Protocole Expérimental

UNIVERSITE DANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCES AGRONOMIQUES (ESSA) DEPARTEMENT DES EAUX ET FORETS FORMATION CONTINUE ET D.
E .A Session 2003 Promotion "RENIALA"
MEMOIRE EN VUE DE LOBTENTION DU DIPLOME DETUDE APPROFONDIE (DEA) EN SCIENCES AGRONOMIQUES Option : Foresterie, Dveloppement et Environnement
MISE AU POINT DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET LA REGENERATION "IN VITRO" DE Kalanchoe synsepala (BAKER)
Prsent par :
RABOTOVAO Andrisoa Sylvain
Devant le jury compos du: Prsident : Pr RAKOTOZANDRINY Jean de Neupomuscne Examinateurs : Dr RAMAMONJISOA Lolona Dr RAKOTOBE Etienne Alphonse Rapporteur : Dr RAKOTONDRADONA Rmi
UNIVERSITE DANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCES AGRONOMIQUES (ESSA) DEPARTEMENT DES EAUX ET FORETS FORMATION CONTINUE ET D.E .A Session 2003 Promotion "RENIALA"
MEMOIRE EN VUE DE LOBTENTION DU DIPLOME DETUDE APPROFONDIE (DEA) EN SCIENCES AGRONOMIQUES Option : Foresterie, Dveloppement et Environnement
N : 06 / 2004
MISE AU POINT DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET LA REGENERATION "IN VITRO" DE Kalanchoe synsepala (BAKER)
Prsent par :
RABOTOVAO Andrisoa Sylvain
Devant le jury compos du: Prsident : Pr RAKOTOZANDRINY Jean de Neupomuscne Examinateurs : Dr RAMAMONJISOA Lolona Dr RAKOTOBE Etienne Alphonse Rapporteur : Dr RAKOTONDRADONA Rmi
Remerciements
Avant de prsenter ce travail, permettez moi dadresser mes vifs remerciements aux:
Professeur RAKOTOZANDRINY Jean de Neupomuscne, Directeur Scientifique de la formation troisime cycle, Professeur titulaire lEcole Suprieure des Sciences Agronomiques, qui a bien voulu mautoriser soutenir et accepter de prsider le jury de ce mmoire, Docteur RAMAMONJISOA Lolona, Enseignant lESSA Fort, Production du Silo National des Graines Forestires (SNGF), Chef du Dpartement
Docteur RAKOTOBE Etienne Alphonse, Directeur du Centre National dApplication de Recherches Pharmaceutiques (CNARP), qui a bien voulu accepter de faire partie des membres du jury de ce mmoire, Mon encadreur, Docteur RAKOTONDRADONA Rmi, Directeur des Etudes de lEcole Normale Suprieure, pour ces prcieux directives et ses critiques constructives tout au long de ce travail. Il na mnag pas ses efforts pour diriger nos travaux de recherche malgr ses multiples occupations,
Monsieur RAKOTOMARO Ndriatsimaniry Jol, qui nous a aid dans les traitements statistiques des rsultats, malgr ces nombreuses tches et occupations au sein du Dpartement des Eaux et Forts,
Je tmoigne galement toute ma gratitude aux: Docteur RABOTOVAO Laurence, Chef du Centre dEtude et de Recherche en Sciences Naturelles (CER) de lEcole Normale Suprieure, Responsable du Sous projet F@DES SP02V3-01 intitul : Valorisation dune plante endmique malgache proprit immunostimulante, Kalanchoe synsepala (BAKER) , de nous avoir donn le thme de ce travail,
Personnels chercheurs et techniciens, du Laboratoire de Microbiologie de LEnvironnement (LME), Annexe CNRE de Tsimbazaza, qui nous a permis deffectuer les travaux de recherche et de nous avoir conseills tout au long du stage,
Administration et Corps Professoral de lEcole Suprieure de Sciences Agronomiques (ESSA), et de lEcole Normale Suprieure (ENS), pour les enseignements thoriques et pratiques quils nous ont prodigus durant les annes dtude,
Toute ma famille, de nous avoir soutenu, dans cette formation, tous nos amis et collgues de la promotion FIARO (ENS, SN) et amis de notre promotion RENIALA (ESSA, Troisime cycle),
Tous les personnes qui ont, de prs ou de loin, contribu la ralisation et la finalisation de ce travail.
MERCI!
RESUME Le fondement de la gestion durable dune ressource naturelle est la matrise de sa rgnration, tant par voie sexue (graine) que par voie vgtative (apex, feuille etc.). Ainsi, ce travail a contribu la valorisation dune espce non ligneuse, endmique de Madagascar, Kalanchoe synsepala (BAKER), en adoptant diffrentes techniques de multiplication sexue et non sexue "in vitro", par llaboration de protocoles exprimentaux pour la germination et la rgnration de lespce. En effet, la richesse de cette espce vocation mdicinale est relativement importante due au faite que son extrait est class parmi les agents immunostimulants. Ainsi, dans le but de sa conservation, divers protocoles de multiplication "in vitro" ont t labors et mis au point pour la sauvegarde de lespce. Ce travail se divise en deux grandes parties: - la premire consiste dterminer des protocoles de dcontamination avec des produits dtergents antiseptiques et dlaborer des protocoles de germination de graines sur diffrents milieux de culture. -la seconde contribue la rgnration "in vitro" de lespce en adoptant trois techniques de multiplication vgtative "in vitro ", savoir : la culture de mristme, la micropropagation et lembryogense somatique. Pour chaque technique propose, des protocoles de dcontamination des explants ont t effectus ainsi que des procds de rgnration des explants en plantule. A partir des exprimentations, on a constat que lespce est totipotente. De plus, lespce possde une facult germinative trs leve puisque la capacit et la vitesse de germination des graines se situent aux environs de 75 %. Le pourcentage de rgnration, pour la culture du mristme apical est de 28 %, pour la technique de micropropagation, de 36%. Enfin, le potentiel de rgnration de lespce est de 64% dans des conditions de culture bien dfinies et en tablissant les milieux de culture et les hormones de croissance adquates. Mots cls : Kalanchoe synsepala (BAKER), endmique, germination, culture de mristme, micropropagation, embryogense somatique, Madagascar. ABSTRACT The key of sustainable management of natural resources is to know how to handle its regeneration, whether by sexual means (seeds) or by asexual means (meristem, leaf etc). Therefore, in this study, we want to enhance the value of our unwoody species of Kalanchoe synsepala (BAKER), wich is endemic to Madagascar. To do so, we have carried out experiment on seed germination and in vitro culture, and the results are recorded in protocols. Actually, the value of this plant lays on the stimulant properties of its extract; therefore, it pays to work for its conservation. Two main parts are seen in this work: - the first one is to establish protocols on how to eradicate seed contaminations and on seed germination using different media. - the second one is to focus on in vitro culture using different techniques such as: culture of meristem, micropropagation and somatic embryogenesis. Along our experiment, we have noticed that cells obtained from different part of this plant present high level of totipotency. Moreover, it has some high percentage of germination around 75%; of regeneration around 36%. At last, potential regeneration of explants is 64% in cultural condition well defined, in establishing a cultural medium with adequate growing hormone. Key words: Kalanchoe synsepala (BAKER), endemic, germination, culture of meristem, micropropagation, somatic embryogenesis, Madagascar.
LISTES DES TABLEAUX Tableau 1 : Les observations phnologiques concernant lespce .......................................................... 6 Tableau 2 : Les facteurs physiques et biologiques des milieux dtudes .............................................. 14 Tableau 3 : Les espces caractristiques du type dhabitat o pousse lespce .................................... 15 Tableau 4 : Les usages thrapeutiques de lespce ............................................................................... 18 Tableau 5 : Statut UICN de conservation des plantes grasses............................................................... 19 Tableau 6 : Statut UICN et CITES de 4 genres appartenant la Famille ............................................. 20 Tableau 7 : Rappel de la mthodologie adopte.................................................................................... 30 Tableau 8 : La dmarche mthodologique adopte ............................................................................... 32 Tableau 9 : Les caractristiques des graines suivant lcotype ............................................................ 33 Tableau 10 : Dispositifs exprimentaux pour la dcontamination des graines avec Na Cl O 12%.... 35 Tableau 11 : Dispositifs exprimentaux pour la dcontamination des graines avec Ca (O Cl2) 5% .. 35 Tableau 12 : Les milieux de germination des graines labors............................................................. 36 Tableau 13 : Dispositifs exprimentaux pour la germination des graines............................................. 37 Tableau 14 : Rsultas bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination par Na Cl O 12% .. 43 Tableau 15 : Rsultats bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination Ca (O Cl2) 5%...... 43 Tableau 16 : Analyse de variance de leffet des dtergents sur le taux de germination........................ 44 Tableau 17 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur leffet des dtergents ............................ 44 Tableau 18 : Rsultats bruts des essais relatifs la capacit de germination de lespce ..................... 47 Tableau 19 : Rsultats bruts des essais relatifs la vitesse de germination de lespce ....................... 47 Tableau 20 : Analyse de variance de leffet des facteurs sur la capacit de germination ................... 48 Tableau 21 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% .................................................................... 48 Tableau 22 : Rsultas bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination Na Cl O 12% ........ 54 Tableau 23 : Rsultas bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination Ca (O Cl2) 5 %..... 54 Tableau 24 : Analyse de variance de leffet des dtergents sur la rgnration des explants ............... 55 Tableau 25 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur leffet des dtergents ............................ 56 Tableau 26 : Rsultats des essais relatifs la culture "in vitro" de lespce ......................................... 57 Tableau 27 : Rsultats de la rgnration en plantules de lespce....................................................... 64 Tableau 28 : Protocoles exprimentaux proposs pour la dcontamination et la germination ............ 70 Tableau 29 : Protocoles exprimentaux proposs pour la rgnration de lespce ............................. 72
LISTES DES FIGURES Figure 1: Morphologie gnrale du Kalanchoe synsepala (BAKER)..................................................... 5 Figure 2: Les aires de rpartition de Kalanchoe synsepala (BAKER).................................................. 10 Figure 3: Les milieux naturels de Kalanchoe synsepala (BAKER). Vue densemble des massifs A : Ambatokely, B : Antongona, C et D : Manerinerina, E : Ambalavao et F : Ampanihy..... 16 Figure 4: Vues rapproches de la communaut vgtale tudie G et I : Kalanchoe synsepala, H : plantes pionnires Xerophyta dasylirioides, Aloe vahombe, J : Angraecum sororium, K et L : Kalanchoe synsepala poussant sur les rocailles Ampanihy et Ambatokely............. 17 Figure 5: Orientation de la culture "in vitro" l'aide de deux hormones (en mg/l) .............................. 25 Figure 6: Morphologie de la graine de Kalanchoe synsepala (BAKER) vue au Microscope lectronique balayage (MEB)................................................................................................ 33 Figure 7: Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Na Cl O 12% ................ 44 Figure 8: Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Ca (O Cl2) 5% .............. 45 Figure 9: Clichs rsumant les diffrentes tapes de la germination de la graine................................. 53 Figure 10: Clichs rsumant les diffrentes tapes de la culture de mristme .................................... 60 Figure 11: Clichs rsumant les diffrentes tapes de la micropropagation ........................................ 61 Figure 12: Callogense chez Kalanchoe synsepala (BAKER) ............................................................. 62 Figure 13: Bourgeonnements vgtatifs intenses chez Kalanchoe synsepala (BAKER)...................... 63 Figure 14: Clichs des diffrentes tapes de la rgnration en plantules de lespce.......................... 66
LISTE DES ANNEXES
III III IV VVI VII VIII IX-
Prparation Solution Mre : Muraschige et Skoog (1962) Prparation Solution Mre : Gresshof et Doy (1974) Composition des Vitamines de Morel (Morel et Wetmore, 1951) Composition des milieux de culture utiliss dans la culture de mristme, lembryogense somatique, la micropropagation Composition des milieux de culture utiliss pour la rgnration des lespce Tableau rsumant la capacit et vitesse de germination des graines traites avec lhypochlorite de sodium et lhypochlorite de calcium Fiche technique de Kalanchoe synsepala (BAKER) Analyse de variance et test de NEWMAN et KEULS Rsultats des tests statistiques sur Logiciel STAT ITCF, version 4
LISTE DES ABREVIATIONS 2-4 D AIA AI ANA BAP CDB CITES CNARP CNRE CIV CV d.d.l ENS ESSA FOFIFA GD HR IMRA ITCF LME MEB MS ONE P. PLARM SIBIO S.C.E UICN V. WCMC Acide 2-4 dichloro-phnoxy-actique Acide indole actique Acide indol-butirique Acide naphtylactique 6- Benzylaminopurine Convention sur la Diversit Biologique Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora Centre National d'Application de Recherches Pharmaceutiques Centre National de Recherches sur lEnvironnement Culture "in vitro" Coefficient de Variation Degr de libert Ecole Normale Suprieure Ecole Suprieure des Sciences Agronomiques Foibe Fikarohana ho Fampandrosoana ny tontolo eny ambanivohitra Gressoft et Doy Humidit relative Institut Malgache de Recherche Applique Institut Technique des Crales et des Fourrages Laboratoire de Microbiologie de lEnvironnement Microscope lectronique balayage Muraschige et Skoog Office National pour l'Environnement Probabilit Inventaire et tude des plantes aromatiques et mdicinales des Etats de l'Ocan Indien Systme d'information sur la Biodiversit Somme des Carres des Ecarts International Union for Conservation of Nature Variance World Conservation Monitoring Center
GLOSSAIRE Biodiversit Conservation ex situ Conservation in situ : Synonyme de diversit biologique : Conservation dlments constitutifs de la diversit biologique en dehors de milieu naturel (CDB*) : Conservation des cosystmes et des habitats naturels et maintien et reconstitution de populations viables despces dans leur milieu naturel et, dans le cas des espces domestiques et cultives, dans le milieu o se sont dveloppes leurs caractres distinctifs (CDB) : Variabilit des organisme vivant de toute origine y compris, entre autres, les cosystmes terrestres, marins et autres cosystmes aquatiques et les complexes cologiques dont ils font partie; cela comprend la diversit au sein des espces et entre espces ainsi que celle des cosystmes (CDB) : Echantillon dune espce modifi par rapport au type fondamental par suite par suite de laction du milieu environnant : Toute espce dont le processus dvolution a t influence par lhomme pour rpondre ses besoins : Lieu ou type de site dans lequel un organisme ou une population existe ltat naturel (CDB) : Proprit que possde un organisme dtre rfractaire certains agents pathognes, ensemble de ractions qui tendent liminer des substances trangres de lorganisme infect. : Substance organisme qui stimule la rsistance anti-infectieuse dun
Diversit biologique
Ecotype
Espces cultives ou domestiques Habitat Immunit
Substance immunostimulante Utilisation durable
: Utilisation des lments constitutifs de la diversit biologique dune manire et un rythme qui nentranent pas leur appauvrissement long terme, et sauvegardent ainsi leur potentiel pour satisfaire les besoins et les aspirations des gnrations prsentes et futures (CDB) : Toute zone gographiquement dlimite qui est dsigne, ou rglemente, et gre en vue datteindre des objectifs spcifiques de conservation (CDB)
Zone protge
* CDB : dfinition dans la Convention sur la Diversit Biologique (Rio de Janeiro, 3-14 juin 1992)
SOMMAIRE INTRODUCTION ................................................................................................................................. 1 PARTIE I : ETAT DE CONNAISSANCE.......................................................................................... 3 I.1 GENERALITES SUR Kalanchoe synsepala (BAKER), Famille des CRASSULACEAE. ....... 3 I .1.1 Description botanique et biologique du matriel dtude .................................................... 3 I .1.1.1 Systmatique..................................................................................................................... 3 I.1.1.2 Morphologie...................................................................................................................... 5 a) Feuille..................................................................................................................................... 5 b) Tige ........................................................................................................................................ 5 c) Racine..................................................................................................................................... 5 d) Stolons ................................................................................................................................... 5 I.1.1.3 Biologie florale................................................................................................................... 6 a) Inflorescence .......................................................................................................................... 6 b) Graine..................................................................................................................................... 6 I.1.1.4 Phnologie de lespce....................................................................................................... 6 I.1.1.5 Mode de multiplication ..................................................................................................... 7 I.1.1.6 Mode dadaptation cophysiologique: Mtabolisme C.A.M ........................................ 7 I.1.2 Ecologie...................................................................................................................................... 8 I.1.2.1 Exigence cologique de la plante...................................................................................... 8 I.1.2.2 Rpartitions gographiques et variabilit biologique de lespce ................................ 9 I.1.2.3 Milieu dtude.................................................................................................................. 11 a) Le site Ambatokely .............................................................................................................. 11 b) Le site Antongona ................................................................................................................ 11 c) Le site de Manerinerina........................................................................................................ 12 d) Le site dAmbalavao ............................................................................................................ 12 e) Le site dAmpanihy.............................................................................................................. 13 I.1.3 Proprit biologique et phytochimique du Kalanchoe synsepala (BAKER)..................... 18 I.1.3.1 Proprit biologique........................................................................................................ 18 I.1.3.2 Proprit phytochimique ................................................................................................ 19 I.1.4 Statut de conservation des CRASSULACEAE, plante grasse de Madagascar................ 19 I.1.5 Conservation ex situ de lespce ............................................................................................ 20 I.2 GENERALITES SUR LES TECHNIQUES DE CULTURE .................................................... 22 I.2.1 Germination "in vitro" .......................................................................................................... 22 I.2.2 Culture "in vitro"................................................................................................................... 22 I.2.2.1 Techniques de multiplication "in vitro" ........................................................................ 23 a) La culture de mristme................................................................................................... 23 b) Lembryogense somatique ............................................................................................. 23 c) La micropropagation........................................................................................................ 23 I.2.2.2 Les milieux de culture................................................................................................... 24 I.2.2.3 Les hormones de croissance.......................................................................................... 24
PARTIE II: APPROCHE METHODOLOGIQUE-EXPERIMENTATIONS.......................... 27 II.1 Approche mthodologique ...................................................................................................... 27 II.1.1 Problmatique................................................................................................................... 27 II.1.1.1 Les critres de menace pour lespce ou cause directe:la dgradation de leur habitat 27 a) Le dfrichement ............................................................................................................... 27 b) Les feux de brousse ......................................................................................................... 27 c) La surexploitation ............................................................................................................ 27 d) Lexploitation des carrires ............................................................................................. 28 II.1.1.2 Autres critres de menaces indirecte : manques dinformation ................................... 28 II.1.2.3 Difficults inhrentes la physiologie de lespce...................................................... 28 II.1.2.4 Difficults inhrentes la technique de multiplication ............................................... 29 II.1.2 Hypothse ......................................................................................................................... 29 II.1.3 Objectifs............................................................................................................................ 30 II.1.4 Cadre mthodologique .................................................................................................... 30 II.1.4.1 Rcolte de donnes ...................................................................................................... 30 a) Recherche bibliographique .............................................................................................. 30 b) Descente sur terrain ......................................................................................................... 31 II.1.4.2 Analyse des donnes.................................................................................................... 31 II.1.4.3 Exprimentation au laboratoire.................................................................................... 31 II.2 MATERIELS ET METHODES ................................................................................................ 33 II.2.1 Germination "in vitro" des graines de Kalanchoe synsepala (BAKER).................... 33 II.2.1.1 Matriels ...................................................................................................................... 33 a) b) a) Le matriel vgtal ...................................................................................................... 33 Le matriel technique .................................................................................................. 34 Dispositifs pour la dcontamination des graines ......................................................... 34
II.2.1.Techniques exprimentales............................................................................................. 34 a.1) Avec Na Cl O 12%..................................................................................................... 35 a.2) Avec Ca (O Cl2) 5%................................................................................................... 35 b) Influences des facteurs pour la germination des graines ............................................ 36 II.2.1.3 Critre de germination ................................................................................................ 38 II.2.1.4 Traitements de donnes .............................................................................................. 38 II.2.2 La culture " in vitro" de Kalanchoe synsepala (BAKER)............................................ 39 II.2.2.1 Matriels ...................................................................................................................... 39 II.2.2.2 Mthodes de travail...................................................................................................... 39 a) Partie I : Induction de cal et bourgeonnement vgtatif.............................................. 39 a.1) Mthode de strilisation et dsinfection............................................................................ 39 a.2) Mise en culture ou inoculation .......................................................................................... 40 a.3) Critres dvaluation ......................................................................................................... 40 a.3.1) Formation de cals idaux ........................................................................................... 40 a.3.2) Etablissement de suspensions cellulaires embryognes ou SCE ............................... 40 a.3.3) Formations dembryons ............................................................................................ 40 a.3.4) Potentiel de rgnration ........................................................................................... 41
a.4) Choix du dispositif exprimental et exprimentations ...................................................... 41 a.4.1) Dispositifs exprimentaux pour la strilisation et la dsinfection des explants......... 41 a.4.2) Dispositifs exprimentaux pour la culture "in vitro" ................................................. 41 b) Partie II : Rgnration en plantules ........................................................................... 42 b.1) Mthode de travail ............................................................................................................ 42 b.2) Choix du dispositif et exprimentation ............................................................................. 42 PARTIE III : RESULTATS et INTERPRETATIONS ................................................................... 43 III.1 Rsultats des essais sur la germination des graines............................................................. 43 III.1.1 Rsultats des essais sur la dcontamination des graines.............................................. 43 III.1.1.1 Avec Na Cl O 12% .................................................................................................. 43 III.1.1.2 Avec Ca (O Cl2) 5% ................................................................................................ 43 III.1.1.3 Traitements des donnes ............................................................................................ 44 a) b) Analyse de variance .................................................................................................... 44 Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% ............................................................... 44
III.1.2.1 Essais relatifs la capacit de germination ............................................................... 46 III.1.2.2 Essais relatifs la vitesse de germination ................................................................. 47 III.1.2.3 Traitements des donnes ............................................................................................ 48 III.2 Rsultats des essais sur la rgnration "in vitro" de lespce........................................... 54 III.2.1 Rsultats des essais sur la dcontamination des explants............................................ 54 III.2.1.1 Avec Na Cl O 12% .................................................................................................. 54 III.2.1.2 Avec Ca (O Cl2) 5% ................................................................................................ 54 III.2.1.3 Traitements des donnes ............................................................................................ 55 a) b) Analyse de variance .................................................................................................... 55 Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%............................................................... 55
III.2.2 Rsultats des essais sur la culture " in vitro" de lespce............................................ 56 III.2.3 Rsultats des essais sur la rgnration en plantules de lespce................................ 64 III.2.4 Limites des techniques de multiplication effectues. ................................................... 67 IV. DISCUSSIONS.............................................................................................................................. 68 IV.1 Discussions mthodologique .................................................................................................. 68 IV.2 Discussions des rsultats ........................................................................................................ 68 V. PROPOSITION DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET REGENERATION DE Kalanchoe synsepala (BAKER) .................................................................. 70 V.1 Protocoles exprimentaux proposs pour la dcontamination et la germination .............. 70 V.2 Protocoles exprimentaux proposs pour la dcontamination et la rgnration ............. 72 V.3 Perspectives pour la culture "in vitro" de lespce ............................................................... 74 CONCLUSION.................................................................................................................................... 75 BIBLIOGRAPHIE .............................................................................................................................. 77
Introduction __________________________________________________________________________________
INTRODUCTION
La communaut internationale est, prsent, sensibilise au problme de lutilisation durable des ressources naturelles et de la prservation de la qualit de lenvironnement, pour les gnrations prsentes et futures. On assiste la naissance dune thique de lenvironnement qui suggre dutiliser sans abuser et de rduire les contraintes de lenvironnement. Le grand public, est trs concern, dans de nombreuses rgions du monde, en particulier par la dforestation dans les pays tropicaux, par la dgradation de lenvironnement dcoulant de la transformation de certains produits forestiers ligneux et non ligneux dans les pays industrialiss (Unasylva 169, vol 43,1992). Il est, par consquent, ncessaire de prvoir les besoins du futur car la destruction, voire lextinction mme de diverses espces, se fait sentir et cela exige des moyens immdiats pour une gestion durable, do la ncessit des recherches fondamentales ou appliques, des amnagement forestiers, du transfert de technologies et dassistance financire pour chaque espce. Actuellement, des recherches effectues sur plusieurs filires ligneuses et non ligneuses, refltent cette volont de prserver et damliorer la gestion de certaines espces: Prunus africana, soignant la prostate ou du Raffia farinifera, reprsentant lune des ressources les plus importantes pour lexportation. Remarquons que la gestion durable de ces ressources naturelles se base sur la matrise de la rgnration de ces espces, surtout Madagascar o lon constate une dgradation permanente et continue de ces ressources. De plus, la Commission de la sauvegarde des espces de lUICN (International Union for Conservation of Nature) recommande la reproduction en nombre de certaines espces malgaches qui sont en voie dextinction. Cette rgnration des espces fait partie de la "biotechnologie" qui offre une panoplie de techniques savoir: la multiplication des vgtaux "in vitro", la slection gnotypique "in vitro"ou embryogense somatique, la conservation "in vitro" de matriel gntique, ainsi quune technique appartenant au domaine de la gntique molculaire: marqueurs molculaires, transformations gntiques, etc. La multiplication vgtative seffectue en prouvette ou dans un rcipient analogue au laboratoire, cest pour cette raison que lon qualifie cette technique de multiplication vgtative "in vitro". A lheure actuelle, les gnticiens du monde entier sacharnent accrotre la production des explants slectionns, grce aux techniques de cultures "in vitro": culture de mristme, micropropagation, ou embryogense somatique, des techniques dveloppes depuis une dizaine danne. En effet, les tres vivants ont un caractre de pouvoir se reproduire. Divers processus ont t dvelopps mais, malgr leur diversit, ils peuvent tre groups en deux grands types: le premier est la reproduction sexue, faisant intervenir des structures reproductrices particulires. Chez les plantes suprieures, il sagit des fleurs, qui, aprs fcondation des ovules par les anthrozodes, forment des graines capables dvoluer en organismes similaires ceux qui les ont gnres. Le second type est la reproduction asexue, par laquelle un organisme est capable den gnrer un autre sans lintervention de structures reproductrices spcifiques. Lhomme a largement exploit les possibilits de reproduction asexue des vgtaux; il sagit de penser limportance quont pris, actuellement, des techniques comme le greffage, le bouturage ou le
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-1-
Introduction __________________________________________________________________________________ marcottage. Nous allons mettre en exergue dans ce travail la matrise de la rgnration "in vitro" de plantes suprieures non ligneuse grce aux divers processus de reproduction par voie sexue et par voie vgtative (asexue). Ces diverses techniques de multiplication vont tre effectues sur une plante endmique malgache, qui fait lobjet dune recherche intense actuellement, grce sa proprit thrapeutique. En effet, cest une plante crassulescente dont les extraits sont classs parmi les substances Kalanchoe synsepala (BAKER). Lobjectif de ce travail est dlaborer et de mettre au point des protocoles exprimentaux pour la germination des graines et la rgnration par voie vgtative "in vitro" de cette espce, par lapplication des diffrentes techniques exprimentes sur des espces ligneuses et non ligneuses, aux diffrents centres de recherches (CNRE, IMRA, CNARP, FOFIFA et aux laboratoires trangers : Musum des Sciences Naturelles de PARIS). Ainsi, dans la premire partie du travail, lapplication de la technique de multiplication par voie sexue, cest--dire, lessai de germination des graines, va tre effectu et les protocoles exprimenter rsident surtout dans les techniques de dcontamination des graines suivies de la germination proprement dite. Dans la seconde partie, le protocole de rgnration par voie vgtative sera mis au point, en exprimentant trois techniques de culture "in vitro" savoir: la culture de mristme, la culture dorgane diffrenci et lembryogense somatique. Dans chaque cas, il sagit dlaborer le protocole de dcontamination des explants et le protocole de culture proprement dite en matrisant les diffrents facteurs qui peuvent influencer sur la rgnration des explants mis en culture. Le recoupement de toutes ces techniques aboutira llaboration de techniques spcifiques visant court terme, la rgnration et multiplication en nombre de lespce et long terme, la valorisation de lespce (conservation et gestion durable). Notre plan dtude est ainsi caractris en premier lieu par: immunostimulantes. Le matriel vgtal est donc une plante succulente appartenant la famille des CRASSULACEAE:
une synthse bibliographique concernant le matriel dtude et les diffrentes techniques de
germination et de culture "in vitro"; les descriptions de la dmarche mthodologique et lexprimentation des diffrentes techniques de
multiplication "in vitro": la germination des graines, la rgnration "in vitro" par les techniques de culture de mristme, la micropropagation et lembryogense somatique;
- et les rsultats obtenus avec les diffrentes techniques de culture, suivis de la proposition des
protocoles exprimentaux favorables la germination des graines et la rgnration de lespce.
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-2-
Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

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PARTIE I : ETAT DE CONNAISSANCE I.1 GENERALITES SUR Kalanchoe synsepala (BAKER), Famille des CRASSULACEAE.
La gnralit sur lespce consiste ltablissement dune base de donne aussi complte que possible, rsumant ainsi, tous les travaux antrieurs (bibliographique, enqutes etc.) et les travaux en cours. Ces travaux se situent dans le cadre biologique sur la morphologie externe de lespce avec ses diffrents organes, lcophysiologie: tout ce qui concerne le mtabolisme et la phytochimie: concernant sa structure et son utilisation.
I .1.1 Description botanique et biologique du matriel dtude

Etymologiquement, Kalanchoe vient dun mot chinois signifiant: " qui tombe et qui pousse " (ALLORGE-BOITEAU L, 1996) et lespce synsepala, signifiant une espce de Kalanchoe spale soud, (BOITEAU P, 1995). Lespce appartient aux catgories des produits forestiers dites accessoires car lespce est une plante mdicinale. En effet, les extraits de la plante sont utiliss principalement pour soigner et gurir certaines maladies lies surtout limmunodpression (RABOTOVAO L, 1993). Kalanchoe synsepala (BAKER) est une plante herbace, non ligneuse, grasse, succulente et endmique de Madagascar, appartenant la Famille des CRASSULACEAE, o le nombre de chromosome est gal 17 (FRIEDMANN F, 1975). Cest une espce rupicole, poussant sur les versants et massifs dnuds ou des inselbergs et stablit surtout sur de lhumus caractris par des substances organique et minrale prpondrantes (RABOTOVAO A S, 2001). Lespce constitue donc une richesse qui reste encore explorer profondment lheure actuelle tant au niveau biologique, physiologique et immunologique mais aussi en vue de sa conservation pour une gestion durable de lespce.
I .1.1.1 Systmatique
Daprs Berger en 1930, ltude taxonomique de lensemble de la sous-famille des Kalanchodeae, appartenant la famille des CRASSULACEAE, a diffrenci 3 genres, savoir : Kitchinga, Bryophyllum et Kalanchoe (RAVELOMANANA D, 1993). Cette dernire est bien reprsente Madagascar, surtout par les nombreuses espces qui sont toujours intressantes et parfois trs brillantes (PERRIER DE LA BATHIE, 1923). On trouve les Kalanchoe hors de Madagascar: en Afrique et en Asie, sur les terres qui entourent lOcan Indien et au Brsil. Le genre Kalanchoe, cre par ADANSON en 1763 et dans lacception de
HAMET R
en 1908, comporte 60 espces Madagascar (FRIEDMANN F, 1975). Kalanchoe synsepala
(BAKER) appartient donc au Groupe Naturel Ferm de Kalanchoe malgache: ces carpelles sont convergentes et la corolle est trangle sur les carpelles ou nettement rtrcie sur une partie, les styles sont plus longues que les carpelles et les inflorescences sont axillaires (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).
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Pour la cl des espces, seul les inflorescences de Kalanchoe synsepala (BAKER) se transforment en stolons, tous les deux nuds (CREMERS G et SELL Y, 1986). Synopsis du Kalanchoe synsepala (BAKER) La classification systmatique de notre matriel dtude Kalanchoe synsepala (BAKER): Rgne : VEGETAL Sous rgne : EUCARYOTE Embranchement : CORMOPHYTES Sous-embranchement : ANGIOSPERME Classe : DICOTYLEDONE Sous-classe : ROSIDAE Ordre : ROSALES Famille : CRASSULACEAE Sous-famille : KALANKHOIDEAE Groupe : TRICHANTAE (XIIme Groupe) Genre : Kalanchoe Espce : synsepala Nom vernaculaire: sofimbitro, sofimbato, sofingoaika, zahana sur les Hauts plateaux sofintsofiny, mongy vola, mongy vato dans le Sud Ouest.
Echelle 1/5me
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Figure 1 : Morphologie gnrale du Kalanchoe synsepala (BAKER)
I.1.1.2 Morphologie
Kalanchoe synsepala (BAKER) est une espce herbace, vivace, atteignant rarement 20 cm de hauteur, avec quelques stolons de 20 40 cm de longueur (RABOTOVAO A S, 2001). Elle croit sur des pentes rocailleuses, dans des endroits lgrement abrits du grand soleil ou dans des stations isoles sur des rochers dnudes (CREMERS G et SELL Y, 1986).
a) Feuille
Ces feuilles sont glabres, plus glauques, toujours vertes pendant toute lanne, plus ou moins garnies de dents irrgulires molles et bordes dune couleur plus fonce ou marron rose que le reste du limbe (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Lespce est remarquable par ces feuilles toujours au nombre de 4, opposes dcusses. Chaque groupe de feuille tant spar des feuilles de lanne suivante par des feuilles rudimentaires qui se dveloppent en saison sche (PERRIER DE LA BATHIE, 1923).
b) Tige
Cest une espce acaule (ALLORGE-BOITEAU L, 1996), cest--dire que la tige est courte. Elle demeure trs courte si bien que les feuilles semblent tre disposes en rosette au ras du sol, il nexiste donc pas de tige vritable, parfois, avec des entre-noeuds trs courts (RABOTOVAO A S, 2001). Seulement quand la plante devient ge, il apparat une tige ligneuse arienne, assez haute et robuste, possdant des traces de ptioles, atteignant 40 cm au plus. Cette tige est toujours rige, sans ramification, portant toujours des feuilles opposes dcusses (RABOTOVAO L, 1993).
c) Racine
La racine a gnralement peu dimportance, souvent courte et fascicule et ne senfonce gure dans le sol et ne stend point (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Elle est superficielle, latrale possdant de nombreuses racines secondaires, se dveloppe toujours sur un sol humique plus humide et prenant moins dextension (RABOTOVAO A S, 2001).
d) Stolons
Lespce synsepala prsente une mode de multiplication vgtative asexue assez particulire: les stolons. Ils naissent laisselle des feuilles, le plus souvent, de deux feuilles opposes. Ils sont constitues par une hampe florale denviron 40 50 cm de long, pourvus de deux bractes opposes et supportant une plantule par stolons. Ils sont produits en mme temps que les inflorescences. Souvent, ce sont ces inflorescences qui sont avortes en stolons, sinon, ils sont produits plus hauts sur laxe orthotrope que celle-ci (CREMERS G et SELL Y, 1986). Leur rle est de propager lespce pendant une priode vgtative trs lente en surface. La jeune plante est non seulement nourrie par la plante mre, mais encore retenue par le stolon sur le roc lisse
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jusqu ce quelle sy cramponne en accumulant des dbris vgtaux grce au dveloppement de racines adventives leur pied (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).
I.1.1.3 Biologie florale a) Inflorescence

Linflorescence est souvent compacte, en dichasium, comportant une trentaine de fleurs dresses. Les fleurs sont petites, blanche ou rose; le calice est vert ple, couvert de poils glanduleux trs courts (RABOTOVAO L, 1987).
b) Graine
Les graines de lespce sont gnralement trs petites, de lordre du millimtre. Lobservation la loupe binoculaire montre une grande homognit des graines de toutes les espces tudies dans les diffrentes stations. Elle se prsente comme une petite bourse resserre une extrmit, arrondie lautre, prsentant des sillons longitudinaux observables. Lornementation du tgument sminal, par contre, nest perue quen employant un grossissement important avec un microscope lectronique balayage. Ainsi, laspect pubescence obtenue fort grossissement est une extension de la cuticule, donnant des plis divers la fois par leur longueur, leur orientation et leur forme. Cette ornementation joue sans doute un rle dans la dissmination de la graine par le vent (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).
I.1.1.4 Phnologie de lespce

Les observations phnologiques ont pour but de connatre : le cycle biologique de la plante, cest--dire, la priode de floraison et de la fructification de ces espces la priode de maturation des fruits et des graines. Ainsi, des observations phnologiques ont t effectues dans cinq (5) localits o poussent lespce tudie : Ambatokely, Antongona, Manerinerina, Ambalavao, et Ampanihy. Les observations ont t effectues dans toutes les localits et se sont droules pendant la priode de Septembre 2003 Mars 2004. Les rsultats de ces observations sont rsums dans le tableau suivant: Tableau 1 : Les observations phnologiques concernant lespce Kalanchoe synsepala (BAKER) Localits Ambatokely Manerinerina Antongona Nom vernaculaire Zahana Sofintsofiny Sofingoaika Floraison Fev-Mars Mai-Juin Fev-Mars Fructification Mai Aot Mai Date de maturation des fruits Juillet Octobre Juillet
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Ambalavao Ampanihy
Sofimbato Mongy vola
Avril-Mai Juin-Juillet
Juillet Aot
Aot Septembre-Oct
I.1.1.5 Mode de multiplication

La plante possde deux modes de multiplication comme nous lavons nonc auparavant, sexue: partir de la graine dissmines par le vent et asexue: partir de la formation des stolons emprunts linflorescence. Seulement cause de la prcarit des conditions o se trouve lespce, rares sont les graines qui germent en labsence des conditions optimales de germination telle une temprature ambiante adquate, humidit relative suffisante. On constate par ailleurs que la rgnration naturelle par la graine autour dune plante mre reste insignifiante. Seules subsistent les plantules dj pourvues des deux premires feuilles et des racines adventives qui commencent accumuler quelques dbris de matires organiques, provenant de la plante-mre, lesquelles restent attaches au stolon jusqu 4 ou 5 mois. Des tudes plus rcentes ont montr que lcotype dAmbatokely (Carion) prsente une certaine forme de bulbilles racinaires qui se forment sur des racines secondaires.
I.1.1.6 Mode dadaptation cophysiologique: Mtabolisme C.A.M

Ladaptation au manque deau de lespce est trs remarquable car la plante peut survivre mme aprs un mois tout en tant dracine. Telle des adaptations morphologiques comme la crassulescence des feuilles, son positionnement vertical pouvant assurer une protection efficace contre la transpiration et lpaississement de la cuticule ou la formation de revtements cireux ou rsineux rflchissant la lumire (RABOTOVAO A S, 2001). Mais parmi ces diverses modes dadaptation, la plus importante reste ladaptation physiologique et anatomique qui est le mtabolisme "C.A.M" (Metabolism Acid Crassulaceae) de lespce (RABOTOVAO L, 1993). En effet, la plante prsente un type de photosynthse spciale, flexible, particulire se droulant avec un comportement stomatique particulier car louverture des stomates lieu pendant la nuit et leur fermeture au cours de la journe. Toutes les plantes prsentant ce type de photosynthse particulire sont situes dans des zones o elles ont subir des alternances dhumidit et de scheresse selon des chelles des temps diffrentes et devoir surmonter une contrainte hydrique prolonge. Ce mode de photosynthse "C.A.M" prsente donc lavantage cophysiologique dviter les pertes deau excessives tout en prservant lentre de carbone lintrieur de la plante. Notre espce prsente ce type de photosynthse "C.A.M" extrme, pour laquelle, labsorption du CO2 se fait uniquement la nuit (ralisant la meilleure conomie deau).
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Ceci a t tudi partir de la mesure de la composition isotopique des feuilles pour le carbone: pour notre espce:
RAVELOMANANA D,
13
C = - 11,15 (Origine chantillon CATAT) (KLUGE et al, 1991 in:
1993).
I.1.2 Ecologie I.1.2.1 Exigence cologique de la plante

Etant donn les variations morphologiques intraspcifiques de lespce (RABOTOVAO L, 1987), on peut tout de suite sattendre une diversit des niches cologiques dans lesquelles les plantes subsistent, allant des inselbergs du Plateau Central de Carion, sur le massif gneissique dAmbalavao, et les grs sdimentaires dAmpanihy. Kalanchoe synsepala serait donc adapt aux rocailles dnudes, aprs la disparition du couvert (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Lespce est adapte aux conditions daridit climatique et vivant dans des zones prsentant, au cours de lanne, des priodes de scheresse. Dans certains cas, le sol reste pauvre et la croissance dpendra surtout de la disponibilit en eau et de la temprature qui activera son mtabolisme. Dans ce cas, il est primordial pour lespce dassimiler le maximum de nutriments par la photosynthse et la nutrition minrale avec un minimum de perte en eau. Le stress hydrique d une longue priode de scheresse et une augmentation incessante de la temprature de plus de 60 C (RAVELOMANANA D, 1993), bloquent rapidement le mcanisme dchange de la plante avec le milieu extrieur et la plante se desschent. Les tudes pdologiques dans les aires de rpartition de lespce montrent quelles poussent toujours sur des "lithosols". Ce sont des affleurements rocheux de composition Quartz-feldspathique (roche acide), tels que granite, gneiss, leptynite, migmatite ou grs argileux. Sous laction du couple altration-dsagrgation, ces roches prsentent des fissures qui emmagasinent les produits daltration, savoir les minraux I (sables de nature quartzeux, feldspathiques, micas,...), les minraux II (argiles, complexes hydroxyls,...) et les matires organiques (feuilles mortes, etc.) du milieu environnant pour former des complexes "organo-minraux" de couleur noire et dpaisseur variable entre 5 10 cm selon la fissure. Ce milieu organo-minral constitue le sol favorable au dveloppement de lespce. Ce sont des lithosols roche mre aride conditionne par une humidit importante; cest la raison pour laquelle, les espces poussent toujours en altitude leve. De ce fait, elles absorbent directement leurs lments nutritifs sur ces roches en voie daltration. Ces lments sont sous forme solubles, do limportance de lhumidit pour solubiliser ce complexe organo-minral. Ltude de la rgnration naturelle a montr quil est trs rare dobserver aux alentours de 20 30 cm de la plante adulte, des plantules issues de la germination des graines. Seules subsistent quelques plantules accroches aux stolons jusqu ce quelles senracinent et pourront accumuler de lhumus pour sy fixer. Nanmoins, la raret de lespce dans toute lle est perue et on la trouve de moins en moins tmoignant ainsi une diminution progressive de leffectif.
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I.1.2.2 Rpartitions gographiques et variabilit biologique de lespce

Des recherches, entreprises par RABOTOVAO L depuis 1987, concernant la variabilit biologique de lespce, ont montr que lespce pouvait tre subdivise en sous-espce ou varit, souvent morphologiquement peu distincte, mais prsentant une localisation gographique diffrente. Ces diffrences morphologiques sattnuent ainsi, au point quelles ne soient plus distinctes que par des caractres physiologiques comme la teneur en principe actif de la plante. Elles se trouvent alors simplement dans des stations cologiquement diffrentes, on les appelle ainsi : cotype, qui est donc un reprsentant ou un chantillon de lespce modifi par rapport au type fondamental par suite de laction du milieu environnant. Il a t dmontr ainsi lexistence de 8 cotypes correspondant se rpartissent dans 5 localits, savoir: Ambatokely (CARION), au Pk 30, sur RN2, au versant ouest dun dme granitique; Position gographique: S 1853.146; EO 4741.044 Altitude: 4 653 4 671 pieds* soit 1 418,2 1 423,7 m Antongona, Pk 32, sur la route dArivonimamo (bifurcation Imerintsiatosika); Position gographique: S 1856.424; EO 4716.994 Altitude: 4 561 4 782 pieds soit 1 390,2 1 457,5 m Manerinerina, Pk 135, sur RN4, route de Majunga (pont Andranofeno Nord); Position gographique: S 1805 125; EO 4710.552 Altitude: 4 144 4 163 pieds soit 1 263,1 1 268,9 m Ambalavao, sur RN7, route menant vers Tular; Position gographique: S 2204'112; EO 4612'646 Altitude: 4 589 4 678 pieds soit 1 398,7 1 425,8 m Ampanihy, sur RN10, route menant vers Fort Dauphin; Position gographique: S 2441'802; EO 4441 521 Altitude: 4 121 4 140 pieds soit 1 256,1 1 261,9 m. _____________________________________________________________________________
* 1 pied = 0,3048 m (unit anglo-saxon)
dans toute lle, grce des analyses
statistiques sur des mesures prises concernant les organes reproducteurs et vgtatifs. Les 8 cotypes
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Figure 2 : Les aires de rpartition de Kalanchoe synsepala (BAKER)
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I.1.2.3 Milieu dtude

Les cinq localits reprsentant les cotypes de lespce ont servi de milieu dtude.
a) Le site Ambatokely
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome d Antananarivo, sous-prfecture de Manjakandriana, situ entre 1853,146 de latitude Sud et 4741,044 de longitude Est. Il se trouve environ 30 km sur la RN2, et constitu de dmes granitiques atteignant 1 400 m, prsentant aux alentours quelques forts secondaires de montagne et se trouve une altitude de 1 418,2 1 423,7 m. Laire dimportance de lespce est localise sur des inselbergs (Figure 3A), dfinis comme des communauts locales isols sur des affleurements de rochers, en milieu tropical. Linselberg constitue des biotopes remarquables avec une forte proportion despces endmiques (Euphorbia, Kalanchoe, Pachypodium etc.). La vgtation des sommets granitiques est fragmentaire et trs riche en xrophytes et plantes succulentes formant de large tapis sur sol humifre trs peu profond. . Facteurs climatiques : le climat est celui du Plateau Central de lle avec deux saisons marques, nuances localement par des brumes matinales mme pendant la saison sche. Il est arros de 1 226,9 mm de pluie, pendant lt, avec une temprature moyenne annuelle de 17 28 C et une priode hivernale sche de 4 7 mois (climat sub-humide). . Relief et topographie : en gnral, le relief est lev constitu par plusieurs massifs granitiques et des lots rochers nus et lisses (des inselbergs). . Pdologie : elle est constitue par des vieilles roches granitiques, ayant subi des dgradations dans le temps ont form des gisements latritiques pais de 30 m dpaisseur environ. Les roches sont teintes de rouge par la prsence doxydes de fer et se sont rodes, pour former des lots montagneux. Ceux-ci sont frquemment de formes rgulires, aplaties et polies par le cours rapide des eaux. . Flore : le site est non afforest. La vgtation de ces sommets sont fragmentaires et abritent des formations vgtales plus ou moins intactes dues au fait quils sont protgs par les feux de brousse, ces inselbergs sont constitus principalement des plantes crassullescentes endmiques.
b) Le site Antongona
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome dAntananarivo, Rgion de lItasy, Prfecture dArivonimamo, il est situ entre 1856.424 de latitude Sud et 4716.994 de longitude Est une altitude denviron 1 390,2 1 457,5 m, soit au environ de 1 400 m vers la route menant au "Rova dAntongona". La formation gologique est constitue par des ortho-gneiss de nature quartzo-feldspathique avec de minraux Fe-Mg, biotite et amphibole. Cet affleurement rocheux se trouve en altitude leve avec humidit importante (Figure 3B).
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. Facteurs climatiques : le climat est celui du Plateau Central de lle. La prcipitation annuelle est de 1 481,3 mm, principalement lt, avec une temprature moyenne annuelle de 17 24 C et une priode hivernale sche stalant trois mois de Juin Aot. . Relief et topographie : la topographie est leve et constitue par des reliefs de dessiccation des massifs cristallins. . Flore : la vgtation de ces reliefs abrite des formations vgtales plus ou moins semblables celles dAmbatokely. Les reliefs granitiques abritent galement des plantes crassullescentes telles les alos et les xrophytes.
c) Le site de Manerinerina
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome d Antananarivo, Rgion de Vonizongo Marovatana, dans la prfecture dAnkazobe, sur le plateau de Tampoketsa, situ entre les coordonnes S : 18 05 125et EO : 47 10 552, une altitude 1 263,1 1 268,9 m et travers par le fleuve dAndromba, au pont d Andranofeno. La nature des roches- mres est un gneiss et leptynite de composition quartzo-feldspathique. Cet affleurement est travers par une rivire favorisant laltration et lhumidit du milieu (Figure 3C-D). Lespce sinstalle avec dautres plantes grasses dans des zones daltration rocheuse contenant des litires superficielles avec les minraux dtritiques quartzo-feldspathique et des argiles daltration , comme dans les autres localits. . Facteurs climatiques : le climat est celui du Centre de lle: il est arros par 1 430,1 mm de pluie, principalement lt, avec une temprature moyenne annuelle varie de 17 23 C avec une priode hivernale sche de 4 mois (Mai Aot). . Relief et topographie : en gnral, le relief est aplati, formant le plateau de Tampoketsa. Le site rsultait donc dun aplanissement de relief et de dessiccation de massifs cristallins. . Flore : la vgtation de ces plaines est constitue par des Gramines et une vgtation dgrade par le passage des feux de brousse chaque anne. Nanmoins, sur les affleurements des rochers abritent des plantes crassullescentes et xrophytiques.
d) Le site dAmbalavao
. Localisation : le site se trouve dans la province Autonome de Fianarantsoa, Rgion de Horombe, Prfecture dAmbalavao et situ entre les coordonnes S : 21 57 155 et EO : 46 44 337 une altitude de 1 398,7 1 425,8 m, sur la route menant vers Tular. La formation gologique est constitue par des ortho-gneiss de nature quartzo-feldspathique avec de minraux Fe-Mg, biotite et amphibole. Cet affleurement rocheux se trouve en altitude leve avec humidit importante (Figure 3 E). Laltration et la dsagrgation svissent galement, entranant toujours la formation des fissures,
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accumulant les produits daltration (minraux lourds, argile daltration,...) et les matires organiques environnants. Cette formation constitue le complexe organo-minral superficiel sur la roche-mre acide, favorable au dveloppement du Kalanchoe (lithosols). . Facteurs climatiques : le climat est de type tropical daltitude (LE BOURDIEC, 1969 in :
PLARM), la pluviomtrie annuelle est de 1265,1 mm et les mois les plus arross sont Dcembre et
Janvier. La saison sche dure quatre mois, de Mai - Aot. La temprature ne dpasse pas 25C pendant le mois le plus chaud (Octobre) et peut atteindre jusqu 6,1C durant le mois le plus froid (Juillet). . Relief et topographie : comme dans les autres localits, le relief est lev, constitu par un plateau cristallin trs abrupt. Le massif granitique comprend une srie de dmes rocheux gigantesques et une chane de rochers aux artes troites. . Flore : elle est surtout caractrise par une vgtation herbace trs pauvre et la zone est presque entirement couverte par des gramines parcourues rgulirement par le feu.
e) Le site dAmpanihy
. Localisation : le site dAmpanihy se trouve dans la province Autonome de Tular, Rgion dAtsimo Andrefana, dans la Sous-prfecture dAmpanihy, situ entre S : 24 41 802et EO : 44 41 521, une altitude de 1 256,1 1 261,9 m. Lespce pousse sur un grs sdimentaire altr dAndriamisara. Dans cette rgion, lespce pousse sur les affleurements grseux ( argilites rouges). Le site se trouve une altitude moyenne pouvant ainsi prserver lhumidit et favorisant la solubilit du complexe organo-minral (Figure 3 F). . Facteurs climatiques : le climat est de type semi-aride avec une prcipitation moyenne de 656,28 mm et caractris par une saison sche prolonge trs marque hiver froid. La priode sche dure sept mois sur douze. La temprature moyenne est de 23,8C. . Relief et topographie : le relief est gnralement plat, constitu de massifs grseux formant les aires dimportance de la plante, accompagne de plusieurs espces dEuphorbia en particulier Euphorbia et Alluaudia. . Pdologie : le sol grseux se prsente sous forme de cuirasses et, il y a des fissures
daltration qui emmagasinent les sables et argiles daltration avec les matires organiques (feuilles, tiges mortes etc.) des plantes environnantes. Une formation organo-mineral est prsente (couche A) dune paisseur variant entre 10 15 cm sur ces cuirasses. . Flore : elle est constitue par des Fourrs xrophiles dgrads ou des Fourrs xrophiles dominance du bush. Notons que le sol est occup par les dfrichements continus pour des cultures permanentes de mas.
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Tableau 2 : Les facteurs physiques et biologiques des milieux dtudes
Ambatokely Localisation S 1853,14 EO 4741,04
Antongona S 1856.42 EO 4716.99
Manerinerina
Ambalavao S 215715 EO 464433
Ampanihy S 244180 EO 4441 52
S 180512 EO 471055
Altitude
1 418,2 1 423,7 m
1 390,2 1 457,5 m
1 263,1 1 268,9 m
1 398,7 1 425,8 m
1 256,1 1 261,9 m.
Situation Prcipitation annuelle Temprature moyenne annuelle Type de climat (LE BOURDIEC, 1969)
Plateau Central 1 226,9 mm 17 18C Tropical daltitude Inselberg Domaine du socle cristallin Sols ferralitiques rajeunis, enrichis en minraux peu altrables, structure plus ou moins dgrade Fort dense humide
Centraleouest 1 481,3 mm 17 18C Tropical daltitude Dme granitique Domaine du socle cristallin
Centre-nord 1 430,1 mm 17 18C Tropical daltitude Affleurement rocheux Domaine du socle cristallin Sols ferralitiques fortement rajeunis structure plus ou moins dgrade
Centre-sud 1265,1 mm 11 12C Tropical sec Dme granitique Domaine du socle cristallin Sols ferralitiques rajeunis, enrichis en minraux peu altrables, friables Fort dense humide de moyenne altitude Vgtation graminenne
Sud 656,28 mm 23,8C Tropical semi-aride Massif grseux Domaine sdimentaire
Facteurs physiques
Relief et gologie
Gomorphologie
Pdologie
Sols ferralitiques facis humifre sous forts.
Sols sableux rouge facis humifre local
Facteurs biologiques
Principales formations climaciques et climatiques Principales formations dgrades
Fort dense sclorphylles
Foret ripicoles ou alluviale
Fourrs xrophiles dgrads
Vgtation graminenne
Vgtation graminenne
Vgtation graminenne
Savoka
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Les tudes effectues dans ces diffrentes zones montrent que le milieu pdologique du Kalanchoe est caractris par : un lithosol form par des affleurements rocheux de nature quartzo-feldspathique et riche en silico-alumineux qui saltrent en complexe minraux argileux, une association de dbris rocheux (sablo-argileux) provenant de laction altration-dsagrgation qui saccumulent dans des fissures, et sassocient entre les matires organiques des plantes environnantes pour former des couches ou horizons superficielles "organo-minrales" favorables au dveloppement de la plante. Ce milieu se trouve en gnral, dans une zone haute altitude, entre 1 250 et 1 425 m daltitude avec une humidit importante, facilitant, labsorption directe par la plante des lments dissous tels que K+, Na+, Ca++ provenant de laltration des roches mres acides. Sur les rochers recouverts de pelouses xrophytes du Domaine central et du Sud de Madagascar, les habitats se diffrent par leurs conditions daphiques et microclimatiques do la notion dcotype entre les espces (RABOTOVAO L, 1993). La vgtation est expose de fortes radiations solaires, des tempratures leves, et les dficits hydriques provoquent des contraintes svres, accentues par labsence ou la faible profondeur des sols. Les conditions climatiques ne sont viables que lorsque la plante dveloppe des stratgies adaptatives comme la crassulescence des feuilles, lmission des organes modifis pour la multiplication vgtative et enfin une adaptation physiologique telle que le "Mtabolisme Acide des Crassulaceae " (C.A.M) de lespce. Lorsque la pente est localement faible, on constate une implantation despces pionnires, puis un sol recouvert dhumus avec des lots de vgtation. Des relevs floristiques ont t effectus et ont permis dobserver des communauts vgtales dimportance variable telles que : des rosettes dAloe capitata (LILIACEAE), de Kalanchoe synsepala (CRASSULACEAE), des espces dOrchide (ORCHIDACEAE) et enfin de Xerophyta dasylirioides (VELLOZIACEAE). Ces plantes sont soit isoles, soit runies, formant des microcommunauts sur quelques dm2 de surface (Figure 4). Tableau 3 : Les espces caractristiques du type dhabitat o pousse lespce
Nom scientifique Famille LILIACEAE LILIACEAE ORCHIDACEAE ORCHIDACEAE VITACEAE ASCLEPIADACEAE EUPHORBIACEAE EUPHORBIACEAE CRASSULACEAE CRASSULACEAE CRASSULACEAE APOCYNACEAE APOCYNACEAE ASTERACEAE VELLOZIACEAE VELLOZIACEAE Nom vernaculaire
Aloe capitata Aloe macroclada Angraecum magdalenae Angraecum sororium Cissus quadrangularis Cynanchum perrieri Euphorbia milii var.breoni Euphorbia milii var. splendens Kalanchoe tubiflora Kalanchoe prolifera Kalanchoe synsepala Pachypodium brevicaule Pachypodium rosulatum Senecio crassissimus Xerophyta dasylirioides Xerophyta pinifolia
Sahondra Vahona Vakoambatolahy Tohitohy Songosongo Tingotingo Sodifafana Sofintsofiny Kimonoina Somona Tongotrakoho Ringimbato
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Figure 3 : Les milieux naturels de Kalanchoe synsepala (BAKER). Vue densemble des massifs A : Ambatokely, B : Antongona, C et D : Manerinerina, E : Ambalavao et F : Ampanihy
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Figure 4 : Vues rapproches de la communaut vgtale tudie G et I : Kalanchoe synsepala, H : plantes pionnires Xerophyta dasylirioides, Aloe vahombe, J : Angraecum sororium, K et L : Kalanchoe synsepala poussant sur les rocailles Ampanihy et Ambatokely
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I.1.3 Proprit biologique et phytochimique du Kalanchoe synsepala (BAKER) I.1.3.1 Proprit biologique
Depuis trs longtemps, la plante a t utilise par les paysans, surtout en mdecine traditionnelle et cela a t vrifi par des enqutes ethnobotaniques que nous avons effectues dans diverses rgions de lle. Elle peut gurir plusieurs sortes de maladies et considre comme plante endmique de Madagascar et non toxique (BOST R, 1961 in: PLARM). Les rserves deau contenues dans les feuilles paisses sont utilises par les indignes qui les mchent pour se dsaltrer lorsquils voyagent dans les montagnes o pousse la plante (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Pour lusage traditionnel, les utilisations sont regroupes dans le tableau 4 suivant, daprs les enqutes effectues sur terrain auprs des tradipraticiens, "tangalamena ", matrones, populations locales, etc. Tableau 4 : Les usages thrapeutiques de lespce
Plante Indications (Traumatisme) Brlures et entorses (Paludisme) Fbrifuge (Maladie cutane et lpre) Ulcre Oreillons Plante entire Partie utilise Plante entire Prparation et posologie Feuilles fraches piles et appliques en cataplasme Jus des feuilles fraches pilles et filtres, boire Broyage de feuilles et une cuillere par jour du jus utilisation dcocte de la plante comme dsinfectant Feuille chauffe et utilise comme compresse, dcoction de 7 jeunes feuilles bouillir et boire Massage du corps avec des feuilles chauffes sur des braises, prparation en cataplasme Dcoction de racine sche, demitasse trois fois par jour, boire Feuilles pilles et non filtres; application du jus sur la plaie Jus des feuilles fraches pilles et filtres, boire. Dcoction des feuilles mres Jus des feuilles fraches pilles et filtres, boire Massage avec un extrait de la plante mlang lhuile de coco
Feuille
Kalanchoe synsepala (BAKER)
(Maladie ostocuticulaire) Rhumatisme, inflammation (Maladie mtabolique) Goutte (Maladie intestinale) Anti-diarrhique (Maladie de lappareil gnitale) Blennorragie, maladie vnrienne (Maladie de lappareil respiratoire) Toux - Asthme (Inflammation estomac) Gastrite chronique Douleur articulaire
Feuille
Plante entire
Racine
Feuille
Feuille
Feuille Feuille
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I.1.3.2 Proprit phytochimique

Ltude phytochimique du genre montre diffrents types de molcules par isolement et identification : des lipides, des glycoprotines, des technodes et des flavonodes. Les substances les plus notables biosynthtises appartiennent deux familles: les bufadinolides et les glucosides de flavonodes (ALLORGE-BOITEAU L, 1996). Des composs phnoliques sont surtout abondants au sein de lespce. Lisolement et le squenage du principe actif de lespce sont en cours actuellement. Daprs le fractionnement des extraits bruts afin de mettre en vidence les groupes de produits responsables lactivit biologique ,les rsultats nous montrent que les extraits sont constitus majoritairement de composs polaires (solubles dans les solvants) tels que leau : phase aqueuse. Les composs moyennement polaires (fraction actate dthyle) sont prsents, mais en faible quantit. Les produits apolaires dissous dans le solvant polaire, le n-hexane, sont presque ltat de trace (Travaux non publis). Dautres proprits dintrts pharmacologiques ont t mises en vidence trs rcemment. La recherche de nouvelles substances immunomodulatrices naturelles est lorigine dun criblage dextrait vis--vis de lactivit du systme immunitaire. Ltude de lactivit immunostimulante, effectue sur des cotypes, a permis de confirmer, non seulement la variabilit au sein de cette espce (variabilit dans la teneur en protine et de la teneur en principe actif), mais galement elle a conduit classer lextrait de lespce dans la catgorie des immunostimulants (RABOTOVAO L, 1993). En effet, la plante possde des substances qui sont capables de stimuler et daugmenter la rsistance antiinfectieuse dun organisme infect par des agents pathognes (IVAN M ROITT et al, 1985).
I.1.4 Statut de conservation des CRASSULACEAE, plante grasse de Madagascar

Les plantes grasses sont traites comme un groupe de taxons important parmi les plantes ornementales car plusieurs espces font actuellement lobjet de collecte intensive pour les commerces locaux et internationaux. Neuf familles sont principalement concernes, avec 69% des espces uniques Madagascar (endmiques), 27% inconnues, 1% en danger et 3%, introduites. La famille des CRASSULACEAE est, la plus riche en espces ornementales et la plus commercialise, avec 119 espces appartenant au genre Kalanchoe. Plus de 60% des espces des plantes grasses malgaches sont endmiques, y compris notre matriel dtude, alors que le statut UICN de ces espces est inconnu presque 78%. Tableau 5 : Statut UICN de conservation des plantes grasses
En danger 5% Insuffisamment connu 30 % Non menaces Hors de danger
Inconnu
Indtermin
Rares
Vulnrables
47 %
2%
3% 1% 11 % 1% Source : Monographie de la Biodiversit, 1998
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Un certain nombre de plantes succulentes (24 espces), de 3 Familles les plus exploites sont dclares trs menaces, certaines en voie de disparition (Monographie de la biodiversit, SIBIO daprs WMCM, 1998).Dans cette famille, quatre (4) genres ont un statut propre au niveau UICN. Tableau 6 : Statut UICN et CITES de 4 genres appartenant la Famille
Genre Crassula cordifolia (BAKER) Crassula humbertii (Descoings) Kalanchoe beharensis (Drake) Kalanchoe viguieri (RaymondHamet)
UICN Rare Rare Rare Rare
CITES Source : Monographie de la Biodiversit, 1998
On constate que lespce ne bnficie daucun statut de conservation UICN et CITES jusqu prsent. Toutefois, la prsence de lespce dans une Aire protge (Parc National de lIsalo) ou des Sites touristiques protges ("RovanAntongona") constitue une sorte de protection pour celle-ci. Par contre, les autres habitats exclusifs se trouvent dans les aires non protges (Ambatokely, Manerinerina, Ambalavao, Ampanihy).
I.1.5 Conservation ex situ de lespce

Comme beaucoup de menaces psent sur lespce, en particulier, la diminution en nombre, due au faite que la rgnration naturelle est ralentie par divers facteurs dorigine anthropique (feux de brousse, surexploitation etc.) et dorigine naturelle (conditions cologiques trs prcaires, mode de multiplication naturelle trs lente etc.), la recherche de solutions afin de rsoudre ces problmes savre tre plus que ncessaire dans ce cas. Comme la conservation in situ demande trop de moyens : les aires de rpartition des espces ne se trouvant pas dans des aires protges ; par consquent, lune des solutions immdiates seraient la multiplication en nombre de lespce afin daugmenter le nombre dindividu. Les techniques couramment employes sont les techniques de multiplication vgtative comme le bouturage, le greffage et le marcottage: ces techniques sont plus simples effectuer et nexigent pas trop de matriels et moyens. Seulement, le greffage et le marcottage sont des techniques qui sont inadquates avec la biologie et la morphologie de lespce. En effet, le greffage et le marcottage se font surtout avec des plantes ligneuses ou au moins subligneuses possdant des tiges et racines bien dfinies, alors que notre espce est en tat de rosette pendant toute lanne. Pour le bouturage, elle peut se faire dans des conditions dhumidit favorables, le bouturage des feuilles donne naissance deux ou trois plantules, aprs quatre semaines de culture, par consquent, avec une plante-mre possdant au moins quatre (4) feuilles deux deux opposes, on pourrait obtenir au moins 12 plants qui pourront tre repiqus. Or, avec lexploitation dautres techniques de multiplication vgtative dite "in vitro": techniques seffectuant au laboratoire, avec un explant dau moins 1 cm3 (mristme apical, morceaux de feuille, de tige ou de racine), on pourrait
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avoir des centaines, voire des milliers de plantules identiques la plante-mre. En effet, un de avantages de cette technique de culture "in vitro" est la production en quantit trs importante de plantules gntiquement homognes, en un laps de temps plus court (BOUTHERIN D et BRON G, 1989), en un an, on peut produire en thorie, plus de 4 millions de plants dune espce, partir dun seul apex alors que traditionnellement, on en obtient 50 (technivit/techniquesciv.htm, 2004) : on constate un trs grand potentiel de multiplication, en gros 1 000 fois plus lev que la multiplication vgtative traditionnelle, la production de plants "in vitro" permet aussi de saffranchir des saisons, la rduction du nombre de pieds mres ncessaire la production de boutures, et surtout, la multiplication des espces difficiles reproduire naturellement etc. Cest la raison pour laquelle, on a choisi de dvelopper et dexploiter diffrentes techniques de multiplication vgtative "in vitro" pour les besoins de lespce. Pour ltude de la germination "in vitro" des graines, cette technique permet aussi une multiplication en nombre, en utilisant des graines. Lobjectif de cette technique est aussi dexploiter tous les potentiels de lespce pour laugmentation en nombre des individus. Ltude portera donc sur la recherche des divers facteurs qui pourront influencer sur la facult germinatrice des graines (lumire, temprature, milieu de culture etc.). Dans ce cas, on pourrait influencer le nombre de graine germe au laboratoire, pour avoir plus de plants et enfin des plantules qui pourront toujours tre repiques. Seulement, cette technique reste toujours en dernier recours car, elle ncessite un matriel vgtal ou une structure reproductrice dj diffrencie en graine. Cest pour cela que les diffrentes techniques de multiplication vgtative "in vitro" tiendront une place importante. Dans ce travail, la conservation "ex situ" de lespce consiste : - la cration dune banque de donne complte sur Kalanchoe synsepala (BAKER) au point de vue botanique, cophysiologique et phytochimique : par des recherches bibliographiques, des enqutes effectus sur terrain, - la multiplication en nombre de lespce avec la recherche de diffrentes techniques de multiplication de lespce pour sa prennisation, avec les exprimentations des techniques "in vitro" avec la culture du mristme apical, la micropropagation (culture dexplant diffrenci: feuille) et lembryogense somatique. Les plantules obtenues seront ainsi domestiques pour lobtention de matriel vgtal saine et en grand nombre. Aprs la description biologique, physiologique et cologique de notre matriel dtude, nous allons entreprendre une description dtaille des diffrentes techniques de germination et de multiplication vgtative "in vitro" existantes.
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Gnralits sur les techniques de culture in vitro

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I.2 GENERALITES SUR LES TECHNIQUES DE CULTURE "in vitro"

Pour les techniques de culture employes, deux techniques ont t mis en vidence, afin de palier la diminution en nombre de lespce: il sagit de lessai de germination "in vitro" des graine et la rgnration partir de diffrentes techniques de culture "in vitro" dj proposes dans divers centres de recherche. Lobjectif est donc la matrise parfaite des diffrentes techniques de germination et de multiplication "in vitro" en nombre.
I.2.1 Germination "in vitro"

La germination "in vitro" des graines est lensemble de processus afin dobtenir une plantule capable de crotre normalement, partir dune graine. Du point de vue physiologique, la germination est la perforation des enveloppes par la radicule due un allongement des cellules radiculaires reprsentant la phase finale de la germination (RABOTOVAO L, 1987). Pour la russite de cette technique, lobtention de graines saines est prpondrante, par consquent, il nous faut matriser la technique de dcontamination des graines avec des produits dsinfectants comme lalcool et lhypochlorite de calcium ou lhypochlorite de sodium, utiliss des concentrations variables. Aprs, on effectuera des techniques exprimentales pour la germination proprement dit des graines aseptises "in vitro". La germination seffectue dans des boites de Ptri contenant des milieux de culture prtablis. Elle se droule dans une armoire de culture avec luminosit ou dans une tuve de germination, dans lobscurit.
I.2.2 Culture "in vitro"

La culture "in vitro" est une mthode de multiplication vgtative asexue. Ce type de multiplication est bas sur une proprit importante des cellules vgtales, inexistante chez les cellules animales. Une cellule vgtale diffrencie peut devenir indiffrencie, se diviser nouveau activement et puis se diffrencier nouveau en une autre cellule. Cette proprit est nomme la totipotence de la cellule vgtale (HOBBELINK H, 1988). Notons que la totipotentialit de notre espce a t dj mise en vidence dans les travaux ultrieurs et il sagit maintenant de mettre en vidence les facteurs extrinsques qui pourraient influencer sur la rgnration "in vitro". La technique consiste prlever un fragment dorgane, appel : explant, le placer dans un milieu nutritif appropri de faon ce que ce fragment puisse rgnrer une plante entire. Le processus de rgnration de la plante est, gnralement, sous le contrle de substances particulires : les rgulateurs de croissance, ou hormones vgtales (BOUTHERIN D et BRON G, 1989). Pour notre tude, seules trois techniques ont t exprimentes : - la culture dorgane non diffrenci ou culture de mristme, - la culture dorgane dj diffrenci ou micropropagation (feuilles, tiges, racines), - et lembryogense somatique (induction de cals). En effet, seules ces trois techniques sont les plus couramment utilises et employes dans les centres de recherches o nous avons fait notre exprimentation et qui ont donn des rsultats satisfaisants.
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Lobjectif de la rgnration "in vitro" est dlaborer un protocole exprimental favorable pour la rgnration de notre espce, cest--dire, un protocole exprimental de dcontamination et de dsinfection des explants labor suivi du protocole de rgnration proprement dit ou protocole pour la mise en culture de lespce partir dorgane vgtatif diffrenci et non diffrenci.
I.2.2.1 Techniques de multiplication " in vitro"

Les techniques que nous avons utilises pour la rgnration de lespce sont donc la micropropagation, la culture de mristme et lembryogense somatique. Ces techniques reposent sur lutilisation des rgulateurs de croissance synthtiques pour induire soit une organogense ou la formation dorgane comme des feuilles ou des racines, soit une embryogense ou la ddiffrenciation des tissus mis en culture suivie de la formation des tissus embryognes (cals).
a) La culture de mristme
Les mristmes sont des zones de cellules divisions intenses, situs au cur des bourgeons et des extrmits de racines et lorigine des tiges feuilles ou du systme racinaire. En 1950, les travaux de Limasset et Cornuet ont montr que les mristmes taient indemnes de virus (SCRIBAN R, 1988). La culture du mristme apical est une culture aseptique sur un milieu artificiel du dme apical sans bauche foliaire. Il mesure 0,2 0,3 mm de cot et la dissection se fait sous la loupe binoculaire. La technique peut tre associe de la thermothrapie : culture temprature leve, pour favoriser llimination des virus (technivit/techniquesciv.htm, 2004). Les plantes produites sont saines : sans virus, ni champignons, ni bactries et rpondent aux normes phytosanitaires dchanges internationaux. On obtient des varits conformes la varit dorigine et que lon peut multiplier en grande quantit (SCRIBAN R, 1988).
b) Lembryogense somatique
Lembryogense somatique est une forme de multiplication vgtative permettant dobtenir une multitude de plantules identiques gntiquement la plante donneuse dexplants. Cest lobtention dembryons partir de cellules somatiques, cest--dire non sexuelles (HOBBELINK H, 1988). Elle consiste provoquer de nombreuses divisions cellulaires partir de tissus cultivs grce lapport dune forte dose dauxine. Un cal est alors obtenu, cest--dire un amas de cellules indiffrencies et qui pourront donner naissance des embryons bipolaires qui vont se comporter comme des embryons zygotiques, (issus de la fcondation entre une cellule sexuelle femelle et une cellule sexuelle mle) (technivit/techniquesciv.htm, 2004).
c) La micropropagation
La micropropagation "in vitro" drive des phnomnes naturels de multiplication vgtative. On cultive, strilement, des explants vgtaux sur un milieu artificiel et dans un environnement contrl. Suites aux cultures successives, on obtient alors des plantes identiques la plante de dpart et que lon peut multiplier linfini (SCRIBAN R, 1988).
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Il sagit donc de produire en grande quantit des plantes. Cette technique est applique des plantes portant des intrts particuliers ou difficiles reproduire naturellement. Les plantes obtenues sont gntiquement identiques la plante ou varit de dpart et la puissance du clonage "in vitro" et permet une production dun grand nombre de plantes gntiquement homognes en un laps de temps court. Elles sont de grandes qualits car en trs bon tat sanitaire, avec un enracinement rgulier, des ramifications nombreuses, donc dune vigueur accrue. Cette mthode est encore appele microbouturage (technivit/techniquesciv.htm, 2004).
I.2.2.2 Les milieux de culture

De nombreux milieux de culture ont t dj tablis afin de rgnrer "in vitro" plusieurs espces ligneuses et non ligneuses. Ces milieux de culture sont gnralement composs de macrolments, de micro-lments, de vitamines, dhormone de croissance et de quelques substances organiques dont les concentrations varient suivant les besoins dune espce prdfinie ou suivant lobjectif de la culture. Les milieux de base tablis et dont les compositions restent inchanges sont le milieux de MURASCHIGE et SKOOG (1962) et le milieu de GRESSHOFF et DOY (1974). Leurs compositions respectives sont numres en ANNEXE I et ANNEXE II. La diffrence entre ces deux milieux rsident dans lapport en macrolments, microlments, vitamines, et la concentration de certains lments (RABOTOVAO A S, 2001). Ainsi, dans un premier temps, il est ncessaire de prparer des solutions mres complexes concentres comprenant tous les lments minraux sauf les sels de calcium pour viter les prcipitations : une solution mre de macrolments concentrs 100 fois, une solution mre de microlments concentre 1000 fois, une solution mre de chlate de fer, Fe-EDTA (x 100), une solution mre comprenant les vitamines de groupe B (x 1000), et des solutions mres pour les rgulateurs de croissance la concentration de 0,1 g/l soit 0,1 mg/ml (BOXUS P, 1989). Le milieu de culture est solidifi par de lagar ou glose de lordre de 6 10 g/l, ncessitant un chauffage lbullition au pralable pour se dissoudre (R Aug et al, 1984). Un ajustement de pH savre tre ncessaire et doit tre au environ de 5,8. A la fin, le milieu de culture devra tre strilis dans autoclave une temprature de 120 C pendant 20 min sous une pression de 1 bar (RAMANANKIERANA H, 2000).
I.2.2.3 Les hormones de croissance

Diverses hormones de croissance sont utilises pour la rgnration "in vitro" de lespce savoir les auxines et les cytokinines. Les auxines faibles comme lacide indol-actique (AIA) ou lacide indol-butirique (AI), stimulent la formation des racines ou rhizognse et la croissance cellulaire. Les auxines fortes comme lacide naphtylactique (ANA) ou lacide 2,4 dichloro-phnoxyactique (2,4 D) sont employs pour la prolifration cellulaire mais sont rapidement toxiques forte concentration.
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Les cytokinines induisent la multiplication cellulaire et le mtabolisme en gnral et la noformation des bourgeons (BOXUS P, 1989). Les quilibres hormonaux, entre lauxine et la cytokinine (Figure 5), ont t tests afin datteindre les objectifs fixs comme la rgnration partir de cals embryognes ou par la production de cal cicatriciel ou encore la rgnration partir de la noformation des bourgeons ou des plantules. Ainsi, avec R = concentration en auxine / concentration en cytokinine Si R = 1 : formation de cal uniquement Si R 1 : formation de fleurs ou de feuilles sur le cal Si R 1 : formation de racine sur le cal.
Figure 5 : Orientation de la culture "in vitro" laide de deux hormones (en mg /l) (technivit/techniquesciv.htm, 2004) Ainsi, partir de ce tableau, on a pu tirer divers protocole dquilibre hormonale, entre lauxine et la cytokinine, en vue de connatre le rapport entre les effets hormonaux et la rgnration "in vitro" de lespce. Les rgulateurs de croissance devront tre striliss par filtration avec un filtre millipore de porosit 0,22, puis ajouts au milieu de culture aprs autoclavage (LEE T S G, 1886). Aprs les descriptions du matriel dtude et des techniques de multiplication sexue et asexue, nous allons maintenant laborer les mthodologies suivre afin de mettre en vidence les potentialits de lespce la germination et la multiplication en nombre.
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Approche mthodologique- Exprimentations

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PARTIE II: APPROCHE METHODOLOGIQUE-EXPERIMENTATIONS II.1 Approche mthodologique II.1.1 Problmatique

On a remarqu une surexploitation massive et irrationnelle de lespce, entranant une diminution en nombre des individus.
II.1.1.1 Les critres de menace pour lespce ou cause directe : la dgradation de leur habitat
fort constitue une rserve des essences, des plantes Des milieux naturels autres que la
mdicinales, ainsi que des plantes ornementales. Mais en raison de lagression croissante et irraisonne de lHomme sur la Nature, ce patrimoine est actuellement menac.
a) Le dfrichement
Le dfrichement est la cause majeure de la dgradation de lenvironnement. Cette pratique sest nettement acclre depuis 10-50 ans en relation avec les problmes dmographiques, mais aussi et surtout avec la baisse des Ressources foncires des populations rurales. Le dfrichement est aussi li la recherche de terre cultivable surtout dans le Sud de lIle o pousse lespce avec la coupe rase des Fourrs xrophiles pour des champs de mas. En effet, il y a dfrichement pour obtenir des terrains pour les cultures permanentes, qui prime sur lexploitation forestire et les cultures itinrantes.
b) Les feux de brousse

Les incendies provoqus par les feux de brousse, avant la saison des pluies, peuvent tre intentionnels et visent produire un pturage de meilleure qualit pour le btail, ou involontairement, lorsquil sagit dextensions non matrises, de feux allums en vue de la culture sur brlis. En moyenne, 435 000 Ha sont brles chaque anne durant la priode 1991-1995. Dans la rgion de Mahajanga, 181 973 Ha sont brls durant 10 ans et ces feux se propagent surtout sur la plaine de Tampoketsa o lespce subsiste. Dans la rgion de Fianarantsoa, la superficie dtruite durant 10 ans est de 88 739 Ha (PACT, Aot 2000 in : TBE, 2002), alors que lespce y subsiste.
c) La surexploitation
Lune des grandes menaces est lexploitation intense et massive, la collecte intensive et destructive, le commerce local et national illicite dont ces plantes font lobjet. A cela sajoute la disparition progressive des habitations, pouvant rduire ces populations au niveau de la survie de leurs espces. En effet, cest la grande famille des CRASSULACEAE (surtout Kalanch), avec 119 espces, qui figurent parmi les familles des plantes grasses les plus riches en espces ornementales commercialises (Monographie de la Biodiversit, 1998).
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La surexploitation massive constitue donc une menace pour ces espces qui sont trs prises : en horticulture, cause de leur port : une forme en rosette, feuille charnue persistante toujours verte, et surtout la couleur de la fleur et de linflorescence en dichasium. En mdecine traditionnelle : le jus des feuilles aprs broyage est fortement tonifiant, avec un got parfois amer. En pharmacologie : les extraits contiennent plusieurs alcalodes possdant des proprit anti-cancreuse et immunostimulants.
d) Lexploitation des carrires

On a observ aussi que les exploitations des matires premires (activits minires) peuvent dgrader les milieux naturels de lespce. Un des exemples le plus vident est lexploitation de carrire qui constitue surtout un grand impact des phnomnes gologiques sur lenvironnement et lhabitat naturel de lespce poussant surtout sur les dmes granitiques ou rochers cristallins. En effet, la carrire nest pas slective pour toutes les roches. Elle exploite nimporte quelle roche cristalline et surtout des roches granitiques sauf les roches daltration. La production journalire dune carrire granitique est en moyenne 250 450 m3 (TSIKABY Leguy, 1996). Ces carrires produisent plusieurs autres causes nfastes comme lempierrement des rizires et des champs aux proximits de la carrire. Cette exploitation constitue donc une trs grande menace car on a tendance minimiser impacts de ces activits par rapport aux ouvrages difis.
II.1.1.2 Autres critres de menaces indirecte : manques dinformation

En effet, on constate quil y a peu de donnes et de renseignements concernant lespce, les travaux relatifs son tude se rsument seulement quelques ouvrages et thses do un manque de connaissance contribuant aux sous valorisations de lespce et entranant la favorisation de sa destruction. Les donnes recueillies sont faibles et ne portent lattention que sur sa richesse floristique, comme plante grasse ornementale. La proprit phytochimique de lespce est en cours dtude et porte surtout sur ses vertus thrapeutiques comme plante immunostimulante.
II.1.2.3 Difficults inhrentes la physiologie de lespce

Lespce se reproduit par stolon or une plante nmet que deux stolons opposs chaque anne et ces derniers ne se dtachent de la plante mre quaprs 5 6 mois. Dans des conditions trs rares, des bourgeons se dveloppent sur les racines latrales mais trs lentement. Les jeunes poussent provenant de ce mode de reproduction arrivent trs rarement maturit. Ces nombreuses menaces dites directe et indirecte constituent des problmatiques en amonts, concernant lespce proprement dite. A partir de ces diverses menaces, les activits que nous allons entreprendre seront lenrichissement de la base de donne contribuant ainsi sa valorisation et adopte un protocole exprimental pour la multiplication en nombre "in vitro". Plusieurs techniques et mthodes existent dj et entrepris et exploits par de nombreux centre de recherches concernant plusieurs espces, seulement dautres problmes subsistent quant
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lapplication de ces mthodes et techniques sur la multiplication en nombre de lespce et sa rgnration constituant dautres problmes dite en avals.
II.1.2.4 Difficults inhrentes la technique de multiplication

Comme la mthodologie adopte pour palier ces divers problmes, est la multiplication en nombre partir des techniques de germination et de culture "in vitro", on constate aussi quon est en prsence dautres problmes concernant ladoption de ces techniques. En effet, pour la rgnration "in vitro", les protocoles dj mis et tests sont propres chaque espce, et varient surtout avec sa nature (ligneuse ou non ligneuse). Les protocoles existants sont donc non adapts notre espce. Quant la multiplication "in vitro", le problme reste le mme, il ny a pas de protocole universel et adquat pour toute espce confondue. Les protocoles varient suivant des critres et les matriels dont on dispose. La difficult rside surtout dans la nature de lespce qui est une plante non ligneuse et crassulescente. Lespce ne possde pas ni de ramification latrale donc pas de bourgeon axillaire ni de tige bien dfinie : des explants idaux pour une multiplication "in vitro".
II.1.2 Hypothse
A partir de ces problmatiques, on constate que le nombre dindividu diminue progressivement : et les jeunes plants juvniles issus de la germination et la multiplication par stolon ne constituent quune formation basse et trop lente. Ainsi, la solution immdiate serait dessayer de limiter cette diminution en essayant daugmenter artificiellement le nombre dindividus partir de techniques de germination des graines et de la rgnration "in vitro". Diverses hypothses ont t alors mises: Lhypothse gnrale stipule donc une matrise des techniques de multiplication vgtative pour lespce. En effet, il existe diverses techniques de culture "in vitro" permettant de multiplier en nombre les espces mais que chaque espce possde sa propre technique de mise en culture. Ainsi, il nexiste pas donc de protocoles adquats ou universels car divers facteurs intrinsques (biologie et physiologie) et facteurs extrinsques (facteurs environnementaux) influent cette multiplication. Llaboration de protocoles exprimentaux pour la germination et la multiplication "in vitro" sera donc ncessaire. Mais comme les facults germinatrices et le taux de rgnration de lespce dpendent surtout de plusieurs facteurs entre autre la dcontamination des explants et llaboration de milieux de culture, plusieurs hypothses spcifiques sont numres: hypothse spcifique 1: la proprit germinative et la taux de rgnration de lespce dpendent des protocoles de dcontamination. hypothse spcifique 2: la proprit germinative et le taux de rgnration dpendent de divers facteurs extrinsques comme la luminosit, la temprature et les milieux de culture.
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II.1.3 Objectifs
Lobjectif gnral de ce travail est la conservation "ex situ" de lespce par ladoption de technique de multiplication "in vitro" par voie gnrique ( partir de la graine) et par voie vgtative ( partir des organes vgtatives). Les objectifs spcifiques sont : - llaboration de protocole de dcontamination, cest--dire laboration de protocole de strilisation et de dsinfection pour les graines et protocole de strilisation et de dsinfection des explants (feuille et mristme) pour la culture "in vitro". - ltablissement de protocole de mise en culture, cest--dire laboration de protocole pour la germination des graines et llaboration de protocole pour la rgnration en plantules. Tableau 7 : Rappel de la mthodologie adopte
Hypothse gnrale Hypothses spcifiques Indicateur Objectivement Vrifiable Mthodes Dispositifs
Hg1 : il existe des facteurs qui ont une influence sur la facult germinative des graines et sur la rgnration des explants "in vitro"
H sp1 : la proprit germinative des graines et le taux de rgnration des explants dpendent du protocole de dcontamination H sp2 : la proprit germinative et le taux de rgnration dpendent des facteurs extrinsques : luminosit, temprature et milieu de culture.
Indice de vrification ou indice de confirmation : probabilit de retour
Analyse de variance suivie du test de

NEWMAN et KEULS au seuil
de 5% par le logiciel Statitcf version4 Analyse de variance suivie du test de

NEWMAN et KEULS au seuil
1 facteur Randomisation totale (pas dinfluence de bloc)
Indice de vrification ou indice de confirmation : probabilit de retour
de 5% par le logiciel Statitcf version 4
3 factoriels Randomisation totale (pas dinfluence de bloc)
II.1.4 Cadre mthodologique

La mthodologie effectue, afin datteindre les objectifs fixs, se divisent donc en trois partie, savoir: la rcolte de donnes, suivie de lanalyse et enfin lexprimentation au laboratoire.
II.1.4.1 Rcolte de donnes

La rcolte de donne sest effectue en deux grandes parties : la recherche bibliographique et la descente sur terrain.
a) Recherche bibliographique
La recherche bibliographique consiste amliorer les donnes et connaissances concernant lespce et les diffrentes techniques de multiplication "in vitro" quon pourrait appliquer notre
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espce. En plus, des stages et entretiens dans des laboratoires de recherches ont t ncessaires pour se familiariser avec les diverses techniques. Les donnes recueillies vont donc servir de base dans lexprimentation.
b) Descente sur terrain

La descente sur terrain a t effectue dans plusieurs endroits de lle savoir : Ambatokely, Antongona, Manerinerina, Ambalavao et Ampanihy. Elle a pour but denrichir les connaissances en effectuant des enqutes ethnobotaniques auprs des populations locales et les tradipraticiens concernant les autres vertus de la plante et ses utilisations. De plus, elle nous a permis deffectuer la rcolte du matriel vgtal pour les exprimentations.
II.1.4.2 Analyse des donnes

Lanalyse de donnes consiste lexploitation des informations recueillies, en ce qui concerne le matriel dtude et les techniques de multiplication vgtative. Pour la culture "in vitro", lanalyse des donnes se rapporte la dtermination des activits entreprendre et de connatre les diffrents facteurs et variables tester pour lexprimentation. Un des objectifs de cette tude est aussi de mettre en exergue la relation troite entre les tudes morphologiques, cologique et surtout physiologique de lespce et ladoption de techniques de multiplication vgtative correspondante.
II.1.4.3 Exprimentation au laboratoire

Lexprimentation des techniques sest effectue au Centre de recherche CNRE-Tsimbazaza, au sein du Laboratoire de Microbiologie de lEnvironnement de Tsimbazaza. Le stage effectu a dur huit (8) mois et lexprimentation proprement dite a dur environ sept mois aprs la rcolte des matriels dtude dont les graines et les explants vgtatifs. Par consquent, on a ainsi adopt deux techniques de multiplication "in vitro": la premire technique consiste la germination des graines de lespce "in vitro" afin de dterminer la vitesse et la capacit de germination des graines au laboratoire et la deuxime technique consiste la rgnration de lespce par voir vgtative, cest--dire, partir de mristme et dorgane foliaire afin de dterminer le taux de rgnration de lespce. Chaque exprimentation (germination de graine et rgnration en plantule) est indpendante mais les deux techniques ont t effectues en parallle pour un gain de temps. En effet, les manipulations au laboratoire suivies des rptitions successives pour les traitements statistiques demandaient beaucoup de temps. La dmarche mthodologique est reprsente dans le tableau 8 suivant :
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Tableau 8 : La dmarche mthodologique adopte
RECHERCHES BIBLIOGRAPHIQUES CIV ESPECE STAGE AU LABORATOIRE DESCENTE SUR TERRAIN
ENTRETIEN ET RECHERCHE SUR LA CULTURE " in vitro"
PROSPECTION, RECOLTE DE MATERIEL DETUDE
ELABORATION DE PROTOCOLE DE RECHERCHE de CIV
ELABORATIONS DE FICHES TECHNIQUES DE LESPESCE
MISE EN PLACE DES DISPOSITIFS EXPERIMENTAUX "IN VITRO"
ESSAIS DE MISE EN CULTURE POUR LA GERMINATION ET LA CULTURE "IN VITRO"
TRAITEMENT DE DONNEES
REDACTION
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II.2 MATERIELS ET METHODES II.2.1 Germination "in vitro" des graines de Kalanchoe synsepala (BAKER)
Pour la prennisation de lespce, une tude sur la germination a t entreprise pour valuer la capacit et la potentialit des graines germer, dans des conditions exprimentales bien dfinies. Il sagit en outre de mettre en vidence la proprit germinative des graines de lespce. Des tudes ultrieures avaient t effectues sur des essais de germination des graines. Le taux de germination dans trois localits a montr une trs bonne capacit des graines germer (RABOTOVAO L, 1987). Dans notre tude, il sagira dlaborer les protocoles de dcontamination et de germination "in vitro" des graines.
II.2.1.1 Matriels a) Le matriel vgtal

Le matriel dtude est la graine de Kalanchoe synsepala (BAKER), les rcoltes sur terrain ont port essentiellement sur des fruits maturit. Le fruit est un follicule comprenant de nombreuses graines trs petites et prsentant des ornementations (RABOTOVAO L, 1993). Des essais de germination ont t effectus sur les cotypes cits ci-dessous dont les caractristiques des graines sont rsumes dans le tableau 9 suivant: Tableau 9 : Les caractristiques des graines suivant lcotype
Kalanchoe synsepala Ecotype Nom vernaculaire Zahana Sofintsofiny Sofingoaika Sofimbato Mongy vola Famille Site de rcolte S 1853'146 EO 474104 S 1856'424 EO 471699 S 1805'125 EO 471055 S 215715 EO 464433 S 2441802 EO 444152 Date de rcolte Unit de dispersion
Poids de 1000 units de dispersion (g) 0,0738 0,0687 0,0714 0,0708 0,0662
Ambatokely Antongona Manerinerina Ambalavao Ampanihy
C R A S S U L A C E A E
13/11/03 18/01/04 21/02/04 04/03/04 09/04/04
graine graine graine graine graine
Les semences tudies ont t rcoltes au dbut de la saison sche (de Fvrier Mai), elles sont de petites tailles et celles-ci rendent plus difficiles leur tri et leur manipulation ; il seffectue toujours sous loupe binoculaire ou sous un stroscope.
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La dissmination des semences est, en gnral, assure par le vent tant donn leur poids trs faible et la prsence des ornementations longitudinales autour des graines (Figure 6).
Figure 6 : Morphologie de la graine de Kalanchoe synsepala (BAKER) vue au Microscope lectronique balayage (MEB)
4- Grossissement allant de 60 260, pour la taille de la graine (x 130) 5- Grossissement allant de 400 1 000, pour les sillons transversaux (x 800) 6- Grossissement allant de 2 200 4 500 pour lornementation des tguments (x 4 500)
On constate travers ce schma que les sillons de la graine sont colls aux tguments qui sont pliss-riduls (ALLORGE-BOITEAU L, 1996).
b) Le matriel technique
Plusieurs matriels de laboratoire, ont t utiliss pour la ralisation des divers essais : des bocaux, boites de Ptri, tube essais en verre, divers produits (ractifs, hormones), un Ph-mtre, un autoclave, une balance de prcision pour la prparation des milieux de culture. Une armoire de culture, une tuve bactriologique, une hotte flux laminaire pour la culture proprement dite. Divers produits antiseptiques comme lthanol, lhypochlorite de calcium et lhypochlorite de sodium.
II.2.1.Techniques exprimentales
Pour la germination des graines, deux dispositifs exprimentaux ont t tablis, le premier consiste la dcontamination et la deuxime consiste la germination proprement dite.
a) Dispositifs pour la dcontamination des graines

Il est primordial que les cultures "in vitro" soient dpourvues de champignons et bactries. On arrive ce rsultat par strilisation des rcipients et des milieux de culture en autoclave, du matriel vgtal par immersion dans des liquides antiseptiques. Les produits de dcontamination tests sont des produits couramment utiliss : il sagit de lthanol 70, lhypochlorite de sodium (Na Cl O) et lhypochlorite de calcium [Ca (O Cl2)] diffrentes concentrations. Nous avons pris comme protocole de base, celui utilis pour la dsinfection des graines de
LEGUMINEUSES labor au CNRE (Travaux non publi), savoir : un trempage des semences dans
de lthanol 70 pendant 5 minutes, suivi dun trempage dans lhypochlorite de sodium (Na Cl O) 12% pendant 5 minutes et dun grand rinage dans leau distille strile. On a fait varier la dure du trempage dans les produits antiseptiques sans en modifier la concentration (Tableau 10).
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Un autre protocole a t aussi test, il a t applique une espce du genre Coffea au laboratoire de culture "in vitro" de lIMRA. Il consiste en un trempage des explants dans lthanol 70 pendant 1 minute et un trempage dans lhypochlorite de calcium [Ca (O Cl2)] 5% pendant 10 minutes. On a aussi fait varier le temps de trempage des graines (Tableau 11). Les rsultats obtenus rapportent le nombre de graine germe donc non contamine sur le nombre de graine inocule, au bout de 30 jours de culture. Quatre essais ont t effectus et dsigns sous le nom de Bloc. Chaque bloc est indpendant, cest--dire quil ny a aucune relation entre Bloc.
a.1) Avec Na Cl O 12%

Tableau 10 : Dispositifs exprimentaux pour la dcontamination des graines avec Na Cl O 12%
Milieu de culture
Produits de dsinfection et de strilisation des graines Et OH 70 / Na Cl O 12% T1 : 0 min T2 : 0 min T3 : 5 min T4 : 5 min T5 : 5 min / / / / / 0 min 5 min 0 min 5 min 2 min 30 5 min 2 min30
Dispositifs exprimentaux 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc
Eau distille + agar 7 g/l
T6 : 2 min 30 / T7 : 2 min 30 /
a.2) Avec Ca (O Cl2) 5%

Tableau 11 : Dispositifs exprimentaux pour la dcontamination des graines avec Ca (O Cl2) 5%
Produits de dsinfection et de strilisation des graines Et OH 70 / Ca (O Cl2) 5 % T8 : 0 min T9 : 0 min Eau distille + agar 7 g/l T10 : 10 min T11 : 30 s T12 : 1 min T13 : 30 s T14 : 1min / / / / / / / 0 min 10 min 0 min 10 min 10 min 15 min 15 min 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc 4 Rptitions de bloc, 30 graines par bloc
Milieu de culture
Dispositifs exprimentaux
Remarques: * 14 traitements diffrents ont t effectus concernant la dcontamination des graines. Chaque traitement seffectue avec trois (3) rinages successifs dans de leau distille strile. * Pour avoir une reproductibilit des rsultats, chaque traitement a t effectu quatre (4) fois, constituant les 4 blocs. Il est constitu de 30 graines rparties dans 3 boites de Ptri, ainsi, 10 graines
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sont ensemences dans chaque boite et mis en culture dans une armoire de culture ou une tuve de germination. La rptition des traitements, a t ncessaire afin de tester lhomognit de lessai.
b) Influences des facteurs pour la germination des graines

Pour la germination proprement dite des graines, divers facteurs ont t tests : - le facteur temprature : en effet, le taux de germination dune semence varie souvent avec la temprature laquelle elle est soumise. Les essais de germination seffectuent dans une tuve thermostat, permettant de stabiliser des tempratures allant de 20 65 C et dans une armoire de culture avec une photopriode et une temprature variable. Ainsi, trois niveaux de temprature, bas sur les variations de temprature de latmosphre, ont t tests : T1 : 25 C, T2 : 30 C et T3 :35 C. - le facteur lumire : lanalyse du comportement des graines de certaines espces, claires la lumire blanche a permis de les classer en trois catgories : semences photosensibilit positive (active par la lumire), semences photosensibilit ngative (inhibe par la lumire et active par lobscurit) et semences non photosensibles (germant aussi bien la lumire qu lobscurit). Pour notre exprimentation, deux conditions ont t dfinies : dans lobscurit avec une tuve de germination et la lumire blanche, dans une armoire de culture "in vitro". - les facteurs eau et milieu de culture : leau assure la reprise de la vie de la semence par un phnomne dosmose et son lessivage par limination des inhibiteurs tgumentaires sil y en existe. Les prtraitements comme dnudation, scarification manuelle nont pas t appliqus car les graines ne semblent possder aucune dormance inhibitoire des tguments (RABOTOVAO L, 1987). Pour respecter les conditions naturelles des semences et leur tat de dficit hydrique, nous avons sch les semences dans une tuve temprature variant de 30 jusqu 35C pendant 4 semaines. Afin de tester la potentialit des semences germer, nous avons labor quatre (4) milieux de culture. Les graines devraient donc germer et crotre dans un milieu convenable jusqu ce quelles puissent tre repiques sur un milieu de croissance et dveloppement. Tableau 12 : Les milieux de germination des graines labors
Dsignation M1 M2 et M3 M4 -
Milieux de culture Eau glose 7 g/l MS/2 : Macro et micro-lment dilu de moiti Muraschige et Skoog (MS) MS/4 : Macro et micro-lment dilu de quart Gressoft et Doy (GD)
leau glose 7 g/l, comme milieu tmoin, le milieu de culture de Muraschige et Skoog dilu de moiti (MS/2) (ANNEXE I) et dilu de le milieu de Gressoft et Doy. Les vitamines employes lors de la culture sont les
quart (MS/4), milieu fortement employ lors de culture "in vitro",

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compositions de la Vitamine de Morel, plus riches en Vitamine B5 indispensable pour les tissus en culture (ANNEXE II).
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Pour ces essais, on a test les influences de facteurs : luminosit, temprature et milieu de culture sur la capacit de germination au bout de 30 jours de mise en culture et la vitesse de germination, au bout de 6 jours dinoculation. Concernant ltude de la germination proprement dite, un dispositif en "split-plot" a t effectu mesurant les effets des divers milieux de culture comme traitement principal, les influences de la temprature de larmoire de culture et les effets de la luminosit de la chambre de mise en culture comme traitements subsidiaires (Tableau 13). Tableau 13 : Dispositifs exprimentaux pour la germination des graines Luminosit Temprature 25C Milieu de culture Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 Bloc 4
Lumire
30C
35C
25C
Obscurit
30C
35C
Remarques : * Les blocs reprsentent la rptition des essais de germination sur les mmes milieux de culture * A chaque traitement effectu, correspondant une temprature et un milieux de culture bien dtermine, le nombre de graines inocules a t de 120, rpartie dans 12 boites de Ptri, ce qui a fallu, pour lensemble des traitements 2 880 graines viables et tries.
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II.2.1.3 Critre de germination

Une graine est considre comme germe lorsque la radicule a perc les tguments et lorsque la graine a donn une plantule capable de crotre normalement, ce qui correspond la phase de la germination (EVENERI, 1986 in : RABOTOVAO L, 1987). Le mme auteur distingue en outre trois phases dans la germination, savoir : une phase dactivation, une phase de mitose et une phase terminale dallongement de la radicule. La germination prsente plusieurs critres savoir : le dlai de germination, le pouvoir germinatif, la capacit de germination, la vitesse de germination, leffet de stockage des semences etc. Pour notre tude, nous nallons prendre en considration que deux critres qui sont : la capacit de germination et la vitesse de germination. - La capacit de germination est le pourcentage des graines capables de germer dans des conditions bien dfinies ; on calcule le rapport, exprim en pourcentage, entre les semences germes et les semences semes et viables au bout de 30 jours de mise en culture. - La vitesse de germination est exprime par le pourcentage de germination obtenu quelques jours aprs le semis (RAHAINGOSOLO Z et MAKA L, 1994). On a considr la vitesse de germination comme le temps mis par les semences pour germer et celle-ci peut sexprimer par le pourcentage de semences germes ou taux de germination, au bout de 6 jours aprs lensemencement.
II.2.1.4 Traitements de donnes

Les pourcentages de germination obtenus pour les diffrents traitements ont t soumis, une analyse de variance suivie dune comparaison des moyennes par le test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5 % laide du logiciel STAT-ITCF version 4. Pour chaque traitement, lhypothse nulle consiste considrer que tous les niveaux de facteur tudi ont mme effet. Le paramtre statistique le plus dterminant dans le tableau de lanalyse de variance est la valeur de la probabilit de linteraction des deux facteurs tudis. Lorsque celle-ci est infrieure la valeur de la probabilit thorique (P = 0,05 dans notre cas), on parle de diffrence significative entre les traitements. Dans le cas contraire, les facteurs tudis nont pas une interaction positive sur le paramtre mesur. Lorsque les facteurs tudis prsentent une interaction significative, linterprtation du tableau sachve par lapplication de test de NEWMAN et KEULS qui permet de distinguer les groupes de traitements statistiquement homognes (ANNEXE IX). Dans les tableaux de rsultats, les valeurs sont suivies dune lettre ou dun groupe de lettres. Ds quil y a une lettre commune entre deux valeurs, ces derniers appartiennent un groupe homogne, cest--dire quelles ne diffrent pas significativement au seuil de probabilit P = 0,05. (GOUET J-P et PHILIPPEAU G, 1989).
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II.2.2 La culture " in vitro" de Kalanchoe synsepala (BAKER)

Pour notre exprimentation, nous avons adopt trois (3) techniques, savoir : la culture de mristme, la culture dorgane diffrenci ou la micropropagation et lembryogense somatique. Lobjectif de la culture "in vitro" est de dterminer le protocole exprimental favorable pour la rgnration de notre espce : un protocole exprimental de dsinfection labor et un protocole de rgnration partir dorgane vgtatif diffrenci et non diffrenci. Il sagit aussi de dterminer les relations entre les milieux de culture et les quilibres hormonaux avec la rgnration de lespce.
II.2.2.1 Matriels
Le matriel vgtal utilis en culture "in vitro" est appel : "explant ". - Pour la culture de mristme, lexplant utilis est le mristme apical de lespce, mesurant au plus 2 mm, de poids insignifiant et de couleur blanchtre tachet de rose. Il est de taille rduite, do la ncessit dune loupe binoculaire pour le prlever laide dun scalpel trs fin, sous une hotte. Cette technique exige une dlicate attention car il ny a quun seul mristme apical sur une plante. - Pour la micropropagation et lembryogense somatique, les explants utiliss sont de jeunes feuilles prleves dans des conditions aseptiques. On a utilis deux types de feuilles : celles issues de plantes rcoltes dans leur milieu naturel et celles des jeunes plantules issues de la germination.
II.2.2.2 Mthodes de travail

La premire partie du travail consistera linduction de cal ou callogense, puis lobtention de bourgeonnement vgtatif, cest--dire des microfeuilles ou de plantules. Ces rsultats seront obtenus partir des quilibres hormonaux effectus. Aprs, les produits obtenus : des cals friables et des bourgeonnements vgtatifs seront repiqus sur dautres milieux, qui constituera la deuxime partie de notre travail : la rgnration en plantule.
a) Partie I : Induction de cal et bourgeonnement vgtatif

Pour lobtention du cal, il sagit dexploiter surtout la proprit de totipotence cellulaire, cest-dire, provoquer partir dun quilibre hormonal la ddiffrenciation cellulaire de lexplant mis en culture pour la formation dun amas de cellules indiffrencies ou cal. Pour linduction de bourgeons foliaires noforms, il sagit de stimuler les capacits naturelles de multiplication vgtative de lespce par linduction dune nouvelle organogense de bourgeons et de racines.
a.1) Mthode de strilisation et dsinfection

Les explants utiliss "in vitro" devront tre toujours striliss car des contaminants, se dveloppant trs rapidement dans le milieu nutritif vont endommager tout lensemble du milieu jusqu lpuisement et entranant la destruction et la dgnrescence de lexplant mis en culture. Les produits de strilisation des explants sont les mmes que pour les graines, savoir le lthanol 70 : ce produit favorise aussi la pntration des agents secondaires, ensuite, lhypochlorite
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de calcium 5% ou lhypochlorite de sodium 12%. Le rinage dans leau distille strile est ncessaire, cause de la toxicit des produits antiseptiques, pour les tissus mis en culture.
a.2) Mise en culture ou inoculation

Aprs strilisation des explants, ils seront mis en culture sur des milieux nutritifs composition variable suivant les objectifs atteindre, dans des boites de Ptri et placs dans larmoire de culture. La mise en culture de lexplant se fait comme suit : on prlve lexplant strilis et dcontamin avec une pince strile, sous hotte flux laminaire, et on le pose dlicatement dans une boite de Ptri en verre ou dans un tube essai strile contenant environ 25 ml de milieu nutritif glos choisi et les substances organiques additives. Ensuite, la boite de Ptri ou le bocal en verre devra tre recouverte et entoure dune couche de film alimentaire pour viter toute contamination venant de lextrieur et maintenir lhumidit relative dans la boite de Ptri. Les explants sont cultivs dans des conditions standards: 28 C, sous une intensit lumineuse continue de 1200 lux ou une photopriode de 18/6 h et une humidit relative denviron 70%. Ces conditions internes de mise en culture sont les conditions optimales pour la rgnration in vitro .
a.3) Critres dvaluation

Des critres communs sont ncessaires pour valuer lefficacit de la technique utilise et pour faciliter les changes dinformation entre techniciens et chercheurs. Ainsi, ce critre dvaluation a t dj propos dans la rgnration du bananier effectu par HANNELORE STROSSE et al, 2000. Des indicateurs qualitatifs et quantitatifs relatifs ont t proposs et suivis : a.3.1) Formation de cals idaux Pour la technique de la culture de mristme, % de cals idaux = nombre de cals idaux / nombre de mristme inoculs Pour la technique de la micropropagation, % de cals idaux = nombre de cals idaux / nombre dexplant inoculs. Le cal idal et de bonne qualit est form par des agrgats cellulaires homognes. Cette homognit est observe aprs de nombreux mois de culture. a.3.2) Etablissement de suspensions cellulaires embryognes ou SCE Pour les deux techniques de culture "in vitro", % de SCE = nombre de SCE / nombre de cals idaux (CI) placs en milieu de culture a.3.3) Formations dembryons Le nombre dembryons obtenu par volume de cellules tales est le critre cl qui permet dvaluer la qualit dune suspension. Par exemple, 1 ml de cellules sdimentes peuvent gnrer entre 100 et 300 000 embryons (GRAPIN et al. 1996, COTE et al. 1996, STROSSE et al. Sous presse) Taux de russite de formation dembryons = nombre dembryons / ml de cellules tales
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a.3.4) Potentiel de rgnration Le pourcentage de germination est souvent utilis pour valuer le processus de rgnration. Les critres suivants ont t proposs : % de germination = nombre de plantules dembryons obtenues / nombre dembryons mis sur un milieu de germination Une autre faon dvaluer les rsultats du processus de rgnration est de calculer la capacit de rgnration. Capacit de rgnration = nombre de vitroplants produits / ml de cellules tales (HANNELORE
STROSSE
et al, 2000).
a.4) Choix du dispositif exprimental et exprimentations a.4.1) Dispositifs exprimentaux pour la strilisation et la dsinfection des explants Pour la strilisation des explants employe dans les trois techniques proposes au dpart, les produits dj utiliss lors de la dcontamination des graines ont t proposs. La seule modification rside dans les temps de trempage des explants. Il sagit ensuite de dterminer partir de plusieurs essais les dures de trempage optimales pour la dcontamination des explants. On a donc tabli plusieurs dispositifs pour la dcontamination. a.4.2) Dispositifs exprimentaux pour la culture "in vitro" Aprs acquisition du protocole de dcontamination des explants, il reste laborer le protocole de mise en culture de lespce. Les travaux consisteront laborer les milieux de culture et les quilibres hormonaux favorables pour la rgnration "in vitro". Les milieux de culture expriments seront le milieux de MURASCHIGE et SKOOG (1962) et le milieu de GRESSHOFF et DOY (1974). Notons que lajout dun anti-oxydant a t ncessaire dans les milieux nutritifs car lespce contient de nombreux composs phnoliques mis en vidence avec lapparition de tche violette et sombre tout autour des explants mis en culture au bout de quelques jours dinoculation. Les produits de loxydation sont toxiques pour les explants inoculs. Les antioxydants sont des produits courants de laboratoire comme lacide citrique, le charbon actif etc. Pour les rgulateurs de croissance, les quilibres hormonaux entre auxine et cytokinine choisis seront en fonction des objectifs fixs. Dans notre cas, les objectifs sont respectivement, la rgnration de lespce avec lobtention de micro feuilles ou le dveloppement de systme racinaire des explants. Ensuite, avec lobtention de cals friables qui donneront des embryons mtures, chaque embryon donnera ensuite une plantule gntiquement identique lespce.
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b) Partie II : Rgnration en plantules

Lobjectif, pour cette deuxime partie du travail, consiste la rgnration en plantules des embryons individuels et des bourgeons foliaires avec des repiquages sur un milieu denracinement. Il sagit, dans ce cas, deffectuer une technique de microbouturage "in vitro" des explants sur de nouveaux milieux dinduction de racine. Comme lobjectif fix auparavant, tait la propagation en nombre des individus, on a aussi labor dautre milieux pour induire de nouveaux une embryogense somatique pour la formation de cal friable et donc, pour avoir plus de plantules rgnres.
b.1) Mthode de travail

La mthode de travail consiste repiquer les explants obtenus (embryons individuels et microfeuilles) sur de nouveaux milieux de culture pour la rgnration en plantules. Les embryons (embryogense somatique) et les microfeuilles (culture de mristme et micropropagation) obtenus sont dtachs et parpills. On choisira les explants plus vigoureux et plus mtures avec un scalpel strile sous hotte, et on les repique des bocaux striles contenant le milieu de culture choisi pour linduction de la rhizognse afin dobtenir des plantules ou "vitroplant". Les milieux de culture choisis pour la rhizognse et linduction de cal ont t des milieux de culture tablis pour la rgnration du bananier, un milieu de culture tablis par des chercheurs du Laboratory of Tropical Crop Improvement de KULeuven et du laboratoire de biologie cellulaire du Centre de coopration internationale en recherche agronomique pour le dveloppement (Cirad, laboratoire Biotrop).
b.2) Choix du dispositif et exprimentation

Pour la rgnration et la multiplication "in vitro" de lespce, il sagit surtout de multiplier lespce en grand nombre, par consquent, pour le choix de notre dispositif exprimental, nous avons choisi ces deux techniques employer. - pour linduction de la racine et la rgnration des embryons et microfeuilles, un milieu denracinement constitu par le milieu MS dilu de moiti avec lquilibre hormonal favorisant le dveloppement racinaire. - pour la rgnration des microfeuilles issus de la culture de mristme et la micropropagation, deux milieux de repiquage, le premier pour induire lenracinement et le deuxime milieu pour un nouveau induction de cal.
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Rsultats et interprtations
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PARTIE III : RESULTATS et INTERPRETATIONS III.1 Rsultats des essais sur la germination des graines III.1.1 Rsultats des essais sur la dcontamination des graines III.1.1.1 Avec Na Cl O 12%
Les rsultats par bloc dterminent le rapport entre le nombre de graine non contamin et qui ont germ sur le nombre de graine inocul. Ainsi, au bout de 30 jours dinoculation, dans une tuve de germination et une temprature optimale variant de 26 28C. Les rsultats sont consigns dans le tableau 14 ci-dessous. Tableau 14 : Rsultas bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination par Na Cl O 12%
Milieu de culture
Produits de dsinfection et de strilisation des graines Et OH 70 / Na Cl O 12 % T1 : 0 min / 0 min T2 : 0 min / 5 min T3 : 5 min / 0 min T4 : 5 min / 5 min T5 : 5 min / 2 min 30 T6 : 2 min 30 / 5 min T7 : 2min 30 / 2min 30
Bloc 1
Bloc 2
Bloc 3
Bloc 4
0/30 1/30 1/30 1/30 28/30 15/30 19/30
1/30 2/30 0/30 2/30 21/30 17/30 21/30
0/30 1/30 2/30 2/30 27/30 11/30 18/30
0/30 0/30 1/30 3/30 29/30 8/30 15/30
III.1.1.2 Avec Ca (O Cl2) 5%

Avec ce deuxime type de dtergent, le dispositif exprimental effectu est le mme, en variant le temps dimmersion des semences dans les produits, tout en gardant constant le milieu de culture. Les rsultats sont montrs dans le tableau 15 suivant : Tableau 15 : Rsultats bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination Ca (O Cl2) 5%
Produits de dsinfection et de strilisation des graines Et OH 70 / Ca (O Cl2) 5 % T8 : 0 min / 0 min T9 : 0 min / 10 min T10 : 10 min / 0 min T11 : 30 s / 10 min T12 : 1 min / 10 min T13 : 30 s / 15 min T14 : 1min / 15 min
Milieu de culture
Bloc 1
Bloc 2
Bloc 3
Bloc 4
1/30 0/30 1/30 3/30 25/30 23/30 15/30
0/30 0/30 2/30 11/30 28/30 30/30 21/30
1/30 1/30 1/30 2/30 27/30 27/30 9/30
0/30 0/30 0/30 8/30 22/30 23/30 18/30
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III.1.1.3 Traitements des donnes a) Analyse de variance

Les rsultats de lanalyse de variance sont consigns dans le tableau 16 suivant: Tableau 16 : Analyse de variance de leffet des dtergents sur le taux de germination
S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. RESIDUELLE1 4723.5 4516.5 2.9 D.D.L 38 13 105 CARRES MOYENS 124.30 347.42 0.02 TEST F. 41.96 PROBA 0.0000 2.88 28.8% E.T C.V
DISPOSITIF INITIAL DE LESSAI : RANDOMISATION TOTALE NOMBRE DOBSERVATIONS : 56 NOMBRE DE VARIABLES : 5

Source : Logiciel Statitcf
Interprtation La valeur calcule de F dans le tableau est suprieure la valeur de F donne par la table de
SNEDECOR pour le DDL correspondant. En plus, la probabilit calcule du facteur tudi est gale
0 donc infrieure la probabilit thorique P = 0,05 (5%). Par consquent, on peut dire quil y a une diffrence significative entre les 14 traitements effectus. Ainsi, on procde alors un test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5%, pour connatre le ou les traitements prpondrant(s).
b) Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%

Tableau 17 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur leffet des dtergents
FACTEUR 13 12 5 7 14 6 11 4 10 2 8 3 1 9
LIBELLES T13 T12 T5 T7 T14 T6 T11 T4 T10 T2 T8 T3 T1 T9
MOYENNES 26.67 26.67 25.33 19.33 15.00 14.33 5.33 1.67 1.33 1.33 1.00 1.00 0.50 0.50
GROUPES HOMOGENES A A A B B B C C C C C C C C
Interprtation Daprs le test de NEWMAN et KEULS, les 14 traitements ont t regroups en trois groupes homognes diffrents: A, B et C suivant leurs moyennes respectives. On constate que les traitements T13 :1 min/10 min avec Ca (O Cl2), T12 :30s/15 min avec Ca (O Cl2) et T5 : 5 min/2 min 30
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avec Na Cl O 12% forment un mme groupe homogne A ayant la moyenne la plus leve, par consquent, ce sont les traitements adquats pour la germination des graines. Nous pouvons en conclure que, la dcontamination des graine est russi en utilisant deux produits dtergents base de chlore : avec lhypochlorite de sodium et lhypochlorite de calcium diffrente concentration et ayant leur dure de trempage respective, suivie toujours dun rinage leau distille strile 3 fois successives. Les courbes reprsentatives du pourcentage de germination des graines avec les produits de antiseptiques Na Cl O 12% et Ca (O Cl2) 5% sont montres respectivement dans la figure 7 et figure 8 suivantes. Les figures reprsentent le pourcentage de germination en fonction du nombre de jours de culture, relatives aux produits antiseptiques utiliss.
Courbe de germination de Kalanchoe synsepala 12% avec avec NaClo12% Na Cl O % de
germination 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
T1
jours 3 5 7
T2
9 11 13 15 17 19 21 23 25
T3 T4 T5 T6 T7
Figure 7 : Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Na Cl O 12% Interprtation Daprs les courbes reprsentant les taux de germination relatifs aux 7 traitements de graines, toutes les courbes prsentent toutes une phase ascendante, jusqu un certain niveau et un palier reprsent par une droite constante. La phase ascendante reprsente la vitesse de germination des graines partir du premier jour dinoculation et le palier partir du 23me jour, reprsente la capacit de germination des graines. En effet, partir de ce moment, le taux de germination des graines ne varie plus et reste constant. On constate que la courbe reprsentant le traitement T5 est la plus leve suivie des courbes T7, T6 et T4. Les courbes T3, T2 et T1 restent relativement infrieures et varient que trs faiblement. Les rsultats montrs par ces courbes reprsentatives vrifient les tests statistiques effectus auparavant. La courbe suivante (Figure 8) reprsente le pourcentage de germination des graines avec lautre produit antiseptique Ca (O Cl2) 5%.
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% de germination 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
Courbe de germination de Kalanchoe synsepala avec Ca (OCl)2 5%
avec Ca (O Cl2) 5 %
jours 3
T'1
7
T'2
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
T'3 T'4 T'5 T'6 T'7
Figure 8 : Courbe de germination de Kalanchoe synsepala (BAKER) avec Ca (O Cl2) 5% Interprtation Les rsultats obtenus partir de ces courbes reprsentatives vrifient toujours les tests statistiques effectus concernant les protocoles de dcontamination les plus appropris pour lespce. Daprs les rsultats des exprimentations, le premier protocole de dcontamination avec Na Cl O 12 % est le traitement T5 : 5 min / 2 min 30, le deuxime protocole avec un autre produit de dcontamination Ca (O Cl2) 5% est celui de deux traitements : T12 : 1 min / 10 min et T13 : 30 s/ 15 min suivis toujours dun rinage leau distille strile trois fois successives. Ces rsultats nous montrent lefficacit de laction des dtergents composs de chlore comme antiseptique trs actif pour la destruction des bactries et champignons, mais ces derniers devront tre utiliss des concentrations plus modres pour ne pas dtruire les graines mises en culture. Ainsi, cest le protocole de dcontamination avec le produit dtergent Na Cl O 12 % et le traitement T5 : 5 min / 2 min 30, que nous allons utiliser dans les suites des exprimentations, en testant les effets de divers facteurs (luminosit, temprature et milieu de culture) sur la capacit et la vitesse de germination des graines de lespce.
II.1.2 Rsultats des essais sur la germination des graines III.1.2.1 Essais relatifs la capacit de germination
Les rsultats des essais relatifs la capacit de germination des graines de lespce sont obtenus au bout de 30 jours de mise en culture et rsums dans les tableaux 18 et 19 suivants.
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Tableau 18 : Rsultats bruts des essais relatifs la capacit de germination de lespce

Luminosit Temprature Milieu de culture Bloc 1 Bloc 2 Bloc 3 Bloc 4
25C
Lumire
30C
35C
25C
Obscurit
30C
35C
Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD
0/30 1/30 15/30 1/30 17/30 11/30 19/30 1/30 09/30 06/30 11/30 3/30 07/30 01/30 07/30 1/30 10/30 1/30 17/30 1/30 1/30 0/30 1/30 3/30
1/30 2/30 10/30 2/30 19/30 09/30 21/30 2/30 08/30 09/30 21/30 01/30 11/30 12/30 10/30 2/30 11/30 2/30 20/30 2/30 10/30 3/30 2/30 01/30
0/30 1/30 08/30 2/30 28/30 02/30 18/30 2/30 11/30 01/30 07/30 2/30 10/30 09/30 08/30 2/30 08/30 7/30 12/30 2/30 1/30 0/30 1/30 2/30
0/30 0/30 11/30 3/30 20/30 10/30 10/30 10/30 07/30 08/30 13/30 08/30 20/30 03/30 21/30 3/30 09/30 10/30 11/30 4/30 0/30 0/30 0/30 0/30
III.1.2.2 Essais relatifs la vitesse de germination

Les rsultats, obtenus dans un intervalle de temps fix, au bout de 6 jours de mise en culture, Tableau 19 : Rsultats bruts des essais relatifs la vitesse de germination de lespce
Luminosit Temprature 25C Milieu de culture Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Eau glose MS/2 MS/4 GD Bloc 1 0/30 1/30 5/30 1/30 6/30 3/30 6/30 0/30 3/30 2/30 3/30 1/30 2/30 0/30 2/30 0/30 3/30 0/30 6/30 0/30 0/30 0/30 1/30 1/30 Bloc 2 1/30 1/30 4/30 1/30 7/30 3/30 7/30 1/30 2/30 3/30 7/30 0/30 2/30 4/30 3/30 0/30 3/30 0/30 7/30 0/30 3/30 1/30 0/30 0/30 Bloc 3 0/30 0/30 3/30 1/30 9/30 1/30 6/30 1/30 4/30 1/30 2/30 1/30 3/30 3/30 2/30 0/30 2/30 2/30 4/30 1/30 0/30 0/30 1/30 1/30 Bloc 4 0/30 0/30 1/30 1/30 7/30 3/30 9/30 1/30 6/30 3/30 4/30 3/30 6/30 1/30 6/30 1/30 3/30 3/30 3/30 1/30 0/30 0/30 0/30 0/30
Lumire
30C
35C
25C
Obscurit
30C
35C
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III.1.2.3 Traitements des donnes a) Analyse de variance de leffet des facteurs sur la capacit de germination
Les rsultats de lanalyse de variance sont indiqus dans les tableaux 20 et 21 suivantes: Tableau 20 : Analyse de variance de leffet des facteurs sur la capacit de germination
CARRES MOYENS 42.47 108.38 272.38 402.28 259.62 15.82 48.07 61.49 13.20
S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. FACTEUR2 VAR. FACTEUR3 VAR.INTERF1*2 VAR.INTERF1*3 VAR.INTER 2*3 VAR.INTER1*2*3 VAR.RESIDUELLE 4034.50 108.38 544.75 1206.83 519.25 47.46 288.42 368.92 950.50
D.D.L 95 1 2 3 2 3 6 6 72
TEST F. 8.21 20.63 30.47 19.67 1.20 3.64 4.66
PROBA 0.0045 0.0000 0.0000 0.0000 0.3165 0.0034 0.0005
E.T
C.V
3.63
52.8%
NOMBRE DOBSERVATIONS : 96 NOMBRE DE VARIABLES : 9 DISPOSITIF DE LESSAI : FACTORIEL 3 FACTEURS EN RANDOMISATION TOTALE

Tableau 21 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
FACTEUR 1 1 2 1 2 2 1 2 1 1 2 1 2 1 1 2 2 2 1 2 1 2 2 1 2 2 2 3 1 1 1 2 3 2 1 3 2 2 3 3 2 1 1 3 1 3 3 1 1 3 3 3 1 3 3 1 1 2 2 2 2 4 4 1 4 4 4 4 2 3 2 1
LIBELLES Lum-30-gel Lum-30-ms/4 Obs-30-ms/4 Lum-35-ms/4 Obs-25-gel Obs-25-ms/4 Lum-25-ms/4 Obs-30-gel Lum-35-gel Lum-30-ms/2 Obs-25-ms/2 Lum-35-ms/2 Obs-20-ms/2 Lum-30-gd Lum-35-gd Obs-35-gel Obs-30-gd Obs-25-gd Lum-25-gd Obs-35-gd Lum-25-ms/2 Obs-35-ms/4 Obs-35-ms/2 Lum-25-gel
MOYENNES 21.00 17.00 15.00 13.00 12.00 11.50 11.00 9.50 8.75 8.00 6.25 6.00 5.00 3.75 3.50 3.00 2.25 2.00 2.00 1.50 1.00 1.00 0.75 0.25 A A A B B B B B B B
GROUPES HOMOGENES
C C C C C C C C
D D D D D D D D D D
E E E E E E E E E E E
F F F F F F F F F F F
G G G G G G G G G G G G G G G G G
H H H H H H H H H H H H H H H H
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Interprtation Daprs lanalyse de variance, on constate que pour les facteurs tudis : facteur luminosit (F1), facteur temprature (F2), facteur milieu de culture (F3), et les interactions entre facteur F 1*2, F 2*3 et F 1*2*3 ; les probabilits calcules sont toutes infrieures 0,05. Seule la probabilit calcule de linteraction de facteur F 1*3 est suprieure la probabilit thorique P = 0,05. Ainsi, on peut affirmer quil y une diffrence significative entre les facteurs tudis : luminosit, temprature et milieu de culture et quil y a aussi une grande interaction ou interdpendance entre les facteurs: lumiretemprature, temprature-milieu de culture et surtout entre ces trois facteurs lumire-tempraturemilieu de culture. Pour linteraction entre facteur F1*3, la probabilit est suprieure la probabilit seuil, par consquent, on peut dire quil ny a pas dinteraction ou dinterdpendance entre le facteur lumire et le facteur milieu de culture. On procde aprs un test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, pour vrifier les groupes homognes de chaque facteur tudi. Daprs le test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, on constate la prsence de 8 groupes homognes, selon les interactions entre les trois facteurs F1, F2 et F3 tudis et suivant leurs moyennes respectives. On peut tirer alors les groupes homognes prpondrants (groupe A avec des moyennes plus leves) ainsi que les interactions des facteurs qui sont les plus importantes, savoir : linteraction entre facteur luminosit-temprature-milieu de culture: lumire-30C-eau glose, suivie du linteraction entre facteur: lumire-30C-MS/4, et linteraction entre facteur : obscurit30C-MS/4. On constate partir de ces rsultats que linteraction entre trois facteurs (luminosit, temprature, et milieu de culture) joue un rle prpondrant dans la capacit de germination. On obtient ainsi un pourcentage de germination plus lev des graines au bout de 6 jours dinoculation, dans une meilleure condition dasepsie et de mise en culture en matrisant parfaitement les facteurs: luminosit, temprature dans larmoire de culture et les milieux de culture tablis. On constate par ailleurs un taux de germination trs lev de lespce, aux environs de 75%, dans une condition parfaitement quilibre et constante : dans une armoire de culture en prsence de la lumire, sous une temprature de 30C et dans un milieu eau glose (7g/l) ou dans un milieu MS/4 sans hormone. Seulement, les plantules obtenues au bout dune semaine de culture sont trs fragiles, cause sans doute de leur taille, et ne peuvent subir aucun "stress", qui entranerait rapidement leur dgnrescence. Cest cause de cette grande vulnrabilit des jeunes plantules que la rgnration naturelle par voie sexue est trs faible dans leur milieu dorigine. Ces trois facteurs tudis : luminosit, temprature et milieu de culture sont donc les facteurs limitants pour la germination de lespce (loi du minimum) et il y a une interaction troite entre ces trois facteurs.
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c) Analyse de variance de leffet des facteurs sur la vitesse de germination

Les rsultats de lanalyse de variance sont indiqus dans les tableaux 22 et 23 suivants: Tableau 22 : Analyse de variance de leffet des facteurs sur la vitesse de germination
CARRES MOYENS 5.32 24.00 30.01 50.79 24.03 1.08 10.84 7.03 1.53
S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. FACTEUR2 VAR. FACTEUR3 VAR.INTERF1*2 VAR.INTERF1*3 VAR.INTER2*3 VAR.INTER1*2*3 VAR.RESIDUELLE 504 .96 24.00 60.02 152.38 48.06 3.25 65.06 42.19 110.00
D.D.L 95 1 2 3 2 3 6 6 72
TEST F. 15.71 19.64 33.25 15.73 0.71 7.10 4.66
PROBA 0.0002 0.0000 0.0000 0.0000 0.5531 0.0000 0.0006
E.T
C.V
1.24
55.4%
NOMBRE DOBSERVATIONS : 96 NOMBRE DE VARIABLES : 9 DISPOSITIF DE LESSAI : FACTORIEL 3 FACTEURS EN RANDOMISATION TOTALE
d) Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%

Tableau 23 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%
FACTEUR 1 2 1 1 2 3 2 2 3 2 1 3 1 3 1 2 1 1 1 1 3 1 3 3 2 2 1 1 3 2 1 2 2 2 2 2 1 3 4 1 1 4 2 1 2 2 3 4 2 3 1 1 2 4 1 1 2 2 3 3 2 2 4 1 1 1 2 1 4 2 3 2 LIBELLES Lum-30-gel Lum-30-ms/4 Obs-30-ms/4 Lum-25-ms/4 Lum-35-gel Obs-25-gel Lum-25-ms/4 Lum-35-ms /4 Obs-30-gel Lum-35-ms/2 Lum-30-ms/2 Obs-30-ms/2 Lum-35-gd Lum-25-gd Obs-25-ms/2 Obs-35-gd Obs-35-gel Lum-30-gd Lum-25-ms /2 Obs-35-ms/4 Obs-30-gd Lum-25-gel Obs-35-gd Obs-35-ms/2 MOYENNES 7.25 7.00 5.00 4.25 3.75 3.50 3.25 3.00 2.75 2.50 2.50 1.25 1.00 1.00 0.75 0.75 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.25 0.25 0.25 GROUPES HOMOGENES A A B B B B B B B B B C C C C C C C C C C C
D D D D D D D D D
E E E E E E E E E D D D D D D D
E E E E E E E E E E
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Interprtation Daprs lanalyse de variance, on constate que pour les facteurs tudis: facteur luminosit (F1), facteur temprature (F2), facteur milieu de culture (F3), et les interactions entre facteur F1*2, F2*3 et F1*2*3, les probabilits calcules sont infrieures 0,05. Seule la probabilit calcule de linteraction entre facteur F1*3 est suprieure la probabilit thorique P = 0,05. Il y a donc une diffrence significative entre les facteurs tudis: luminosit, temprature et milieu de culture et une grande interaction entre les facteurs luminosit-temprature, temprature-milieu de culture et surtout entre ces trois facteurs luminosit-temprature-milieu de culture. Pour linteraction entre facteur F1*3, la probabilit est suprieure la probabilit seuil, par consquent, on peut dire quil ny a pas dinteraction ou dinterdpendance entre le facteur lumire et le facteur milieu de culture. On procde aprs un test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, pour vrifier les groupes homognes de chaque facteur tudi. Daprs le test de NEWMAN-KEULS, au seuil de 5%, on constate la prsence de 6 groupes homognes, selon les interactions entre les trois facteurs F1, F2 et F3 tudis et suivant leurs moyennes respectives. Les groupes homognes prpondrants groupe A suivis du groupe B, dterminent les interactions entre facteurs les plus importantes, savoir: linteraction entre facteur luminosit-temprature-milieu de culture: lumire-30C-eau glose, suivie de linteraction: lumire-30C-MS/4, et linteraction: obscurit-30C-MS/4. On constate toujours partir de ces rsultats que linteraction entre les trois facteurs joue un rle prpondrant dans la vitesse de germination. On obtient toujours un pourcentage de germination plus lev des graines au bout de 6 jours dinoculation, dans une meilleure condition dasepsie et de mise en culture en matrisant parfaitement les facteurs : luminosit, temprature et les milieux de culture tablis. On constate galement que les rsultas obtenus par la dtermination de la capacit et la vitesse de germination sont peu prs gaux et ne varient pas beaucoup. Ces trois facteurs tudis constituent donc les facteurs limitants de la germination de lespce. On peut confirmer aussi que les graines de lespce sont photosensibles, cest--dire quelles ont besoin dune certaine quantit de lumire pour germer. Les hypothses spcifiques concernant la germination des graines ont t donc dmontres. En effet, partir des rsultats danalyse des tests statistiques, la germination des graines: en particulier, la capacit et la vitesse de germination, dpendent surtout de plusieurs facteurs: le protocole de dcontamination des graines, dune part et les protocoles de mise en culture dautre part, en jouant sur trois facteurs prpondrants: luminosit-temprature-milieu de culture.
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La germination des graines (Figure 9) seffectue comme suit : - au bout 6 jours densemencement, la graine simbibe deau par phnomne dosmose et se gonfle. Les tguments de la graine se dchirent un bout (Figure 9.3). - aprs 12 jours de culture, la racine de la plantule apparat et aprs 21 jours ou environ trois semaines, la tige se dresse, coiffe de lensemble du reste de la graine (Figure 9.4). La germination de lespce est donc pige et ces cotyldons sont orbiculaires, de forme arrondie. Le jeune plant est trs fragile et mesure moins de 10 mm de longueur au bout dun mois de mise en culture. - aprs 1 2 mois de culture, les jeunes plants pourront tre repiqus sur de nouveaux milieux de dveloppement et denracinement pour se dvelopper et crotre pleinement (Figures 9.5 et 9.6).
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Figure 9.1 : Graines rcoltes viables
Figure 9.2 : Graines tries avec une loupe
Figure 9.3 : Germination au bout de 6 jours
Figure 9.4 : Dveloppement au bout 1 mois
Figure 9.5 : Repiquage des graines dans un milieu de croissance
Figure 9.6 : Plantules ges de 2 mois
Figure 9 : Clichs rsumant les diffrentes tapes de la germination de la graine
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III.2 Rsultats des essais sur la rgnration "in vitro" de lespce III.2.1 Rsultats des essais sur la dcontamination des explants III.2.1.1 Avec Na Cl O 12%
Les rsultats des exprimentations sont rsums dans le tableau 22 suivant: Tableau 22 : Rsultas bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination Na Cl O 12%
Explant
Feuille et mristme
Produits de dsinfection et de strilisation Et OH 70 / Na Cl O 12% T1 : 0 min / 0 min T2 : 0 min / 5 min T3 : 5 min / 0 min T4 : 5 min / 5 min T5 : 5 min / 2 min 30 T6 : 2 min 30 / 5 min T7 : 2min 30/ 2 min30
Bloc1 : boite de Ptri avec 5 explants 0/5 1/5 1/5 1/5 5/5 5/5 1/5
Bloc 2 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 1/5
Bloc 3 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 1/5
On constate quaprs 3 4 jours dinoculation, il y a apparition dune voile blanchtre tout autour des explants traits avec T1, T2, T3, T4 et T7. Seuls les explants traits avec T5 et T6 (produit dtergent antiseptique: Na Cl O 12%) sont sains, non contamins et continuent leur dveloppement dans le milieu tmoin.
III.2.1.2 Avec Ca (O Cl2) 5%

Les rsultats des exprimentations sont reprsents dans le tableau 23 suivant: Tableau 23 : Rsultas bruts des essais relatifs aux produits de dcontamination Ca (O Cl2) 5%
Produits de dsinfection et de strilisation Et OH 70 / Ca (O Cl2) 5 % T8 : 0 min / 0 min T9 : 0 min / 10 min T10 : 10 min / 0 min T11 : 30 s / 10 min T12 : 1 min / 10 min T13 : 30 s / 15 min T14 : 1min / 15 min
Explant
Bloc1 : boite de Ptri avec 5 explants 0/5 1/5 1/5 1/5 5/5 5/5 3/5
Bloc 2 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 1/5
Bloc 3 5 explants 1/5 2/5 0/5 2/30 5/5 5/5 2/5
Feuille et mristme
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Pour les traitements T8, T9, T10, T11 et T14, on constate toujours aprs quelques jours dinoculation lapparition de tche blanchtre et de nombreux points noirs se dveloppant tout autour des explants. Seuls les explants traits avec T12 et T13 restent sains. Ces observations montrent la prsence de champignons et de bactries sur les explants. Par consquent, les protocoles de dcontamination nont pas t russis pour la plupart des traitements sauf pour T12 et T13 [produit antiseptique: Ca (O Cl2) 5%]. On constate par ailleurs que la nature des explants (mristme apical et feuille) ninflue pas sur le protocole de dcontamination. En effet, les protocoles de dcontamination restent inchangs quelques soient les explants utiliser. On constate par ailleurs que les concentrations des dtergents sont utilises faible dose (5 12%) car une forte concentration, le produit chlor devient trs toxique pour lexplant mis en culture et entranerait leur dgnrescence. Ainsi, les explants, aprs trempage dans ces produits, ncessitent toujours un grand rinage dans de leau distille strile aux moins trois fois de suite pour liminer toutes traces de produits dtergents.
III.2.1.3 Traitements des donnes a) Analyse de variance

Les rsultats de lanalyse da variance sont consigns dans le tableau 24 suivant : Tableau 24 : Analyse de variance de leffet des dtergents sur la rgnration des explants
CARRES MOYENS 3.29 8.88 0.39
S.C.E VAR. TOTALE VAR. FACTEUR1 VAR. RESIDUELLE1 125.12 115.45 9.67
D.D.L 38 13 25
TEST F. 22.97
PROBA 0.0000
E.T
C.V
0.62
27.8%
NOMBRE DOBSERVATIONS : 42 NOMBRE DE VARIABLES : 4 DISPOSITIF DE LESSAI : RANDOMISATION TOTALE

Interprtation A partir de lanalyse de variance effectue, on peut dire que la probabilit calcule du facteur tudi est gale 0 donc infrieure la probabilit thorique P = 0,05 ou 5%. Par consquent, on peut dire quil y a une grande diffrence significative entre les traitements. Ainsi, on procde alors un test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, pour connatre le ou les traitements prpondrant(s).

Le tableau 25 suivant montre les rsultats du test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5%, mettant en vidence les groupes homognes avec leurs moyennes respectives, correspondant aux traitements effectus.
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Tableau 25 : Test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% sur leffet des dtergents
FACTEUR 12 5 6 13 14 11 4 9 2 8 7 1 10 3
MOYENNES 5.00 5.00 4.67 4.33 2.00 1.67 1.67 1.67 1.67 1.00 1.00 0.67 0.50 0.50
GROUPES HOMOGENES A A A A B B B B B B B B B B
Interprtation Daprs le test de NEWMAN-KEULS, les 14 traitements ont t regroups en deux groupes homognes diffrents : A et B suivant leurs moyennes respectives. On constate que les traitements T12 :1 min/10 min et T13 :30s/15 min avec Ca (O Cl2) 5% suivis de T5 : 5 min/2 min30 et T6 : 2 min 30/5 min avec Na Cl O 12% forment une mme groupe homogne ayant une moyenne leve. Par consquent, ce sont les traitements adquats pour la dcontamination des explants. Lautre groupe homogne B est form par les autres traitements qui ont eu des moyennes plus faibles, donc des traitements inefficaces. Le tableau des rsultats nous rvle seulement deux groupes homognes A et B, puisque, avec llaboration des dispositifs exprimentaux, les traitements effectus ont t rduits en nombre cause de la quantit moindre des explants. Ainsi, cest le protocole de dcontamination avec le produit dtergent Na Cl O 12% et le traitement T5 : 5 min / 2 min 30, que nous allons utiliser dans les suites des exprimentations, pour la strilisation des explants lors de la culture "in vitro". En effet, le cot de ce produit (hypochlorite de sodium ou eau de javel) est plus abordable et facile trouver.
III.2.2 Rsultats des essais sur la culture " in vitro" de lespce

Les rsultats obtenus sur la culture "in vitro" sont rsums dans le tableau 26 suivant selon des intervalles de temps diffrents auxquels, on a not plus de modifications. En effet, pour cette technique, on ne pouvait pas traiter les rsultats statistiquement, avec le logiciel utilis, car les nombres des explants mis en culture ont t trs faibles, et les rsultats obtenus risquent de ne pas tre reprsentatifs. Par consquent, on a not les modifications observables, au niveau des explants mis en culture, selon des intervalles de temps diffrents.
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Tableau 26 : Rsultats des essais relatifs la culture "in vitro" de lespce

auxine/ cytokinine 0/0 0,1 / 0,06 MS 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 0,1 / 0,01 Feuille MS/2 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 GD 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 0/0 0,1 / 0,06 GD 0,1 / 0,01 6/3 0,05 / 0,01 Aprs 4-5 semaines Racine Cal compacte jauntre Racine Cal compacte Cal compacte Racine Cal Racine Cal compacte Cal compacte Aucune modification Aucune modification Aucune modification Cal compacte Aucune modification Racine Microfeuille Microfeuille dgnrescence Microfeuille Racine Cal Microfeuille dgnrescence Microfeuille Racine Aucune modification Aucune modification dgnrescence Aucune modification
Explant
Milieu
8 semaines Racine Cal compacte jauntre Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille Racine Cal friable Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille Aucune modification Aucune modification Aucune modification Cal compacte Aucune modification Racine Microfeuille Microfeuille dgnrescence Microfeuille Racine Cal friable Microfeuille dgnrescence Microfeuille Racine Aucune modification Aucune modification dgnrescence Aucune modification
12 semaines plantule Germination de plantules Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille plantule Embryons Racine Bourgeonnent foliaire Microfeuille Aucune modification Aucune modification Aucune modification Cal compacte Aucune modification Racine Microfeuille Microfeuille dgnrescence Microfeuille Racine Embryons Microfeuille dgnrescence Microfeuille Racine dgnrescence dgnrescence dgnrescence dgnrescence
MS
MS/2
Mristme
Observations : Les explants mis en culture non contamins, devront tre observs et suivis pendant les 15 premiers jours sous une loupe binoculaire ou un stroscope. Les observations et modifications, qui seffectuent au niveau des explants, sont alors notes et interprtes. Ces modifications morphologiques se sont manifestes par la formation des cals, lapparition de bourgeonnement foliaire ou apparition de microfeuille, la formation des racines et pour certains explants, leurs dgnrescences.
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Bourgeonnement foliaire ou microfeuille (Figure 10 et Figure 13) On a observ cette modification au niveau des explants mristmatiques et les explants foliaires. - A environ 4-5 semaines de culture, . les explants mristmatiques (Figure 13.4) et explants foliaires (Figure 13.5) deviennent jauntres, et un cal daspect blanchtre apparat (cal de cicatrisation), puis ils augmentent de volume et sallongent. - A environ 8-12 semaines de culture, . on constate lapparition de bourgeonnement vgtatif ou de nombreuses microfeuilles qui apparaissent sur les explants mristmatiques, au dbut de forme blanchtre, et aprs quelques jours, ces microfeuilles changent de couleur et deviennent vertes (Figure 10.1). - Aprs 3 mois de culture, . les microfeuilles sont plus dveloppes et pourront tre repiques sur de nouveaux milieux
dinduction de racine (Figure 10.5) ou des milieux dinduction de cals (Figure 10.4). Les milieux de culture favorables aux bourgeonnements foliaire sont les milieux MS-6/3 et MS- 0,05 / 0,01 pour les explants mristmatiques. Notons quavec le milieu GD, on na obtenu aucun rsultat satisfaisant. Formation de cal (Figure 12): Linduction de cal dpend des milieux de culture utiliss et surtout de lquilibre hormonal entre auxine/cytokinine. Ainsi, entre les quilibres hormonaux: 0,1/0,06 ; 0,05/0,01 et 6/3 avec les milieux respectifs MS et MS dilu de moiti, on a obtenu la formation de cals de diffrentes natures : il y a des cals friables ou cals idaux (Figures 12.2 et12.3), des cals jaunes (Figure 12.1) et des cals compacts (Figure 12.5) non embryognes. Dans notre culture, avec la formation de cal, on a distingu les phases suivantes : - De 0 4 semaines : . on constate une ddiffrenciation du tissu foliaire en cal aqueux pour la culture de mristme et des explants foliaires. . une apparition de cal de cicatrisation (cal compact) de couleur verdtre pour certains explants foliaires. . une augmentation de volume des explants foliaires en senroulant sur lui-mme. - A environ 4-5 semaines de culture : . on constate lapparition de globules mristmatiques de couleur blanchtre sur lexplant; ces globules saugmentent petit petit de volume et de quantit.
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- A environ 8 semaines de culture : . une augmentation de lenflure du corme et une grande augmentation des cals nodulaires daspect laiteux et de couleur blanchtre, ce sont les cals embryognes ou cals friables. - A environ 12 semaines de culture . un dveloppement de cals embryognes constitus par dembryons individuels et friables. Ce sont les cals idaux pour une Suspension Cellulaire Embryogne (SCE), une culture sur milieu liquide agit. - A 1 mois et plus, les cals embryognes deviennent bruns puis verdtres et les embryons individuels donneront de futures plantules composes de deux feuilles opposes. - Aprs 2 mois de culture, il reste repiquer ces embryons individuels sur un nouveau milieu nutritif pour la formation des racines et lobtention de nouvelles plantules. Les milieux de culture avec les quilibres hormonaux favorables pour linduction des cals friables ont t les milieux MS/2 ou milieu MS dilu de moiti avec un rapport auxine sur cytokinine: 0,1/0,06 que ce soit pour la culture de mristme ou pour la culture de tissus diffrencis. Les milieux nutritifs : MS et MS/2 ont donn des cals compacts mais qui nont pas volu.
Rgnration en plantules - A environ 6 semaines de culture, . des racines se sont dveloppes sur quelques explants foliaires dont les milieux de culture sont des milieux MS et MS/2 sans hormone ou dont les quilibres hormonaux taient de lordre de 0,1/0,01; cest--dire, en quantits trs infimes (Figure 11.4). - A environ 12 semaines de culture, . des plantules apparaissent au niveau des racines et continuent leur multiplication (Figure 11.5). Notons que sur le milieu de culture GD avec ces diffrents quilibres hormonaux, on na constat aucun changement notable que ce soit au niveau des explants foliaires que mristmatiques. Aprs des semaines de culture, les explants finissent par se brunir et se dgnrent petit petit. Ce milieu de culture ne semble donc pas tre favorable pour la rgnration de lespce. Aprs la premire phase de la culture "in vitro", cest--dire, linduction de cal et la formation des embryons individuels ainsi que lobtention de microfeuilles, on a effectu la deuxime phase de la culture. Cette seconde phase consiste surtout la rgnration des plantules en repiquant des embryons individuels pour induction de rhizognse, sur un milieu de culture appropri. Pour les microfeuilles: deux milieux de cultures ont t labor.
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Figure10. : Inoculation dun mristme apical 1. Au bout de 4-5 semaines 2. Au bout de 8 semaines 3. Au bout de 12 semaines
Figure 10.2 : Bourgeonnement vgtatif prt pour le repiquage
Figure 10.3 : Culture de mristme dans une armoire de culture
Figure 10.4 : Repiquage dans un milieu dinduction de cal
Figure 10.5 : Repiquage dans un milieu dinduction de racine
Figure 10 : Clichs rsumant les diffrentes tapes de la culture de mristme
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Figure 11.1 : Inoculation de 2 jeunes feuilles dans une boite de Ptri (milieu dinduction de cal)
Figure 11.2 : Micropropagation de feuilles dans des tubes essais (milieu dinduction de racine)
Figure 11.3 : Explant au bout de 4-5 semaines dans un milieu dinduction de cal
Figure 11.4 : Explant au bout 4-5 semaines dans un milieu de rhizognse
Figure 11.6 : Explant au bout de12 semaines
Figure 11.5 : Explant au bout de 12 semaines
Figure 11 : Clichs rsumant les diffrentes tapes de la micropropagation
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Figure12.1 : Cals non embryogne, nodulaires et jaunes
Figure 12.2 : Cals idaux (embryognes)
Figure 12.3 : Cals idaux translucides
Figure 12.4 : Cals idaux avec embryons individuels
Figure 12.5 : Cals compacts (non embryogne)
Figure 12.6 : Cals compacts avec embryons
Figure 12 : Callogense chez Kalanchoe synsepala (BAKER)
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Figure13 : Bourgeonnement vgtatifs (explant foliaire) 13.1 : Au Faible Grossissement 13.2 : Au Moyen Grossissement 13.3 : Au Fort Grossissement
Figure 13. 4 : Evolution de bourgeonnement foliaire dune microfeuille
Figure 13.5 : Dveloppement et croissance de bourgeonnement foliaire issu dun mristme
Figure 13 : Bourgeonnements vgtatifs intenses chez Kalanchoe synsepala (BAKER)
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III.2.3 Rsultats des essais sur la rgnration en plantules de lespce

Aprs 18 jours (3 semaines) de repiquage sur de nouveaux milieux, savoir: un milieu dinduction de racine et milieu dinduction de cal, pour les explants "microfeuilles" et deux milieux dinduction de racine pour les embryons individuels, on obtient les rsultats suivants: Tableau 27 : Rsultats de la rgnration en plantules de lespce
Explant Embryons individuels
Milieu MS MS/2 MS MS/2
Microfeuille
auxine/ cytokinine 0/0 0,1 / 0,06 0/0 0,1 / 0,06 0/0 0,1 / 0,06 0/0 0,1 / 0,06
Aprs 4-5 jours Racine Racine Racine Racine -
2 semaines Racine Racine Racine Racine Cal friable
4 semaines Racine Cal compacte Racine Cal friable Racine Cal compacte Racine Cal friable
- A environ 4 -5 jours de culture : . pour les embryons individuels, on constate le dbut de formation dune touffe minuscule de racine, visible seulement au microscope binoculaire et au fort grossissement, avec le milieu denracinement MS et MS/2 sans hormone (Figure 14.3). . pour les microfeuilles, on constate la formation de cals nodulaires qui se dveloppent petit petit, visible au microscope binoculaire, avec les milieux MS et MS/2 sans hormone (Figure 14.4). - A environ 4 semaines de culture : . pour les embryons individuels, sur les milieux MS/2 avec quilibre hormonal 0,1 / 0,06; les racines se sont dveloppes et lon obtient des plantules enracines (Figure 14.7). . pour les embryons individuels et microfeuilles, sur les milieux MS/2 avec 0,1 / 0,06; les cals friables embryognes continuent leur dveloppement et se multiplient activement (Figure 14.8).
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Figure 14.1 : Embryons individuels
Figure 14.2 : Microfeuilles
Figure14.3 : Repiquage des embryons
Figure14.4 : Repiquage des microfeuilles
Figure 14.5 : Sur milieu denracinement
Figure14.6 : Sur milieu dinduction de cal
Figure 14.7 : Vitroplants (3 mois)
Figure14.8 : Formation de cal (1 mois)
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Figure 14 : Clichs des diffrentes tapes de la rgnration en plantules de lespce
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III.2.4 Limites des techniques de multiplication effectues.

Au cours des exprimentations, on a constat divers problmes: concernant la mthodologie, llaboration et le choix des dispositifs exprimentaux ont pos quelques problmes. Ces derniers se sont manifests au cours des manipulations au laboratoire: en effet, le problme gnral rside avec lobtention dune condition dasepsie trs rigoureuse pour la russite de la culture, une seule spore de champignon pouvant contamine toute une culture ou les milieux employs. On constate toujours un dcalage entre les protocoles dits et les exprimentations proprement dites. Pour la germination "in vitro" des graines, les problmes existent galement dans les triages des graines viables et dans leur manipulation cause de leur taille trs petite. De plus, la notation des graines germes par jour dans les boites de Ptri fut trs difficile effectuer. Des obstacles apparaissent et ncessitent dtre tudies trs profondment quant la suite des travaux : - il y a tout dabord une grande difficult sur le cot des diverses techniques : leurs applications exigent dnormes dinfrastructures (laboratoire quip et spcialis), de matriaux sophistiqus (hotte flux laminaire, autoclave, armoire de culture) et des produits et consommables trs coteux (hormones vgtales etc.). Dans le cadre de notre recherche, ce sont ces problmes qui sont apparus pendant les travaux: recherche de laboratoire quip et les produits consommables etc. Ainsi, faute de moyens et de matriels, on a limit toujours notre dispositif exprimental pour rduire les dpenses occasionnes par tous ces frais de laboratoire. Cest aussi la raison pour laquelle ces techniques sont souvent peu dveloppes et non exprimentes Madagascar comme la technique de la suspension cellulaire embryogne, faute de moyens et de budgets. - les limites de la culture au point de vue technique rside galement dans ce que nous appelons: la variation somaclonale ou vitrovariant. La rgnration par culture "in vitro" est lun des outils de plus en plus utiliss dans le cadre des biotechnologies vgtales. Toutefois, au cours de ces rgnrations, il arrive que de nouveaux phnotypes apparaissent. En effet, le passage par cal ou le nombre de cycles de culture "in vitro" sont des facteurs pouvant induire des variants, cest--dire que des plantes dont le gnome est sensiblement diffrent de celui de la plante de dpart ( mutation ou somation). Mais en contre partie, on pourrait donc exploit cette technique en crant de la variabilit chez certaine espce avec lintroduction des pressions de slection tels le froid, les toxines etc. Ainsi, au moment de la rgnration, on pourrait obtenir des plantes nouvellement rsistantes de nombreux facteurs. Mais pour notre espce, nous pensons que les lments de base de la variabilit peuvent tre: la dure de la culture "in vitro", les milieux de culture et surtout la concentration des rgulateurs de croissance. Dans de prochains travaux, nous essayerons de dterminer sil y existe de variants au niveau de nos vitroplants avec lutilisation de la biologie molculaire. Cette technique est trs rcente permettant de rvler la diversit gntique cache au cur des chromosomes des cellules. De plus, elle permet galement didentifier les espces, des varits ou des clones pour la valorisation des ressources phytogntiques Madagascar.
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Discussions
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IV. DISCUSSIONS IV.1 Discussions mthodologique

La discussion porte tout dabord sur la mthodologie adopte pour la germination et la rgnration "in vitro" de lespce. En effet, on a constat limportance tenue par les tudes bibliographiques concernant lcologie et la physiologie de lespce. Cest partir des ces donnes recueillies quon a pu mettre en place les dispositifs exprimentaux en tablissant les diffrents facteurs qui peuvent influencer sur la germination et la rgnration de lespce. Par exemple, linfluence de la luminosit la temprature, lhumidit relative, et les milieux de culture dans les sites dtude. Par consquent, pour une tude approfondie de ces techniques, les tudes cologique et physiologique doivent tre trs pousses afin de dterminer les diffrentes corrlations ou interdpendances entre ces facteurs. Concernant les protocoles exprimentaux pour la dcontamination des explants, la technique a t dj employe dans la rgnration de plusieurs espces "in vitro" mettant en vidence le rle primordial de lasepsie dans ces types de culture. En effet, il a t dj prouv que la condition de russite de la culture "in vitro" repose surtout sur lasepsie des explants mis en culture. Pour notre cas, on a toujours exploit cette technique de dcontamination en employant plusieurs dtergents chlors, comme lhypochlorite de sodium et lhypochlorite de calcium, pour effectuer la dcontamination. Seulement cette technique de dcontamination demande beaucoup de temps puisque il a fallu effectuer plusieurs protocoles de dcontamination selon les produits dtergents, leur concentration respective et les temps dimmersion des explants dans les produits. De plus, llaboration de ces protocoles a t faite par "ttonnement" puisque les bases de donnes concernant la physiologie germinative de lespce sont presque inexistantes. On a bas notre protocole sur des donnes recueillies de quelques espces comme pour le cas des GRAMINEES dont la morphologie gnrale des graines se ressemble. Il faut aussi dterminer des protocoles de dcontamination en fonction de la nature des explants, cest--dire, la nature de la graine.
IV.2 Discussions des rsultats

Concernant les rsultats des divers techniques de multiplication vgtative sexue et asexue, pour la germination des graines de lespce, on a constat donc une grande relation entre les facteurs extrinsque et le taux de germination de lespce, entre autre linfluence de la lumire, de la temprature de mise en culture et des milieux choisis. De plus, ces rsultats montrent une certaine relation avec des rsultas obtenus concernant la germination des graines de quelques espces de
GRAMINEES. En effet, ltude des proprits germinatives de quelques semences dadventices du
Sud-Ouest de lle a montr que la temprature optimale pour la germination de semences est de 30C et que les grandes semences germent mieux et plus vite que les petites. De telles diffrences de comportements ne sont pas exceptionnelles dans les rgions subissant de fortes fluctuations des conditions cologiques (RASOLOFOSON V F, 1997). Seulement, les semences des adventices ont subi
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Discussions
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des prtraitements comme la scarification manuelle, la dnudation et des traitements avec des produits chimiques permettant damliorer la capacit de germination. De plus la luminosit ne semble pas influencer le taux de germination des semences des GRAMINEES. Pour la germination "in vitro" de lespce, les tests statistiques adopts ont t toujours lanalyse de variance suivi du test de NEWMAN-KEULS au seuil de 5% afin de mettre en vidence les diffrences significatives entre les traitements effectus et les groupes homognes correspondant aux moyennes les plus leves. Nanmoins, des tests de corrlation devraient tre effectus pour les traitements les plus prpondrants, suivant le taux de germination de lespce. Les expriences faites partir de graines montrent que toutes jeunes plantes peuvent crotre semblablement sur des milieux divers. Ce nest quaprs puisement des rserves nutritives des graines quelles se dveloppent diffremment sur les milieux diffrents. Ainsi, la mthode suivante peut tre utilise: on sme sur un milieu priv des lments dont on veut tudier les effets (eau glose). Cest par la suite quon effectue des repiquages systmatiques sur des milieux tester. . Pour la culture "in vitro" de lespce, les techniques exprimentes tablies, que ce soit pour la dcontamination ou pour la culture proprement dite, ont t bases sur celles qui sont en vogue actuellement dans les centres de recherche pour la rgnration despces mdicinales ayant de grande potentialit conomique pour le pays, comme les techniques de rgnration "in vitro" de Catharantus roseus, Prunus africanum etc. Seulement, les tests de comparaison du taux de principe actif du vitroplant et celui dune plante rcolte dans le milieu dorigine nont pas encore t raliss et doivent tre effectus afin damliorer la potentialit de cette technique. . Les rsultats donns par ces expriences sont obtenus seulement avec des explants foliaires, on na pas pu effectu la rgnration avec dautres organes vgtatifs limits par les moyens. . Avec le test statistique, on ne peut se rendre compte avec prcision des rsultats des expriences sous forme numrique comme le nombre de feuilles de chaque plantule, la longueur moyenne des tiges, dimension des racines, etc. Ainsi, dautres tests statistiques et des mesures devront tre effectus permettant de juger de leffet de tel milieu ou hormone, non seulement sur la croissance totale du vgtal, mais aussi sur le dveloppement de chacun des organes, parfois mme sur sa multiplication et les rsultats numriques apports par ces expriences nont de valeur que si elles sont obtenues partir dun grand nombre de plantes et permettant de conclure dune faon trs satisfaisante. . Enfin, pour les repiquages successifs des plantules, linfluence dun lment donn, une dose dtermine, peut varier avec la composition chimique de lensemble du milieu nutritif. Des rapports et des balancements entre les diverses hormones en prsence entrent en jeu. Ces espces doivent avoir une alimentation quilibre et linsuffisance de tel ou tel lment indispensable peut gner le dveloppement du vitroplant.
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Propositions de protocoles exprimentaux

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V. PROPOSITION DE PROTOCOLES EXPERIMENTAUX POUR LA GERMINATION ET REGENERATION DE Kalanchoe synsepala (BAKER) V.1 Protocoles exprimentaux proposs pour la dcontamination et la germination des graines
Tableau 28 : Protocoles exprimentaux proposs pour la dcontamination et la germination des graines
Protocole exprimental 1 : Protocole pour la strilisation et dsinfection des graines Explant Graine sche dans une tuve 35C pendant 30 jours Explant Graine sche dans une tuve 35C pendant 30 jours Graine sche dans une tuve 35C pendant 30 jours Produits de dcontamination et dure de trempage Ethanol 70 pendant 5 min Na Cl O 12% pendant 2 min 30 Produit de rinage Eau distille strile, 3 fois, 5 min chacune Produit de rinage Eau distille strile, 3 fois, 5 min chacune Eau distille strile, 3 fois, 5 min chacune
Produits de dcontamination et dure de trempage Ethanol 70 pendant 1 min Ethanol 70 pendant 30 min Ca (O Cl2) 5% pendant 10 min Ca (O Cl2) 5% pendant 15 min
Protocole exprimental 2 : Protocole pour la germination des graines Explant Graine dcontamine et strilise Luminosit dans larmoire de culture Photopriode 16h/8H Temprature 30C Milieu de culture Eau glose 7g/l ou MS dilu de quart sans hormone
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Rsum : SEMIS DES GRAINES et REPIQUAGE 1Dsinfection des graines dans une solution dhypochlorite de sodium 12% ou dhypochlorite
de calcium 5%, suivie dun rinage leau distille strile. Lhypochlorite de calcium est le plus souvent utilis car il ne pntre pratiquement pas dans les tissus. Remarque : Avec leur poids et leur faible taille, lutilisation dun papier filtre en forme de
"cornet" strilis est ncessaire pour la dcontamination des graines dans les produits de dsinfection. 2Prlvement des graines dcontamines avec une pince strile (passe la flamme) et semes
dans des boites de Ptri contenant le milieu de germination. Remarque : Lopration ncessite une condition dasepsie parfaite : . Passage des mains lalcool 70, . Port dune blouse propre, . Manipulation sous hotte flux laminaire strile, . Manipulation des graines prs dune flamme dun Bec Bensen (moins de 20 cm). 3Aprs une dure de 1 2 mois de culture, les jeunes plants issus de la germination sont
repiqus sur un nouveau milieu dit milieu de dveloppement, dans des boites de Ptri ou dans des bocaux striles. 4Aprs une dure de 2 3 mois dans ce milieu de dveloppement, les plantes sont sorties des
flacons, les racines bien nettoyes leau claire pour enlever la glose. Les jeunes plantes ges de 2 3 mois sont alors repiques en pot : sable fin, sable et engrais, dans un milieu dacclimatation ou serre en garantissant une temprature et une humidit relative constante.
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V.2 Protocoles exprimentaux proposs pour la dcontamination et la rgnration "in vitro"

Tableau 29 : Protocoles exprimentaux proposs pour la rgnration de lespce
Protocole exprimental 1 : Protocole pour la dcontamination des explants mristmatiques et foliaires Explant Mristme et feuille Mristme et feuille Explant Mristme et feuille Mristme et feuille Produits de dcontamination et dure de trempage Ethanol 70 Na Cl O 12% pendant 5 min pendant 2 min 30 Ethanol 70 Na Cl O 12% pendant 2 min 30 pendant 5 min Produits de dcontamination et dure de trempage Ethanol 70 Ca (O Cl2) 5% pendant 1 min pendant 10 min Ethanol 70 Ca (O Cl2) 5% pendant 30 min pendant 15 min Produit de rinage Eau distille strile, 3 fois, 5 min Eau distille strile, 3 fois, 5 min Produit de rinage Eau distille strile, 3 fois, 5 min Eau distille strile, 3 fois, 5 min
Protocole exprimental 2 : Protocole pour la culture in vitro des explants Explant Mristme Mristme Feuille Feuille Feuille Technique de culture Culture de mristme Culture de mristme Micropropagation Embryogense somatique Micropropagation Objectifs Callogense Bourgeonnement vgtatif Bourgeonnement vgtatif Callogense Rhizognse Milieu de culture MS/2 + 0,1/0,06 MS + 0,1/0,01 MS + 6/3 MS/2 + 0,1/0,06 MS ou MS/2 sans hormone
Protocole exprimental 3 : Protocole pour la rgnration en plantule Explant Embryon individuel Microfeuille Microfeuille Objectifs Rhizognse Rhizognse Callogense Milieu de culture MS ou MS/2 sans hormone MS ou MS/2 sans hormone MS/2 + 0,1/0,06
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Ainsi, pour la culture "in vitro" de lespce, les critres dvaluation obtenus nous donnent les rsultats suivants : - Formation de cals idaux Pour la technique de la culture de mristme, le pourcentage (%) de cals idaux est denviron 28%, cest--dire le nombre de cals idaux par rapport au nombre de mristmes inoculs. Pour la technique de la micropropagation, le pourcentage (%) de cals idaux est de 36%, cest--dire le nombre de cals idaux par rapport au nombre dexplants inoculs. Le cal idal est form par des agrgats cellulaires homognes. Cette homognit est observe aprs 3 4 mois de culture. - Etablissement de suspensions cellulaires embryognes ou SCE Pour ces deux techniques de culture "in vitro", La technique de Suspension Cellulaire Embryogne (SCE), seffectuant sur milieu liquide agit, ne pouvait pas tre exprimente, faute de temps car les cultures sur milieu liquide demande plusieurs mois pour que les embryons puissent se dvelopper pleinement. - Formations dembryons Le taux de russite de formation dembryons avec les cellules embryognes (embryogense somatique) est denviron 12%. Seuls certains embryons dj mtures ont t repiqu cause dune manipulation trs difficile sous loupe binoculaire, laide dune pince fine sous hotte. - Potentiel de rgnration Le potentiel de rgnration de lespce, avec les repiquages successifs sur diffrents milieux, est lev, car on a obtenu de rsultats au bout de 2 jours de repiquage des microfeuilles et des embryons. Ainsi, le potentiel de rgnration de lespce est de 64%.
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V.3 Perspectives pour la culture "in vitro" de lespce

Pour lamlioration de ces diffrentes techniques de germination et de culture "in vitro", les donnes bibliographiques et les techniques employes doivent tre trs enrichies et toujours mises jour. Pour notre espce, des essais damlioration des techniques de dcontamination et de culture devront tre entreprises, avec lapplication dautres produits antiseptiques ou la manipulation seffectuant une certaine temprature leve dtruisant les champignons et bactries. Pour la culture "in vitro", avec ladoption de nouvelles techniques comme lobtention dhaplodes: les individus haplodes (possdant un seul jeu de chromosomes) constituent un matriel privilgi pour ltude de lexpression des gnes; ils permettent galement de produire rapidement, par doublement chromosomique, des individus totalement homozygotes (dont tous les gamtes porteront les mmes gnes). Des haplodes peuvent apparatre naturellement, par parthnognie spontane ou lors dhybridations interspcifiques. Le phnomne est toutefois peu frquent, et des mthodes de production dhaplodes ont t recherches. Les plus employes sont les techniques de culture "in vitro" dorganes reproducteurs mles ou femelles immatures, voire mme de cellules sexuelles : pollen, ovules. La culture et fusion de protoplastes : les protoplastes sont des cellules vgtales dbarrasses, par un traitement enzymatique, de leur paroi pecto-cellulosique et qui peuvent ainsi tre fusionnes entre elles. Cette fusion permet la cration dhybrides interspcifiques qui ne peuvent tre obtenus par fcondation. Ces hybrides prsentent de plus la particularit de possder la fois les noyaux et les cytoplasmes des deux cellules initiales (lors dune fcondation, seul le noyau de la cellule mle passe dans lovule. Le transfert de gnes de rsistance aux insectes, aux virus ou aux herbicides est en cours de validation agronomique. A plus long terme, lintroduction de gnes modifiant la qualit des produits ou codant pour des molcules dintrt pharmaceutique sera ralise. Dans les recherches futures, les essais dacclimatation de la plante ou conduite sous serre devront tre dvelopps pour avoir une grande disponibilit de plantules. Il sagit dans ce cas dtudier les effets de divers substrats qui auront plus dinfluence sur la croissance et le dveloppement des plantules. Plus tard, des essais de transplantation de plantes dans leur milieu naturel devront tre aussi effectus pour dterminer sil y a des variations phnotypiques (au niveau morphologique) entre les vitroplants et une plante mre. Pour la culture "in vitro" proprement dite, nous avons constat, que le potentiel de rgnration dun espce non ligneuse est aussi lev que celui dune espce ligneuse, malgr leur particularit morphologique et physiologique (absence de tige, dentrenoeud, Mtabolisme CAM etc.) Ainsi, dans les recherches futures, ces protocoles dits pourront servir aussi de base pour la rgnration despce ligneuse ou non prsentant des difficults au niveau de leur multiplication et leur prservation. Il sagira ensuite dtablir une relation entre les protocoles exprimentaux et la nature mme de lespce considre.
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Conclusion
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CONCLUSION
Lespce Kalanchoe synsepala (BAKER), famille des CRASSULACEAE, une plante herbace non ligneuse, daprs les diffrentes techniques de multiplication sexue et non sexue employes, peut tre multiplie par voie sexue (graine) et par voie vgtative (mristme apical et feuille). La proprit de totipotence cellulaire, dj prouve dans les tudes ultrieures a t confirme et on a aussi montr que lespce possde une facult germinative leve en respectant les conditions optimales de culture comme la luminosit, la temprature, et les milieux de culture. Dans ce travail, les hypothses spcifiques ont t vrifies. En effet, partir des rsultats obtenus et vrifis par des tests statistiques, on constate que la germination des graines et la rgnration "in vitro" des explants est en relation troite avec les protocoles de dcontamination labors. Ces protocoles de dcontaminations sont constitus par les produits antiseptiques base de chlore utiliss avec leurs diffrentes concentrations respectives [Na Cl O 12% et Ca (O Cl2) 5%] et suivant la dure de trempage du matriel vgtal. Les protocoles de dcontamination sont toujours suivis dun grand rinage plusieurs reprises du matriel vgtal avec de leau distille strile. De plus, la germination des graine et la rgnration en plantule dpend troitement aussi des divers conditions de mise en culture, savoir: la luminosit et la temprature de larmoire de culture ou de ltude de germination, et des divers milieux de culture labors. Pour la germination des graines, ces trois facteurs sont les plus prpondrants et considrs comme facteur limitant de la germination. Pour la rgnration des explants "in vitro", le facteur prpondrant est lquilibre hormonal entre lauxine et la cytokinine. On a pu mettre en vidence ainsi, le rle primordial jou par les milieux de culture et les quilibres hormonaux sur la rgnration "in vitro" de lespce. Lhypothse gnrale a t donc vrifie, car on a pu tablir que la facult germinative des graines et les potentiels de rgnration "in vitro" des explants sont dpendant de linteraction de plusieurs facteurs extrinsques, mais le facteur primordial reste le facteur qui est en relation avec le mtabolisme de lespce, il sagit de la totipotentialit des tissus de lespce. Dans llaboration de ces divers protocoles, on a aussi constat lintrt port par dautres tudes (chimique, pdologique) sur les techniques de culture "in vitro". En effet, ltude chimique a permis de mettre en vidence certains composs comme le phnol dans la plante dont les produits doxydation sont trs toxiques pour les tissus mis en culture. Ainsi, pour faire face ce problme, on a ajout des anti-oxydants comme lacide citrique ou acide ascorbique dans les produits de dcontamination, de rinage et dans les milieux de culture mais de faible dose aux environs de 1,5%. Ltude pdologique a montr que lespce pousse sur des produits daltration de roche riche en minraux ferro-magnsien do le choix des milieux de culture riche en fer et magnsium, trs utiles pour la plante et qui ont donn de meilleurs rsultats dans la rgnration de lespce. Enfin, on peut dire que les rsultats obtenus ont t satisfaisants avec un pourcentage assez lev de 75% pour la germination des graines et un pourcentage de 64% pour la rgnration "in vitro" de
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Conclusion
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lespce mais des intervalles de temps plus longues. Par consquent, ces divers protocoles de multiplication asexue et vgtative "in vitro" pourront tre exploits dornavant pour la sauvegarde et la multiplication en nombre de lespce et pourront tre adopt aussi dautres espces du mme genre ou mme Famille pour concilier la gestion durable dune espce et son utilisation. Enfin, lobjectif principal de ce travail, a t ralis, avec lacquisition et la matrise parfaite des diffrentes techniques de germination et de culture "in vitro" existant, surtout au niveau national. On peut aussi dgager, partir des rsultats obtenus, des principes essentiels dcoulant de trois lois fondamentales: - les explants utiliss devront tre toujours striliss et dcontamins avec des produits antiseptiques (loi de dcontamination ou dasepsie), - la russite dune culture "in vitro" dpend surtout de la composition des milieux de culture tablis (macrolments, microlments, vitamines et hormones), - il y a une grande interdpendance (loi dinteraction) entre divers facteurs extrinsques (temprature, humidit relative, milieu de culture etc.) et les facteurs intrinsques (biologie et physiologie de lespce : espce photosensible etc.). Llment qui se trouve en plus faible quantit par rapport aux besoins de lespce dtermine limportance du rendement (loi du minimum). Le choix de plante-mre ou porte graine vigoureuse et saine contribue galement la russite de la technique.
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Bibliographie
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Annexe _________________________________________________________________________________
ANNEXE I
PREPARATION SOLUTION MERE : Muraschige et Skoog (1962)
1) Macrolments : mg /l K NO3 NH4 NO3 Mg SO4, 7H2O KH2 PO4 Ca Cl2, 2 H2O 2) Micro-lments : mg/l H2BO3 Mn SO4, 4 H2O Zn SO4, 7H2O Na Mo O4, 2 H2O Co Cl2, 6 H2O KI Fe SO4, 7 H2O Na2- EDTA 3) ALT inas : mg/l C x 10 1 900 1 650 370 170 440 (264 anhydre) C x 100 6,2 15,5 8,6 0,25 0,25 0,83 27,8 (15,16 anhydre) 37,3 C x 10 1L x 100 Thyamine hydrochloride Pyridoxine hydrochloride Acide nicotinique Myoinositol Sucrose Ph 30 . 103 5,8 0,5 0,5 0,5 100 5 5 5 100 250 cc x 10 1,25 1,25 1,25 250 250 cc x 100 125 125 125 2 500 1L x 100 620 1 560 860 25 25 83 2 780 (1 516) 3 730 250 cc x 100 155 390 215 6,25 6,25 20,75 695 (379) 932,5 C x 10 (1L) 19 000 16 500 3 700 1 700 4 400 (2640) C x 10 (250cc) 4 750 4 125 925 425 1 100 (660)
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Annexe _________________________________________________________________________________
ANNEXE II
PREPARATION SOLUTION MERE : GRESSHOF et DOY (1974) 1) Macrolments : mg /l Ammonium nitrate Calcium nitrate 4 H2O Na2-EDTA Ferrous sulfate 7H2O Magnesium sulfate Manganese sulfate H2O Potassium chloride Potassium nitrate Potassium phosphate monopotassique 2) Micro-lments : mg/l Acide borique Cobalte chloride 6 H 2O Cupric sulfate 5 H2O Molybdic acid 2H2O (sodium ALT) Potassium iodide Zinc sulfate 7H2O 3) Vitamines : mg/l D-Biotine Glycine (Freebase) Myoinositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Sucrose Ph 30 . 103 5,8 0,2 4 10 0,1 0,1 1 C x 100 5 100 250 2,5 2,5 25 0,3 0,025 0,025 0,025 0,8 0,3 C x 1000 (250 cc) 75 6,25 6,25 6,25 200 75 C x 10 1 000 241,2 37,25 27,85 17,099 1 65 1 000 300 C x 10 (1L) 2 500 603 93,12 69,62 42,72 2,5 162,5 02 500 750
ANNEXE III
COMPOSITION des VITAMINES de Morel (Morel et Wetmore, 1951) Biotine Calcium panthotenate Myo-inositol Acide nicotinique Chlorure de pyridoxine Chlorure de thiamine Concentration (mg/l) 0,01 1 100 1 1 1
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Annexe _________________________________________________________________________________
ANNEXE IV
Composition des milieux de culture utiliss dans la culture de mristme, lembryogense somatique, la micropropagation Milieu MS Macro-lments Micro-lments Vitamines Acide ascorbique (mg/l) Myo-inositol (mg/l) AIA (mg/l) BAP (mg/l) 2-4 D (mg/l) Glucose (g/l) Glose nutritive (g/l) pH MS MS Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,8 Milieu MS/2 MS/2 MS/2 Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,7 Milieu MS/4 MS/4 MS/4 Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,9 Milieu GD GD GD Morel 2 100 Suivant Objectif 30 7 5,8
ANNEXE V
Composition des milieux de culture utiliss pour la rgnration des lespce Macro-lments Micro-lments Fe-EDTA Vitamines AIA (mg/l) BAP (mg/l) 2-4 D (mg/l) Acide ascorbique Glucose (g/l) Glose nutritive Ph Milieu de rgnration MS MS + Morel 0,1 0,01 30 7 5,8 Milieu dinduction de cal MS/2 MS/2 + Morel 0,1 0,06 30 7 5,8
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________ ANNEXE IV Tableau rsumant la capacit et vitesse de germination des graines traites avec lhypochlorite de sodium
jours 0 T1 Traitements (%) T2 T3 T4 T5 T6 T7 1 0 0 0 1 1 0 0 2 0 0 0 1 5 3 3 3 0 0 0 4 9 4 9 4 0 0 0 5 5 5 0 0 0 5 6 6 0 0 0 5 6 7 0 0 1 6 6 8 0 0 1 6 7 9 0 1 1 8 8 10 11 12 13 0 1 2 9 0 1 2 1 1 2 1 1 2 14 1 1 2 12 57 15 47 15 16 17 18 19 1 2 2 1 2 3 1 2 3 1 3 3 1 3 3 20 1 3 3 25 97 28 66 21 1 3 3 26 97 37 66 22 1 4 3 27 97 47 66 23 1 4 4 28 97 47 67 24 25 1 4 4 1 4 4 26 1 4 4 28 98 48 67
10 11 12
13 14 16 19 21 66 88 93 96 97 16 17 19 21 24 51 56 59 61 64
28 28 97 98 48 48 67 67
15 17 21 24 28 36 43 45 49 54 10 11 13 14 10 12 15 16 18 25 35 37 42 45
Tableau rsumant la capacit et vitesse de germination des graines traites avec lhypochlorite de calcium
jours 0 T8 Traitements (%) T9 T10 T11 T12 T13 T14 1 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 0 0 3 3 3 0 0 0 0 4 4 0 0 0 0 5 5 0 0 0 0 6 0 0 0 1 7 0 0 1 1 8 0 0 1 1 9 0 1 1 1 10 11 12 13 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 2 14 1 1 1 2 15 16 17 18 19 1 1 1 2 1 1 1 2 1 1 1 2 2 1 1 3 2 1 1 3 20 2 1 1 4 97 95 58 21 2 1 1 4 97 96 59 22 2 1 1 4 97 96 60 23 2 1 1 4 98 97 61 24 25 2 1 1 4 2 1 1 5 26 2 1 1 5 98 97 61
7 10 15 17 21 24 28 36 43 45 61 78 8 13 18 25 28 38 44 67 73 7 10 12 15 16 18 25 35 37 42 45
81 81 79 80 46 47
83 84 89 95 82 83 91 93 47 50 54 57
98 98 97 97 61 61
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________
ANNEXE VII
FICHE TECHNIQUE DE Kalanchoe synsepala (BAKER) Famille : CRASSULACEAE Espce : Kalanchoe synsepala (BAKER) Noms vernaculaires : Sofimbitro, sofingoaika, sofimbato (Partie centrale) et sofintsofiny, mongy vato, Borodoke (Sud de lle) Habitat : Madagascar : Partie centrale et Partie Sud de lle, sur les rocailles et les sols dnuds (Massif granitique, roche sdimentaire) un peu labri du soleil Floraison : Fvrier - Mai Origine : Plante endmique de Madagascar Description : Plante herbace rameau et entre-nud trs court, portant toujours 4 feuilles opposes 2 2, crassulescente et grasse, toujours vertes Appareil vgtatif : Tige toujours dresse mais entre-nud trs court 4 feuilles opposes 2 2, grasses, paisses, vertes, bords pigment de roux, limbe simple peine dente, nervure peu visible Absence de bulbilles sur les feuilles, racine superficielle Mode de multiplication particulire en stolon
Appareil reproducteur : Inflorescence en paniculiforme ou corymbiforme Fleur hermaphrodite de type 4 comprenant: Un calice prfloraison valvaire Une corolle ttra-fide gamoptale 8 tamines glabres, souds la corolle 4 carpelles lgrement souds, ovaire supre sec : follicule comprenant de nombreuses graines trs petites et prsentant des
Fruit
ornementations Indications : Racine: anti-diarrhique, feuille utilise comme cataplasme, extrait des feuilles contre les Infections Sexuellement Transmissibles (IST) Note : Plante dont lextrait est class comme agent immunostimulant.
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________
ANNEXE VIII
ANALYSE DE VARIANCE ET TEST DE NEWMAN KEULS ILes comparaisons de variances: Loi F de FICHER
Lanalyse de variance un facteur pour le dispositif compltement randomis est propose afin de tester, statistiquement, la diffrence significative existante entre des traitements. Ainsi, le test F de Ficher est utilis. Ce test est obtenu par lanalyse de variance une dimension dont le modle linaire scrit comme suit : x
ir
= + 1 +
ir
tel que
ir
~N (O,) V i,r. reprsente la rponse de la modalit i et 1

ir
leffet moyen de la modalit i et enfin variance gale .
lerreur exprimentale, qui suit la loi normale de
Le test dhypothse nulle, qui est labsence dun effet du facteur contrl, peut se formuler comme Ho = 1 = 0 Vi. Cette hypothse est accepte si la valeur de F obtenue est infrieure la valeur F lue dans les tables de Ficher k-1 et N-k degrs de liberts, dans le cas contraire, lHo est rejete. Le tableau de lanalyse de variance se construit comme suit:
Sources de variations Entre variantes du facteur contrl Variation rsiduelle Total Sommes des Carres des Ecarts (SCE) Degr de Liberts (ddl) Probabilit de retour
Carrs moyens (CM)
Test de Ficher (F)
SCE f = ni (xi. - x)2 SCE r = ni (xir -xi.)2 SCE t = ni (xir. - x)2
k-1 N-k N-1
CM f = SCE f / k-1 CM r = SCE r / N-k
F f = CM f / CM r
Source: DAGNELIE P, 1986 IILes comparaisons de moyennes : test de NEWMAN et KEULS au seuil de 5% A la suite dun test F significatif, (si F observ est infrieur au F lu dans la table de SNEDECOR, au seuil choisi) on compare les moyennes laide de test dont les hypothses sont les mmes que pour lanalyse de variance. La mthode de NEWMAN et KEULS est base sur la comparaison des amplitudes observes pour des groupes de 2,3, ...,p moyennes, avec lamplitude maximum attendue un niveau de signification donn. Pour effectuer cette comparaison, on doit calculer la plus petite amplitude significative relative des groupes de 2, 3, ...,p moyennes ( p.p.a.s. ). Le tableau de Newman et Keuls montre la fin les rsultats des moyennes compares par ordre et met en vidence de groupes homognes. On a toujours des chevauchements mais les conclusions sont sensiblement diffrentes de celles obtenues avec la plus petite diffrence significative . Le test F est ralis un niveau global LG = 0,05 (5%). Ce seuil est par dfinition la probabilit de trouver au moins une diffrence entre moyennes comme significative alors que les moyennes de toutes les populations ne sont pas diffrentes.
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________ IIIChoix du test
En ce qui concerne les comparaisons de variances, lorsque les effectifs des diffrents chantillons sont gaux ou que si lon voudrait comparer plusieurs variances, on peut utiliser le test de
BARTLETT. Ce test est trs sensibles la non normalit des populations, cest une mthode
approximative qui nest pas satisfaisante que si les effectifs ni des chantillons sont suffisamment grand (ni 4), et si le nombre dchantillons k nest pas trop lev par rapport aux effectifs ni. Il est noter que ce test nest pas applicable que lorsque lon dispose de vraies rptitions. Pour deux populations, le test de BARTLETT est quivalent au test F si les effectifs sont gaux. Pour les comparaisons des moyennes, si lon veut comparer deux moyennes, on peut utiliser le test t de STUDENT ou la comparaison de deux moyennes. Par contre, pour la comparaison de multiples moyennes, on a le test de NEWMAN et KEULS, le test de DUNCAN, la mthode de
DUNNETT (comparaison de p moyennes un tmoin), la mthode de GUPTA (recherche des
moyennes les plus leves), la mthode des contrastes (comparaisons orthogonales de moyennes) et la mthode de SCHEFFE (mthode des contrastes permettant de tester simultanment la signification de tous les contrastes). Dans le cas o les traitements jouent priori un rle symtrique, on peut utiliser la mthode de
NEWMAN et KEULS ou celle de DUNCAN, pour rechercher les moyennes les plus leves. En
revanche, si les traitements ne jouent pas priori un rle symtrique, on doit utiliser la mthode des contrastes, sous rserve que ceux-ci figurent dans le protocole exprimental, sinon lorsquils sont dfinis posteriori, on peut utiliser la mthode de SCHEFFE. Dans le cas o lon a tmoin, on peut utiliser le test de DUNNETT (PHILIPPEAU G, 1989).
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________
ANNEXE IX
Rsultats des tests statistiques sur Logiciel STAT ITCF, version 4
***** A N A L Y S E D E V A R I A N C E *****
CARACTERISTIQUES DU FICHIER : C:GRAIN TITRE : NACLO NOMBRE DOBSERVATIONS : 56 NOMBRE DE VARIABLES : 5
***** NO ET NOMS DES VARIABLES ***** 1. DET / 2.REPET / 3.PARCE / 4. GERM / 5. REG /
DISPOSITIF INITIAL DE L'ESSAI : RANDOMISATION TOTALE ==================================================== FACTEUR = 14 DETERGENT 1 = NACLO1 (T1 ) 4 = NACLO4 (T4 ) 5 = NACLO5 (T5 ) 8 = CACLO8 (T8 ) 9 = CACLO9 (T9 ) 12 = CACLO12 (T12) 13 = CACLO13 (T13) 4 REPETITIONS 1
2 = NACLO2 (T2 ) 6 = NACLO6 (T6 ) 10 = CACLO10 (T10) 14 = CACLO14 (T14)
3 = NACLO3 (T3 ) 7 = NACLO7 (T7 ) 11 = CACLO11 (T11)
DISPOSITIF ANALYSE : RANDOMISATION TOTALE ==================================================== FACTEUR = 14 DETERGENT 1 = NACLO1 (T1 ) 4 = NACLO4 (T4 ) 5 = NACLO5 (T5 ) 8 = CACLO8 (T8 ) 9 = CACLO9 (T9 ) 12 = CACLO12 (T12) 13 = CACLO13 (T13) 3 REPETITIONS 1
2 = NACLO2 (T2 ) 6 = NACLO6 (T6 ) 10 = CACLO10 (T10) 14 = CACLO14 (T14)
3 = NACLO3 (T3 ) 7 = NACLO7 (T7 ) 11 = CACLO11 (T11)
1 VARIABLE(S) A ANALYSER ==========================1re VARIABLE : (GERM) GE LISTE DES OBSERVATIONS ANALYSEES -------------------------------* = donne estime OBS. No 1 2 3 5 6 7 9 10 11 13 14 15 17 18 19 21 22 23 25 26 27 29 30 IDENT. No 11 12 13 21 22 23 31 32 33 41 42 43 51 52 53 61 62 63 71 72 73 81 82 PARC. No 101 403 801 102 404 802 103 501 803 104 502 804 201 503 901 202 504 902 203 601 903 204 602 F.1 T1 T1 T1 T2 T2 T2 T3 T3 T3 T4 T4 T4 T5 T5 T5 T6 T6 T6 T7 T7 T7 T8 T8 ------ VARIABLES GERM 0.00 1.00 0.50* 1.00 2.00 1.00 1.00 0.00 2.00 1.00 2.00 2.00 28.00 21.00 27.00 15.00 17.00 11.00 19.00 21.00 18.00 1.00 1.00* -----
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________
31 33 34 35 37 38 39 41 42 43 45 46 47 49 50 51 53 54 55 83 91 92 93 101 102 103 111 112 113 121 122 123 131 132 133 141 142 143 904 301 603 1001 302 604 1002 303 701 1003 304 702 1004 401 703 1101 402 704 1102 T8 T9 T9 T9 T10 T10 T10 T11 T11 T11 T12 T12 T12 T13 T13 T13 T14 T14 T14 1.00 0.50* 0.00 1.00 1.00 2.00 1.00 3.00 11.00 2.00 25.00 28.00 27.00 23.00 30.00 27.00 15.00 21.00 9.00
======================================= ANALYSE DE LA 1re VARIABLE : GE (GERM) ======================================= DONNEES ESTIMEES : -----------------1re Donne estime :
2e
3e
.5 Observation No 3 facteur 1 = DETERGENT, niveau rptition No 3 Donne estime : 1 Observation No 30 facteur 1 = DETERGENT, niveau rptition No 2 Donne estime : .5 Observation No 33 facteur 1 = DETERGENT, niveau rptition No 1 VARIABLE GERM : GE
= NACLO1
(T1)
= CACLO8
(T8)
= CACLO9
(T9)
HISTOGRAMME DES RESIDUS ======================= 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
I 12 I 13 I 22 I 31 I 33 I 42 I 43 I 61 I 11 81 I 21 82 I 23 83 I 32 91 I 41 93 I 71 102 I 52 73 122 51 I 63 92 123 53 I 113 111 101 133 62 112 I 143 131 121 103 141 72 132 142 I---------------------------------------1 4 -3.00 -4.50 -6.00 2 10 18 4 3.00 1.50 6.00 1 2 6.00 4.50 INTERVALLE : 1.50
EFFECTIFS BORNES -6.00
0.00 -1.50 MAXIMUM :
MINIMUM :
INDICES DE NORMALITE (coefficients de K.PEARSON) ------------------------------------------------SYMETRIE (valeur idale thorique = 0) : BETA 1 = APLATISSEMENT (valeur idale thorique = 3) : BETA 2 = RESIDUS SUSPECTS (mthode de GRUBBS) NEANT
0.01 4.60
PROBA = 0.7902 PROBA = 0.0258
-------------------------------------
___________________________________________________________________________
Annexe _________________________________________________________________________________
TABLEAU DES ECARTS-TYPES DES RESIDUS ==================================== ECARTS-TYPES FACTEUR 1 = DETERGENT ----------------------------F 1 : 1 (T1) 2 (T2) 3 (T3) 4 (T4) (T9) 10(T10) 11(T11) 12(T12) 0.50 0.58 1.00 0.58 0.50 0.58 4.93 1.53 13(T13) 14(T14) 3.51 6.00 KHI2 = 29.10 PROBA = 0.0039 ANALYSE DE VARIANCE =================== VAR.TOTALE VAR.FACTEUR 1 VAR.RESIDUELLE S.C.E. 4723.50 4516.50 207.00 DDL 38 13 25 CARRES MOYENS 124.30 347.42 8.28 TEST F 41.96 PROBA 0.0000 2.88 28.8% E.T. C.V.
5 (T5) 3.79
6 (T6) 3.06
7 (T7) 1.53
8 (T8) 0.00
TABLEAU DES MOYENNES ==================== MOYENNE GENERALE = 10.00 ---------------MOYENNES FACTEUR 1 = DETERGENT ------------------------F 1 : 1 (T1) 2 (T2) 3 (T3) (T9) 10(T10) 11(T11) 12(T12) 0.50 1.33 1.00 0.50 1.33 5.33 26.67 13(T13) 14(T14) 26.67 15.00 PUISSANCE DE L'ESSAI ==================== FACTEUR 1 : DETERGENT ---------------------------ECARTS en % V.Absolue 5.00% 0.50 10.00% 1.00 Moyennes observes test de NEWMAN-KEULS - seuil = 5% ================================= FACTEUR 1 : DETERGENT ---------------------------NOMBRE DE MOYENNES 9 10 11 VALEURS DES PPAS 7.96 8.14 8.30 NOMBRE DE MOYENNES VALEURS DES PPAS 2 12 4.84 8.44 13 8.57 14 8.69 5.85 6.46 6.90 7.24 7.52 7.75 3 4 5 6 7 8 RISQUE de 1ere ESPECE 5% 10% 20% PUISSANCE A PRIORI 5% 10% 20% 5% 11% 21% PUISSANCE A POSTERIORI 99% 99% 99%
4 (T4) 1.67
5 (T5) 25.33
6 (T6) 14.33
7 (T7) 19.33
8 (T8) 1.00
F1 13 12 5 7 14 6 11 4 10 2 8 3 1 9
MOYENNES 26.67 26.67 25.33 19.33 15.00 14.33 5.33 1.67 1.33 1.33 1.00 1.00 0.50 0.50
GROUPES A A A B B B C C C C C C C C
HOMOGENES
___________________________________________________________________________

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UNIVERSITE DANTANANARIVO ECOLE SUPERIEURE DES SCIENCES AGRONOMIQUES (ESSA) DEPARTEMENT DES EAUX ET FORETS FORMATION CONTINUE ET D.

E .A Session 2003 Promotion "RENIALA"

LISTE DES ANNEXES

III III IV VVI VII VIII IX-

Espces cultives ou domestiques Habitat Immunit

Substance immunostimulante Utilisation durable

une synthse bibliographique concernant le matriel dtude et les diffrentes techniques de

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

I .1.1 Description botanique et biologique du matriel dtude

en 1908, comporte 60 espces Madagascar (FRIEDMANN F, 1975). Kalanchoe synsepala

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Figure 1 : Morphologie gnrale du Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

I.1.1.3 Biologie florale a) Inflorescence

I.1.1.4 Phnologie de lespce

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Sofimbato Mongy vola

I.1.1.5 Mode de multiplication

I.1.1.6 Mode dadaptation cophysiologique: Mtabolisme C.A.M

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

C = - 11,15 (Origine chantillon CATAT) (KLUGE et al, 1991 in:

I.1.2 Ecologie I.1.2.1 Exigence cologique de la plante

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

I.1.2.2 Rpartitions gographiques et variabilit biologique de lespce

dans toute lle, grce des analyses

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Figure 2 : Les aires de rpartition de Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

I.1.2.3 Milieu dtude

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Tableau 2 : Les facteurs physiques et biologiques des milieux dtudes

Ambatokely Localisation S 1853,14 EO 4741,04

Antongona S 1856.42 EO 4716.99

Ambalavao S 215715 EO 464433

Ampanihy S 244180 EO 4441 52

Sud 656,28 mm 23,8C Tropical semi-aride Massif grseux Domaine sdimentaire

Sols ferralitiques facis humifre sous forts.

Sols sableux rouge facis humifre local

Principales formations climaciques et climatiques Principales formations dgrades

Fort dense sclorphylles

Foret ripicoles ou alluviale

Fourrs xrophiles dgrads

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

I.1.3.2 Proprit phytochimique

I.1.4 Statut de conservation des CRASSULACEAE, plante grasse de Madagascar

3% 1% 11 % 1% Source : Monographie de la Biodiversit, 1998

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

UICN Rare Rare Rare Rare

CITES Source : Monographie de la Biodiversit, 1998

I.1.5 Conservation ex situ de lespce

Gnralits sur Kalanchoe synsepala (BAKER)

Gnralits sur les techniques de culture in vitro

I.2 GENERALITES SUR LES TECHNIQUES DE CULTURE "in vitro"

I.2.1 Germination "in vitro"

I.2.2 Culture "in vitro"