas en placas de Petri, permitirán observar el

crecimiento de los microorganismos a través de la formación de
colonias. Cada colonia se desarrolla a partir de la multiplicación de
una célula, y cada colonia se denomina “Unidad Formadora de
colonia” (UFC). Las colonias pueden diferenciarse de acuerdo a:

• Tamaño: Grande (mayor a 1 mm de diámetro); media ( 1mm de

diámetro); pequeña ( menor a 1 mm de diámetro)
• Elevación: plana, convexa, centro elevado, umbilicada, cóncava
• Forma: circular, filamentosa, irregular, puntiforme, rizoide,
ovalada, fusiforme
• Margen o borde: entero, ondulado, lobulado, dentado,
filamentoso, rizado
• Color: blanco, negra, crema, naranja, etc
• Apariencia de la superficie: brillante, opaca, suave, rugosa,
granular
• Consistencia: observada al tomar la colonia con el asa, puede
ser: cremosa, viscosa, granular
(Figura 7)
 Umbilicada

Figura 7: Características de las colonias

3 Normas generales para realizar siembra de microorganismos

Para trabajar bajo condiciones de asepsia en el laboratorio y mantener la

esterilidad
de los medios de cultivo que serán sembrados, se deben seguir las
siguientes
indicaciones:

1. El trabajo es individual, por lo tanto cada alumno debe disponer de

un mechero
2. Lavarse las manos con agua y jabón desinfectante
3. Desinfectar el área de trabajo con etanol
4. Encender el mechero
5. Dejar al alcance de sus manos el material a utilizar (medios de
cultivo, asas, pipetas, cementerio, etc)
6. Debe flamearse a la llama del mechero la boca de los tubos de
ensayo antes y después de tomar un inóculo
7. Las asas rectas y de loop deben esterilizarse al rojo cada vez que
se utilizan y dejan de utilizar. Antes de tomar el inóculo deben
enfriarse, dejándolas cerca del mechero
8. Las asas de Drygalsky deben esterilizarse por flameado en alcohol
y enfriadas en la tapa de la palca, antes de ser utilizadas. Una vez
utilizadas deben dejarse en alcohol. Para ello, se mantendrán en
un vaso con etanol.
9. La boca y tapa de los pipeteros deben flamearse a la llama del
mechero, cada vez que se saque una pipeta. Las pipetas utilizadas
deben dejarse en un recipiente con solución desinfectante
(cementerio)
10. Para la siembra en placas, éstas deben abrirse frente al mechero,
sin dejar la tapa boca abajo sobre el mesón.
 11. Una vez que la siembra se ha realizado, los tubos y placas serán
incubados bajo condiciones controladas de temperatura. En el caso
de las placas, debe incubarse invertidas.

Trabajo Práctico
“Siembra de microorganismos”

Materiales y equipos:

- Asa de loop
- Asa recta
- Asa de Drygalsky
- Pipetas de 1 ml
- Vasos pp con alcohol
- Etanol
- Mechero
- Gradillas
- Medios de cultivo esterilizados: agar nutritivo inclinado y recto, Agar
nutritivo en placas, caldo nutritivo
- Cepas bacterianas en cultivos líquidos y sólidos

Actividades: Trabajo individual

Cada alumno realizará las siguientes siembras:

- Siembra en medio líquido

- Siembra en picadura
- Siembra por estrías en tubo
- Siembra por estrías en placa
- Siembra homogénea

Resultados:

Los resultados serán observados a la semana siguiente. El alumno

deberá revisar cada siembra realizada y anotar los resultados
obtenidos:

Tipo de siembra Crecimiento Asa utilizada Utilidad de la

técnica
Picadura
Estría en tubo
Medio líquido
Características
de las colonias
(forma, color,
elevación)
Estrias en
placas

Homogénea

Autoevaluación:

1 ¿Por qué debe utilizar el mechero Bunsen durante la siembra?

2. ¿Cómo esteriliza el asa de loop y el asa de Drygalsky?
3 ¿Qué tipo de siembras puede realizar con el asa de loop?
4. Si tuviera que determinar la movilidad de una cepa bacteriana.
a) ¿qué tipo de siembra realizaría?
b) ¿Qué tipo de medio de cultivo utilizaría?
c) Describa paso a paso el procedimiento que realizaría