LABORATORIO CONTROL AMBIENTAL

Modelo de Mejora Continua

ANALISIS MICROBIOLOGICO

PROTOCOLO PARA ANALISIS DE NMP EN ALIMENTOS

OBJETIVO Describir la metodologa para la determinacin de coliformes totales y fecales en muestras de alimentos.

ALCANCE Este procedimiento es aplicable a diferentes tipos de matrices (Lquidos y slidos).

DESCRIPCIN Principio En este ensayo de laboratorio se analizar muestras de alimentos, con la finalidad de determinar qu tipo de microorganismos logran crecer en los diferentes medios de cultivo empleados en laboratorio. En los anlisis microbiolgicos convencionales el ensayo para determinar coliformes totales y fecales puede llevar a necesitar un gran nmero de diferentes bateras de medios de cultivos y estn basados en diferentes etapas como la prueba presuntiva, prueba confirmativa y luego uso de medios de cultivo slidos todo este anlisis puede tomar unos 5 das para lograr un diagnostico. Fluorocult, descrito inicialmente por (Manafi y Kneifel 1989). Caldo Fluorocult LMX contiene buffer fosfatos para garantizar un alto rango de crecimiento para coliformes totales. Lauril sulfato inhibe el crecimiento de flora Gram-positiva. El sustrato cromogenico 5-bromo-4-cloro-3indol--D-galatopiranoxido que est dirigido para coliformes y sustrato fluorogenico 4methyllumbelliferyl--D-glucuronide, que es altamente especifico para E. coli, permite una simultanea deteccin de coliformes totales y E. coli. Un cambio de color del caldo Fluorocult de amarillo a azul verdoso indica la presencia de coliformes. En adicin un azul fluorescente bajo exposicin a la luz ultravioleta permite la rpida deteccin de E. coli. Como el medio posee el aminocido triptfano, la reaccin indol es fcilmente dada por adicin del reactivo de Kovacs. La formacin de un anillo rojo confirma la presencia de E. coli. En este medio de cultivo, se pueden obtener resultados de 18 a 24 h.

Figura 1. Posibles resultados del caldo Fluorocult LMX. El primer tubo es el caldo sin ningn tipo de crecimiento, el segundo tubo presenta turbiedad debido al crecimiento bacteriano, Coliformes fecales: el tercer tubo con coloracin azul-verdoso con anillo generado por el reactivo de Kovacs mas la fluorescencia bajo luz UV, Coliformes totales: los dos ltimos tubos, presencia de color azul-verdoso pero ausencia del anillo indol y fluorescencia bajo luz UV.

Composicin del caldo Fluorocoult (g/Litro) Triptosa 5; Cloruro de sodio 5; sorbitol 1; triptfano 1; Fosfato acido de potasio 2,7; Fosfato acido monopotasico 2; sales de lauril sulfato de potasio 0,1; 5-bromo-4-cloro-3-indol--Dgalatopiranoxido (X-GAL) 0,08; -methyllumbelliferyl--D-glucuronide (MUG) 0,05; 1-isopropil- D-1-tio-galactopyranoside (IPTG) 0,1. Preparacin del medio de cultivo Suspenda 17 g en un (1) litro de agua destilada. Caliente para disolver completamente. Autoclave por 15 minutos a 121 C. pH: 6,8 0,2 a 25 C Control de calidad Test de Cepas Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 31488 Enterobacter cloacae ATCC 13047 Citrobacter brakii ATCC 6750 Citrobacter freundii ATCC 8090 Color azul- verdoso + + + + + Fluorescencia Reaccin Indol + + -

Shigella flexneri ATCC 12022 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Aeromonas hydrophila ATCC 7966 Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145

Almacenamiento y toma de muestras Se comienza el examen microbiolgico mximo 24 h despus de su recoleccin. Si se sabe que el resultado puede ser usado para una accin legal analizar la muestra antes de 6 h, mantenindola refrigerada a 4 C y con cadena de custodia. Procedimiento Se agrupan los tubos de fermentacin en hileras de tres o cinco tubos en una gradilla. Con 1 ml de muestra y/o diluciones de la misma. El nmero y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la cantidad y de las caractersticas de la muestra que se vaya a estudiar, se agita vigorosamente la muestra y las diluciones. Evaluacin experimental Incubacin: 18-24 horas a 36 1 C en ambiente aerobio. Si se incuba a temperatura ambiente (+20 a +25 C) el tiempo de incubacin es prolongado a 48 horas. Coliformes totales: el color del caldo cambia a azul-verdoso. E. coli: el color del caldo cambia a azul verdoso fluorescente bajo luz UV (366 nm). Reaccin indol usando el reactivo de Kovacs, se observa un anillo rojizo. PRUEBA COMPLETA Para establecer la presencia de bacterias coliformes y obtener datos sobre el control de calidad, se usa la prueba completa sobre por lo menos el 10% de los tubos positivos confirmados. Simultneamente, se inocula en medio liquido verde brillante de lactosa bilis para coliformest totales y medio liquido EC para coliformes fecales o puede ser usado medio liquido EC-MUG para Escherichia coli. Se consideran como respuesta positiva de la prueba completa los resultados positivos en caldo medio liquido EC y medio liquido EC-MUG a temperatura elevada (44,5 C). Los cultivos que sean positivos en medio verde brillante lactosa bilis y negativos en medio EC y EC-MUG indican la presencia de coliformes no fecales.

Se siembra aspticamente una placa de agar LES Endo o agar MacConkey por cada tubo de Medio verde Brillante Lactosa Bilis que ha Producido gas; se realiza la operacin lo antes posible tas la deteccin del gas. Se siembran las cajas de forma que asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por al menos 0,5 cm. Se incuban las cajas invertidas a 35 C 0,5 C durante 24 h 2 h. Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden definirse como tpicas (rosas a rojo oscuras con un brillo verde metlico superficial) o atpicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 h de incubacin. Las colonias tpicas de la fermentacin de la lactosa desarrolladas sobre el agar MacConkey son rojas y pueden estar rodeadas por una zona opaca de precipitado biliar. Se toma de cada caja una o ms colonias tpicas bien definidas o, si no existen, dos o ms entre las que se consideran como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se las pasa a un tubo de fermentacin con medio de lauril triptosa y a uno con agar en inclinado (este ltimo no es necesario si se trata de muestras de agua potable). Si es necesario, utilice una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento optimo a la hora de tomarlas de las cajas de agar LES Endo o afar MacConkey. Cuando se transfiera las colonias, se eligen las que estn bien aisladas y se toca apenas su superficie con una aguja esterilizada a la llama, enfriada al aire para evitar en lo posible el peligro de transferir un cultivo mixto. Se incuban los tubos con el medio secundario (medio liquido de lauril triptosa con tubos durham de fermentacin invertidos) a 35 C 0,5 C durante 24 h 2 h; si no se produce gas en este periodo se prolonga la incubacin hasta 48 h 3 h. Se estudian microscpicamente las preparaciones teidas con Gram y obtenidas en los cultivos inclinados a las 24 h, correspondientes a los tubos secundarios que muestren gas. Si se trata de agua potable, se puede prescindir de la tincin de Gram en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gran-positivas y microorganismos esporulados sobrevivientes en este mtodo de deteccin selectiva. Interpretacin. El resultado positivo de la prueba completa requiere la formacin de color azulverdoso y la demostracin de bacterias alargadas gran-negativas no esporuladas procedentes de los cultivos slidos, lo que demuestra la presencia de un miembro del grupo coliforme.

CLCULO Y REGISTRO DEL NMP Para calcular la densidad de coliformes, se calcula en trminos del nmero ms probable (NMP). En la tabla se contempla Lmites de confianza del 95% para cada valor del NMP. La tabla ilustra los valores de NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se estudian volmenes de cinco muestras de 10 ml, 1 ml, y 0,1 ml. En caso de que las series de diluciones decimales sean distintas de las de la tabla, se seleccionan los valores de NMP de la tabla por la combinacin de tubos positivos, calculando de acuerdo con la siguiente frmula:

Valor del NMP X

10 Mayor volumen estudiado

= NMP / 100 ml

Cuando se utilice ms de tres diluciones en series de diluciones decimales, solo se tomarn los resultados de tres de ellas para calcular el NMP. Para seleccionar las tres diluciones por utilizar en la determinacin del ndice del NMP, se escoge la dilucin ms alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay dilucin menor que haya dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones ms altas. En la tabla se muestran las combinaciones de tubos positivos ms probables. Si aparecen combinaciones poco probables con una frecuencia superior al 1 %, hay que pensar que la tcnica es inadecuada o que no se ha cumplido por completo el supuesto estadstico en que se basa el clculo del NMP.

NMP/100 ml = No. De tubos positivos X 100 Raz de los ml de muestra en los tubos negativos X ml de muestra en todos los tubos

Aunque los clculos del NMP se facilitan para su uso en la prueba de coliformes, tambin son aplicables para determinar el NMP de cualquier otro microorganismo, siempre que se disponga de los medios de estudio adecuados.

Limites de confianza del 95 % (aproximados) Combinacin de positivos NMP/100 ml Superior

0-0-0 0-0-1 0-1-0 0-2-0 1-0-0 1-0-1 1-1-0 1-1-1 1-2-0 2-0-0 2-0-1 2-1-0 2-1-1 2-2-0 2-3-0 3-0-0 3-0-1 3-1-0 3-1-1 3-2-0 3-2-1 4-0-0 4-0-1 4-1-0 4-1-1 4-1-2 4-2-0 4-2-1 4-3-0 4-3-1 4-4-0 5-0-0 5-0-1 5-0-2 5-1-0 5-1-1 5-1-2 5-2-0 5-2-1 5-2-2 5-3-0 5-3-1 5-3-2 5-3-3 5-4-0 5-4-1 5-4-2 5-4-3 5-4-4 5-5-0 5-5-1 5-5-2 5-5-3 5-5-4 5-5-5 <2 2 2 4 2 4 4 6 6 4 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 30 40 30 50 60 50 70 90 80 110 140 170 130 170 220 280 350 240 300 500 900 1600 >1600 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 2,0 2,0 1,0 2,0 2,0 3,0 3,0 5,0 3,0 4,0 4,0 6,0 6,0 7,0 5,0 7,0 7,0 9,0 12 9 12 12 15 16 9 10 20 10 20 30 20 30 40 30 40 60 80 50 70 100 120 160 100 100 200 300 600 -

Inferior
10 10 13 11 15 15 18 18 17 20 21 24 25 29 24 29 29 35 35 40 38 45 46 55 63 56 65 67 77 80 86 110 140 120 150 180 170 210 250 250 300 360 410 390 480 580 690 820 940 1300 2000 2900 5300 -

INFORME DE ENSAYO En el informe de ensayo se debe especificar el mtodo usado, la temperatura seleccionada, y los resultados obtenidos. Tambin se deben mencionar todos los detalles de las operaciones no especificados en esta norma, o considerados como opcionales, junto con los detalles de cualesquier incidente que puedan haber influido en los resultados. En el informe de ensayo se debe incluir toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra.

REFERENCIA NTC 4939:2001, Calidad de agua. Enumeracin de coliformes y Escherichia coli. Tcnica con tubos de fermentacin. Manafi, M., Kneifel, W. 1989. Ein kombiniertes Chromogen-Fluorogen- Medium zum simultanen Nachweis der Coliformengrupe und von E. coli in Wasser. Zbl. Hygiene and Unweltmedizin. 189; p 225-234. Merk Microbiology Manual 12th Edition

DIAGRAMA DE FLUJO

Diluciones de las muestras (si es necesario)

Inoculacion en caldo Fluorocoult en volumenes de 10, 1, 0,1 ml

Incubacin: 18-24 horas a 36 1 C en ambiente aerobio. A temperatura ambiente (+20 a +25 C) por 48 horas.

El color del caldo cambia a azulverdoso, se interpreta como Coliformes totales

El color del caldo cambia a azul verdoso fluorescente bajo luz UV (366 nm). Reaccin indol usando el reactivo de Kovacs, se observa un anillo rojizo, se interpreta presencia de E. coli