UNIVERSIDAD INTERNACIONAL SEK FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES CARRERA DE BIOTECNOLOGA NOMBRE: Franklin Villegas Pliz. CURSO: 8vo nivel.

MATERIA: Biologa Molecular II. Fecha: 29-05-2011 TEMA: Revisin Bibliogrfica sobre Efectos de la radiacin inozante sobre el genoma y en el DNA de Arabidopsis y Crisantemo Objetivos: y y Identificar de forma clara el efecto directo que tiene la radiacin ionizante sobre el genoma de Arabidopsis; mediante las tcnicas moleculares descritas en el artculo. Conocer como la radiacin ionizante afecta el funcionamiento de la clula y como este se expresa fisiolgicamente.

Introduccin: La induccin de mutagnesis en plantas se ha usado intensivamente en los ltimos aos no solo en la bsqueda y caracterizacin de genes si no tambin en programas de mejora vegetal. Esta herramienta permite estudiar como los genes estn relacionados y como los productos de estos genes se ven afectados cuando son expuestos a agentes mutagnicos. Por ejemplo ante la exposicin de radiacin gamma se han obtenido varias mutaciones puntuales en rosas ante el incremento de la dosis de exposicin (Van Harten 1998). De igual manera la expresin de y ruta biosinttica de flavonoides se directamente afectada ante la irradiacin de un acelerador de electrones. Para el aislamiento de genes mutantes en plantas generalmente se utilizan tres mtodos: Gene tagging o T-DNA mediando por transposones, chromosome walking y genomic substraction; estas tcnicas en general permiten aislar e identificar el loci de genes mutantes sin precisar informacin previa (Shirley, Hanley y Goodman 1992). Uno de los desafos ms grandes dentro de la mejora de cultivos mediante induccin de mutaciones ya sea por agentes qumicos o fsicos es lograr que las mutaciones obtenidas sean slidas, es decir que logren ser transmitidas a sus siguientes generaciones. Con los avances en biologa molecular ahora se conoce de mejor manera los mecanismos de reparacin del DNA y es por esto que ahora se entienden varios de los fenmenos observados en la induccin de mutaciones. Por ejemplo diferencias en la sensividad ante distintos mutagnicos entre las distintas especies de plantas y entre las distintas partes de la planta utilizadas, la gran variedad tipos de daos que causan los diferentes mutagnicos por ejemplo la radiacin gamma frecuentemente produce rupturas de doble cadena, radiacin UV causa dimerizacin entre pirimidinas adyacentes; mientras que los mutagnicos qumicos producen mal apareamiento entre bases y escisin de nucletidos.

En cuanto a los mecanismos de reparacin del DNA cuando se produce una ruptura de doble cadena (DSB s) existen dos caminos de reparacin posibles la recombinacin homologa (HR) y la recombinacin de sitios no homlogos (NHEJ), toda esta informacin es de vital importancia al momento de planificar programas de mejora. (Shu 2009). Efecto de la radiacin ionizante en el genoma vegetal: anlisis de dos mutantes (testa transparente) de Arabidopsis. Este artculo describe la induccin de mutaciones en dos flavonoides biosintticos de un loci en Arabidopsis, los mutantes fueron nombrados tt (testa transparente) ya la radiacin afect la expresin de este pigmento. Para el mejor estudio de la biosntesis de flavonoides se aislaron los genes responsables de codificar chalcona flavona isomerasa (CHI) y dihidroflavonol-4-reductasa (DFR). Tanto CHI como DFR se ocupan de catalizar la conversin de chalconas en flavonas y de dihidroflavonoles en flavonas3-4-dioles (Shirley, Hanley y Goodman 1992) Dos alelos fueron aislados tt3 (M318) y tt5 (40.443) despus de la irradiacin con un acelerador de neutrones y rayos X. Las mutaciones resultaron en rupturas de doble cadena, deleciones, inversiones y adems causaron reordenamientos cromosmicos por recombinacin no homloga. Para el aislamiento de los genes que codifican para CHI y DFR se utiliz la tcnica de nucletidos degenerados, se utilizaron primers de secuencias conocida en frjol y petunia para CHI y para DFR se utilizo maz, se amplificaron las muestras y los primers se agruparon en uno o ms intrones. Los productos amplificados fueron del tamao esperado y fueron hibridados con un c DNA de Petunia, y tanto como CHI y DFR fueron clonados en un plsmido. La secuencia completa de nucletidos de CHI y DFR fue dilucidada, las secuencias de estos genes mostraron gran similitud con secuencias de CHI y DFR en otras especies. Mapeo de CHI y DFR mediante RFLP (Mtodos) El mapeo mediante RFLP permiti observar la posicin de estos genes en los loci de las muestras mutantes, se pudo observar que para los clones obtenidos para CHI (pCHI14, pAt3-89.1) y para DFR (pDFR2, pAt5-91.5) las posiciones fueron distintas en comparacin con los mutantes tt5, tt6 y tt3 respectivamente. La mutacin obtenida para el loci tt6 resulto en la afeccin de uno de los intermediarios en la biosntesis de flavonoides, por otro lado las plantas tt5 no tuvieron presencia de flavonoides y antocianidinas por lo que se obtuvieron semillas de color amarillo limn; todos estos fenmenos ocurrieron en el cromosoma 3, este fenotipo era de predecible ya que en la ausencia de CHI no se puede sintetizar flavonoides. En el estudio del cromosoma 5 se obtuvo que las semillas presentaron la expresin de flavonas pero no de antocianidinas como se esperara en la ausencia de la protena DFR.

Cambios estructurales en los genes de CHI y DFR para tt5 y tt6. El mutante tt5 (40.443) fue irradiado mediante aceleracin de neutrones el mutante tt6 por su parte fue sometido ante un mutagnico qumico etil-metanosulfonato. Conjuntamente con una especie nativa y estos alelos se cre un gel blot y se hibrido con el clon pCHI14. Se pudo comprobar que hubo una diferencia de bandas entre tt5 y la especie nativa. Se realiz un anlisis similar para DFR donde se utiliz el alelo tt3 que fue hibridado con el gen M218 despus de la irradiacin con rayos X, y esto en conjunto se hibrido con el clon pDFR2; donde se pudo observar la ausencia de tt3. Resultados: Estructura del mutante tt5. Se construyo un gel que contena el mutante tt5 y se hibrido con los subclones para la regin codificante de CHI y se comparo con el clon de la especie nativa donde se obtuvieron las muestras. Se pudo observar que los clones hibridaron las regiones HIND III y Bg III del alelo tt5 y estas fueron de distinto tamao que la muestra nativa. Adems mediante la clonacin de las secuencias donde existieron rupturas cromosmicas se pudo conocer el sitio exacto de las mismas el primero est ubicado 390pb ro arriba de AUG, otro punto fue ubicado en el cuarto exn adems fragmentos de 272bp que no tenan homologa con la secuencia de genes CHI fueron insertados en uno de los sitios finales de la inversin. Esta insercin introdujo 2 nuevos aminocidos y un codn de parada en la mitad del cuarto exn.

Ilustracin 1 Tomado de (Shirley, Hanley y Goodman 1992)

Estructura del mutante tt3. Para conocer el tamao de la delecin en tt3 se diseo un gel que contena el alelo tt3 y se hibrido con varios clones HindIII que rodean la regin codificante para DFR. Las secuencias obtenidas para los clones PDFR4.4 y PDFR2.3 no obtuvieron seal para tt3. La delecin para el locus DFR comprende 7.4 kb, comenzando desde 675 bp ro arriba de AUG extendindose 5.1 kb despus

del codn de parada, adems 52 bp fueron eliminadas en la segunda ruptura y 7 bp de DNA filler fueron encontradas en la inversin.

Ilustracin 2 tomado de (Shirley, Hanley y Goodman 1992)

Irradiacin mediante rayos inicos y su efecto en la induccin de mutaciones y el contenido de DNA nuclear en crisantemo. La induccin de mutaciones es una herramienta muy importante en los programas de mejora de crisantemo, en el Japn se ha estado utilizando la radiacin de rayos inicos por tener un potencial energtico mayor al de la radiacin gamma. Es por esto que la utilizacin de rayos inicos producira una mayor frecuencia y un mayor espectro de mutaciones (Yamaguchi, et al 2010). El tratamiento con agentes mutagnicos produce adems de nuevas variedades genera aberraciones cromosmicas, reduccin en el nmero de cromosomas que es un efecto no deseable dentro de la las variedades comerciales en el comercio florcola ya que se encuentra relacionado con la reduccin del diametro de la inflorecencia (Yamaguchi, et al 2010) El contenido de DNA nuclear puede ser medido por citometria de flujo y el aumento o disminucin de algn cromosma puede ser detectado mediante esta tcnica. (Yamaguchi, et al 2008) reporto que ante el aumento de dosis de irradiacin con rayos gamma la cantidad de DNA decrece. Materiales y mtodos: Se tomaron segmentos de hoja de crisantemo que fueron irradiandos con las siguientes dosis: iones de carbon 220 Mev a 1, 2, 3, 5 Gy; 320 Mev a 1, 2, 3, 5 Gy; iones de helio 100 Mev a 2, 5, 10, 15 Gy y rayos gamma a 10, 20, 30, 40 Gy dosificados a 10 Gy por hora. Los explantes fueron sembrados en un medio de reneracin y se analiz el porcentaje de regeneracin. Para el anlis de citometra se utilizo un control que no fue irradiado y una especie modelo para identificar el pico. Se tomaron 50 muestras de cada dosis irradiada para el anlisis. Resultados:

Se pudo abstraer del experimento realizado que la formacin de callo no fue alterada por ninguna de las dosis de aplicadas asi como tambin del tipo de irradiacin. Sin embargo el porcetage de regeneracin se vio directamente afectado con el incremento de la dosis.

Ilustracin 3 tomado de (Yamaguchi, y otros, 2010)

Contenido de DNA. El contenido de DNA de las plantas no irradiadas estaba entre 0.98 y 1.03 pico-gramos con un promedio de 1.00, las plantas que fueron irradiadas presentaron menor contenido de DNA, donde la que menos contenido de DNA presento fue de 0.92 que representa una reduccin del 8% en comparacin con el total.

Ilustracin 4 tomado de (Yamaguchi, y otros, 2010)

Frecuencia de mutaciones La frecuencia en el incremento de mutaciones en color aumenta conforme la dosis aumenta para todos los tipos de irradiacin, sin embargo la tasa de regeneracin decrece con l aumento de las dosis.

Ilustracin 5 tomado de (Yamaguchi, y otros, 2010)

Ilustracin 6 tomado de (Yamaguchi, y otros, 2010)

Conclusiones: y y y y La radiacin ionizante causa daos cromosmicos como: inversiones, deleciones, rupturas de doble cadena en Arabidopsis spp. Tambin produce recombinacin de secuencias no homlogas en Arabidopsis spp. La radiacin en especies florales produce mutantes de color dependiendo de la dosis y de la fuente de radiacin. En crisantemo al aumentar la dosis el porcentaje de regeneracin disminuye y la frecuencia de mutantes aumenta.

Bibliografa
Shirley, B. M., Hanley, S., & Goodman, H. M. (1992). Effects of lonizing Radiation on a Plant Genome: Analysis. The plant Cell , 4, 333-346. Shu, Q. Y. (2009). Turning Plant Mutation Breeding Into a New Era: Molecular Mutation Brreding. Food and Agriculture Organization of the United Nations , 425-427. Van Harten, A. M. (1998). Mutation Breeding: Theory and Practical Applications (Vol. I). Cambridge: Cambridge University Press. Yamaguchi, H., Akemi, S., Hase, Y., Tanaka, A., Shikazono, N., Degi, K., y otros. (2010). Effects of ion beam irradiation on mutation induction and nuclear DNA content in. Breeding Science , 398-404. Yamaguchi, H., Shimizu, A., Degi, K., & Morishita, T. (2008). Effects of dose and dose rate of gamma ray irradiation on mutaion induction and nuclear DNA content in chrysanthemun. Breeding Science , 331-335.