Nama : Rotua Citra A. L.

G Nama Asisten:
NRP : G34080042 1. Hayatul Fajri
Kelompok : 23 2. Indah Khayati
3. Raisa Auliane S.
4. Muhammad Ihsan

Aplikasi PCR untuk Identifikasi Bakteri dari Hewan

Isolasi DNA Genom Eukariot

Tujuan
Mengisolasi DNA genom prokariot.

Pendahuluan
PCR adalah singkatan dari Polymerase Chain Reaction. Teknik ini merupakan
teknik perbanyakan DNA secara in vitro. Teknik ini memungkinkan adanya
amplifikasi antara dua region DNA yang diketahui, hanya di dalam tabung reaksi,
tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel (in vivo). Dalam sistem kerjanya, PCR
dilandasi oleh struktur DNA. Dalam keadaan nativenya, DNA merupakan double
helix, yang terdiri dari dua buah pita yang berpasangan antiparalel antara satu dengan
yang lain dan berikatan dengan ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen terbentuk antara
basa-basa yang komplementer, yaitu antara basa Adenin (A) dengan Thymine (T),
dan Guanine (G) dengan Cytosin (C). Basa-basa itu terikat dengan molekul gula,
deoksiribosa, dan setiap satu molekul gula berikatan dengan molekul gula melalui
ikatan fosfat (Innis 1990).
Dalam aplikasinya, PCR merupakan metoda referensi untuk mendeteksi
penyakit yang disebabkan oleh adanya kelainan gen; Mengidentifikasi gen yang
menyebabkan kanker atau tumor; Mengidentifikasi DNA dari sample yang sangat
sedikit pada kasus forensik; dan Mempelajari ekspresi gen suatu gen dan
mutagenesis (Bartlett 2003). Dalam bab praktikum ini, aplikasi PCR dimanfaatkan
dalam mengidentifikasi bakteri yang mengandung 16 sRNA dari daging kambing,
tetapi dengan terlebih dahulu mengisolasi DNA genom dari daging kambing
tersebut.
Di antara berbagai teknik yang digunakan, RNA ribosomal paling banyak
digunakan sebagai penanda molekuler. Pada prokaryota terdapat tiga jenis RNA
ribosomal, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA yang
paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA memiliki urutan basa terlalu pendek,
sehingga tidak ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA
memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan
analisis. Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi prosedur baku untuk
menentukan hubungan filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem (Pangastuti
2006).

Metode
0,05 g daging cincang, digerus

Ditambahkan 350 µL buffer lisis (proteinase K)

Diambil 3 µL dari stock 25 mg/mL

Diinkubasi 55oC selama 15’

Disimpan pada es selama 10’

Ditambahkan 150 µL NaCl 6N

Bolak-balik 6-8x

Disimpan pada es selama 5’

Disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10’

Diambil 500 µL supernatant

Ditambahkan 4 µL RNAse A

Diinkubasi pada suhu 37oC selama 15’

Ditambahkan 350 µL isopropanol

Dibolak-balik 6-8x

Disentrifugasi pada 10000rpm selama 20’

Pellet

Ditambahkan EtOH 70%

Disentrifugasi pada 10000rpm selama 5’

Vacuum

Pada pellet ditambahkan 20 µL ddH2O

Elektroforesis
Hasil
M 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23

Keterangan: (kiri-kanan) Marker, pita DNA kelompok 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17,
19, 21, 23. Marker terlihat jelas, pada pita DNA kelompok 1 dan 5 tidak terlihat, pita
DNA kelompok lain terlihat namun agak samar.

Pembahasan
Isolasi DNA bakteri yang diperoleh dapat berupa plasmid atau DNA
kromosom atau keseluruhan genom bakteri. Untuk membedakannya, dilakukan
pengamatan dengan analisis PCR atau kromatografi berdasarkan ukuran dapat
digunakan untuk mengetahuinya (Dare 1994). Hal ini disebabkan karena bakteri
memiliki dua jenis material genetik. Material genetik tersebut adalah kromosom
DNA dan ekstrakromosonal DNA. Material ekstrakromosonal DNA (plasmid)
berupa potongan bundar DNA yang merupakan DNA tambahan suatu sel bakteri
yang dapat melakukan replikasi (Pelczar & Chan 2006). Secara umum, hasil dari
isolasi DNA dapat dianalisis secara kualitatif dengan spektrofotometri atau secara
kuantitatif dengan elektroforesis.
Dalam praktikum ini diperoleh DNA genom yang dianalisis dengan
elektroforesis. Penambahan lisis buffer pada tahapan awal lisis sel berfungsi sebagai
larutan penyangga yang menjaga kestabilan pH. Sel tersebut dilisis untuk
menghilangkan organel-organel sel lain sehingga benar-benar didapatkan DNA sel
yang terkandung dalam inti sel. Proses selanjutnya adalah presipitasi protein untuk
memisahkan DNA dari protein-protein kontaminan. Prinsip lainnya dalam isolasi
DNA adalah sentrifugasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi
berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga
substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih
ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah
mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi,
contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Nichol 1996).
Berdasarkan data yang divisualisasikan melalui elektroforesis, terlihat marker
sebagai penanda pita DNA genom. Kecuali pada sumur kelompok 1 dan 5, semua
sumur memperlihatkan pita DNA nya walaupun tidak terlalu jelas. Hanya sumur
kelompok 9 dan 13 yang menunjukkan kejelasan pergerakan pita DNA. 16s rRNA
sebagai identitas terdapat di ujung pita.
16S rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini
bersifat ubikuitus dengan fungsi yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini
juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, sehingga dapat digunakan sebagai
kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rRNA memiliki beberapa daerah yang
memiliki urutan basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah urutan basanya
variatif. Perbandingan urutan basa yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi
pohon filogenetik universal karena mengalami perubahan relatif lambat dan
mencerminkan kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif
dapat digunakan untuk melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu
spesies. Jika urutan basa 16S rRNA menunjukkan derajat kesamaan yang rendah
antara dua taksa, deskripsi suatu takson baru dapat dilakukan tanpa hibridisasi DNA-
DNA (Stackebrandt dan Goebel 1995). Biasanya jika derajat kesamaan urutan basa
gen penyandi 16S rRNA kurang dari 97% dapat dianggap sebagai spesies baru.

Simpulan
DNA genom dapat diisolasi dengan beberapa prinsip, yaitu lisis sel, presipitasi
protein, dan sentrifugasi. Hasilnya dapat dianalisis dan divisualisasikan melalui
elektroforesis. Hampir semua sumur menampakkan pita DNA yang menunjukkan
keberhasilan isolasi, kecuali sumur kelompok 1 dan 5 yang tidak ditemukan pita
DNA. Isolasi DNA ini dapat dimanfaatkan untuk analisis berikutnya.

Daftar Pustaka
Bartlett S. 2003. A short history of the polymerase chain reaction, in methinds. Biol
226: 3-6
Dare JW. 1994. Molecular Genetics of Bacteria. Edisi ke-2. Chichester : John Wiley
& Sons
Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White JT. 1990. PCR Protocols, A guide to
Metods and applications.San Diego: Academic Press Inc.
Nichol DST. 1996. An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge: University
Pr.
Pangastuti A. 2006. Definisi Spesies Prokaryota Berdasarkan Urutan Basa Gen
Penyandi 16s rRNA dan Gen Penyandi Protein. Biodiversitas 7(3): 292-296.
Pelczar MJ, Chan ECS. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Hadioetomo RS, Imas T,
Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta: Universitas Indonesia.
Terjemahan dari Elements of Microbiology.
Stackebrandt, E. and B.M.Goebel. 1995. A place for DNA-DNA reassociation and
16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology.
International Jurnal of Systematic Bacteriology 44: 846-849.