1

FISIOLOGA, INSEMINACIN Y USO DE LA BIOTECNOLOGA EN REPRODUCCIN EQUINA 1.1 ANATOMIA REPRODUCTIVA DE LA YEGUA Dentro de las estructuras anatmicas que involucran a la yegua, se los tractos reproductivos caudal y craneal. Adems de los

mencionan

rganos que hacen parte de los tractos mencionados, hay otra serie de rganos que de una forma u otra participan en la actividad reproductiva como son el Hipotlamo, la Hipfisis, la Glndula Adrenal.

En esta revisin se har mencin detallada de estas estructuras anatmicas anteriormente mencionadas, con un enfoque tanto macro como microscpico para de este modo tener una mayor claridad de los eventos fisiolgicos que ocurren en la yegua como son el ciclo estral y la preez. Entendimiento que es fundamental para lograr desarrollar actividades de importancia en la reproduccin de las yeguas como lo son la Inseminacin Artificial, la transferencia de embriones, con ayuda de tcnicas modernas como lo son la ultrasonografa.

1.1.1 Tracto Reproductivo Caudal: Hacen parte de ste la vulva, el vestbulo y el cltoris. La vulva constituye el orificio externo a travs de una hendidura vulvar que es rodeada por dos labios pudendos los cuales son redondos y prominentes. Dicho orificio externo es de 12 a 15 cm de altura donde aproximadamente dos tercios de la vulva caen sobre el arco

isquitico.1 Cambios de conformacin del perin y su relacin con la vulva pueden ser de importancia clnica reproductiva, debido a que si su conformacin llegara a fallar, existe la posibilidad de causar anormalidades tales como entrada de diferentes cosas a la vagina como aire, orines, materia fecal etc., lo cual nos va a causar un sin numero de inconvenientes a la hora de realizar la preez de la yegua.

El cltoris se encuentra en una cavidad a nivel de la comisura ventral de la vulva. Este es expuesto en forma natural durante el celo o durante la miccin con eversin de los labios en un evento que se conoce como guio vulvar. Este se lleva a cabo por medio del msculo constrictor de la vulva, el cual se fusiona dorsalmente con el esfnter externo del ano, permitiendo la constriccin del orificio vulvar y elevando el cltoris. 2 La cavidad donde se encuentra se conoce como fosa del cltoris.

El vestbulo vaginal se encuentra separado de la propia vagina a travs de un pliegue que a menudo demarca la presencia del orificio uretral. Es de una longitud de aproximadamente 10 a 12 cm, los cuales van de los labios vulvares hasta el pliegue el anteriormente mencionado. ancho, Se el relaciona msculo dorsalmente con el recto y ventralmente con el suelo de la pelvis, lateralmente con ligamento sacrotuberal

DYCE KM, Sack WO Wensing CJG. Textbook of Veterinary Anatomy. Philadelphia: WB

Saunders, 1997: 505-580.

2

DYCE KM, Sack WO Wensing CJG. Textbook of Veterinary Anatomy. Philadelphia: WB Saunders, 1997: 505-580

semimembranoso y la arteria pudenda interna.3 La mucosa vestibular posee hileras de papilas a nivel de la pared ventral y laterales, correspondientes a las glndulas vestibulares.

1.1.2 Tracto Reproductivo Craneal: Este se encuentra conformado por la vagina, el cervix, el tero los oviductos y los ovarios.

La vagina tiene una longitud de entre 20 y 35 cm aproximadamente, la cual ocupa una posicin a nivel de la lnea media en la cavidad plvica y termina a nivel del inicio del cervix. Una de las caractersticas de la vagina es la ausencia de glndulas en su estructura. La unin del vestbulo y vagina es menos distendible que el resto de la cavidad, debido a la presencia del esfnter del mismo nombre.4

El cervix es corto, de 5 a 7 cm de longitud, posee una pared delgada de musculatura lisa la cual es rica en fibras elsticas lo cual contribuye al grado de tono dependiendo del estado reproductivo. El cervix se conforma por una serie de pliegues de mucosa de forma longitudinal, los cuales continan con los pliegues endometriales del cuerpo uterino. El frnix vaginal a travs de sus pliegues da una apariencia lobulada que continua con los pliegues

SISSON S, GROSSMAN JS. Anatoma de los Animales Domsticos. Barcelona: Salvat editores, 586-594.

1981:
4

MCKINNON AO, Voss JL. Equine Reproduction. , 1993: 5-19.

propios del cervix, mientras que a nivel del piso del frnix pliegue dorsal o ventral que constituye el frenillo.5

continua un

La ausencia de anillos a nivel del cuello uterino marca una diferencia con relacin a otras especies, haciendo que el acceso al lumen uterino por medio de la dilatacin digital es relativamente fcil. Las clulas productoras de moco del canal cervical producen grandes cantidades del mismo, posiblemente para compensar la falta de glndulas a nivel vaginal anteriormente mencionadas.6

El adecuado cierre o apertura del cuello dependiendo del estado en el cual se encuentre la yegua es de gran importancia en su potencial reproductivo, debido a que existen yeguas con incapacidad de cerrar el cervix despus de la ovulacin, causando de esta manera la posibilidad de contaminacin uterina en el momento en el cual el tero se esta preparando para el recibimiento del embrin para proceder a su anidacin. De otra parte existen tambin yeguas que no abren el cervix cuando estn en calor incapacitando la entrada del semen al tero.

El tero consiste de un cuerpo de entre 15 y 20 cms de longitud y dos cuernos de aproximadamente 15 a 25 cms cada uno y ubicados
5

SAMPER, JC. Equine Breeding Management and Artificial Insemination. 2000: 141-148.

GINTHER OJ. 1992 Reproductive Biology of the Mare: Basic and Applied Aspects, 642.

cranealmente al cuerpo. Los cuernos uterinos divergen del cuerpo uterino y se encuentran unidos por el ligamento intercornual a nivel de la unin corpocornual. Ellos no son enrollados como en los rumiantes. Se caracterizan por tener un borde dorsal ligeramente cncavo y el borde ventral es ligeramente convexo y libre.

El cuerpo uterino se encuentra parte en la cavidad pelviana y parte en la cavidad abdominal, su superficie dorsal se encuentra relacionada con el recto y otras partes del intestino, mientras que su superficie ventral se relaciona con la vejiga y alguna parte del intestino en forma inconstante.7

Externamente el tero se encuentra envuelto por peritoneo visceral que se conoce como perimetro, el cual continua con el ligamento suspensorio que se conoce como mesometro. A nivel de la pared del tero, la parte ms externa se conoce como la serosa, mas internamente se encuentra la muscular la cual se conforma por clulas lisas tanto longitudinales como circulares, las cuales junto a una capa vascular constituyen el miometro, continuando con la capa muscular ms externa sanguneos se conoce como el mesometrio.8 que junto a sus vasos

SAMPER, JC. 200 Equine Breeding Management and Artificial Insemination. , : 147-149.

GINTHER OJ. 1992 Reproductive Biology of the Mare: Basic and Applied Aspects, 654.

De otro lado el medio ambiente intrauterino consiste de glndulas rodeadas de tejido conectivo formado en pliegues longitudinales y cubierto por una mucosa que se conoce como endometrio. El lumen uterino se encuentra usualmente colapsado, pero se distiende con facilidad ante la presencia de aire o fluidos. Bajo ciertas condiciones hormonales el endometrio se puede encontrar edematoso. La alteracin de este sistema glandular puede tener una connotacin referente a la salud reproductiva de la yegua, pues deficiencias en la secrecin hormonal, hacen que la yegua no realice su ciclo completo, haciendo que los mecanismos de defensa se disminuyan, como lo es por ejemplo la yeguas que tienen incapacidad de de drenar el tero en el diestro, produciendo quistes uterinos que nos van a causar problemas para el futuro.

Los oviductos son tbulos tortuosos con una longitud entre 10 y 20 cm de longitud, los cuales poseen tres divisiones que se conocen como infundbulo, ampolla y el istmo.9

El infundbulo posee las fimbrias, estructuras irregulares con forma de dedos las cuales se presentan a lo largo del margen permitiendo que parte de ellas se encuentran adheridas al polo craneal del ovario y forman el polo craneal de la fosa de la ovulacin.

SENGER PL. Pathways to Pregnancy and Parturition. Washington State University Research &

Technology Park, 1997: 8-31.

La ampolla se encuentra aproximadamente a nivel central del oviducto y es el sitio donde por lo general se lleva a cabo la fertilizacin. Continua con el istmo que presenta una longitud similar al anterior y termina a nivel de la unin tero-tubal que es el sitio donde converge el oviducto en el cuerno uterino.10 El oviducto presenta en su estructura una capa serosa, dos capas de musculatura lisa, la ms externa longitudinal y la ms interna circular e igualmente una capa mucosa. La ampolla presenta pliegues altamente complejos los cuales se requieren para el evento de la fertilizacin.

La posicin de los ovarios es variable debido a que la extensin del mesovario les permite cierto margen de movimientos pasivos, siendo el izquierdo mas caudal que el derecho pero cercano al rin ipsilateral. El tamao vara de 4-8 cm de largo x 3-6 de ancho y 3-5 cm de alto. 11 Las superficies media y laterales del ovario estn cubiertas por peritoneo visceral que s continua con el mesovario y el cual contiene vasos paralelos prominentes de los vasos sanguneos ovricos. Igualmente se puede encontrar una cantidad variada de tejido a nivel de la serosa.

10

DYCE KM, Sack WO Wensing CJG. Textbook of Veterinary Anatomy. Philadelphia: WB

Saunders, 1997: 505-580.

11

SAMPER, JC. Equine Breeding Management and Artificial Insemination. Philadelphia: WB

Saunders, 2000: 141-148.

A nivel del polo caudal del ovario se encuentra el ligamento propio del mismo, el cual esta constituido por una banda de msculo liso dentro del ligamento ancho que se extiende hasta el extremo del cuerno uterino y se encuentra adherido al techo de la pelvis, Estos ligamentos son de importancia durante el diagnstico reproductivo,12 debido a que estos en el momento de la gestacin se alargan haciendo que los ovarios desciendan.

La estructura histolgica del ovario es particular, si se tiene en cuenta que la medula y la corteza se encuentran invertidas con respecto al las otras especies, siendo la medula la zona vascular a nivel superficial, mientras que la corteza donde se encuentran los folculos es interior.

De igual forma contiene la fosa de la ovulacin, que es el nico sitio por donde la yegua puede ovular por sus caractersticas de zona parenquimatosa alrededor del tejido conectivo colgeno y vascular..13

Otra de las caractersticas ovricas de la yegua es que el cuerpo lteo una vez formado no protruye del tejido ovrico, por tanto no es posible su palpacin rectal. nicamente es palpable el cuerpo hemorrgico que corresponde al cuerpo lteo en formacin.
12

MCKINNON AO, Voss JL. Equine Reproduction. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993: 5-19.

13

SENGER PL. Pathways to Pregnancy and Parturition. Washington State University Research &

Technology Park, 1997: 8-31.

En cuanto a la irrigacin del tero tenemos que las principales arterias son la uterina y la rama uterina de la arteria ovrica, que tiene un curso elstico en los ligamentos anchos; tambin existen ramas de la arteria pudenda interna. Las venas proceden del plexo pampiniforme y acompaan a las arterias. Los vasos linfticos son numerosos y van a los ndulos linfticos iliaco interno y lumbar. Los nervios derivan del simptico a travs de los plexos uterino y plvico. Los vasos y nervios de los ovarios constan de la arteria ovrico que es relativamente grande y elstica; alcanza el borde de insercin del ovario cuando pasa entre las capas del mesovario. Las venas son grandes y numerosas. Forman un plexo semejante al cordn espermtico. Los vasos linfticos pasan a los ndulos lumbares. Los nervios derivan del sistema simptico a travs de los plexos renal y abdominal artico.

1.2 FISIOLOGA DEL CICLO ESTRAL DE LA YEGUA

La actividad sexual de la yegua empieza con la pubertad la cual generalmente ocurre aproximadamente a los 18 meses. La madurez sexual por el contrario ocurre hacia los 3 aos de edad cuando las yeguas pueden ser generalmente introducidas al servicio. En el trpico la yegua se considera un animal polistrico no estacional. En pases de estaciones la estacin reproductiva ocurre de Abril a Octubre.

10

El ciclo estral es el periodo de tiempo que transcurre entre dos ovulaciones. Tiene una duracin de 19-22 das en yeguas y de alrededor de 25 das en ponies. La etapa de receptividad (estro) es de 3-7 das mientras que la etapa no receptiva tiene una duracin de 14-15 das (diestro). La duracin tanto del ciclo estral como del estro es muy variable entre yeguas pero tiende a ser constante dentro de la misma yegua.14 1.2.1 Endocrinologa: Las hormonas se definen clsicamente como substancias producidas por las glndulas endocrinas en una parte del cuerpo , para luego ser transportadas por la sangre o la linfa a otra parte del cuerpo donde modifican la actividad de rganos blanco especficos. Las hormonas son de muchos tipos y tiene una amplia gama de actividades. Las que regulan los procesos reproductivos se derivan primordialmente del hipotlamo, la hipfisis, gnadas y placenta. Aunque todas las hormonas son altamente especficas y selectivas en su accin, a menudo la respuesta particular de una hormona en un momento dado se modifica por la presencia o ausencia de otras hormonas. La endocrinologa de la yegua no ha sido tan estudiada como la del bovino, pero las funciones de las hormonas reproductivas son similares. La FSH estimula el crecimiento folicular mientras que la LH estimula la maduracin final del folculo, la maduracin del oocito, la ovulacin y la formacin y mantenimiento del cuerpo lteo. El pico de LH en la yegua es muy diferente al de la mayora de las especies debido a su larga vida media. La LH comienza a elevarse al inicio del celo y tiene su mximo pico dos das despus de la ovulacin.
14

PLANTE C 1999 Reproduction equine: la jument infertile. Med Vet 159-153

11

Los estrgenos, particularmente el 17

estradiol tiene efectos de

estrogenizacin en el tracto reproductivo. El cervix y el tero se relajan; el tero se torna edematoso y se hipertrofia la mucosa; la yegua manifiesta sntomas de celo y los niveles de progesterona se hallan por debajo de 1 ng/ml. La progesterona (P4 se eleva rpidamente despus de la ovulacin, alcanza un mximo nivel entre el quinto y sptimo da y declina nuevamente hacia el da 13-15 por accin de la PGF2 . La oxitocina juega un papel importante en el proceso de luteolisis y se mantiene elevada durante el estro.
15

Figura N 1 Edema 4 (tero Estrogenisado visto por ecografa transversal)

15

BERGFELT DR and Ginther OJ. Ovarian, uterine and embryo dynamics in horses versus ponies. Journal-of-Equine-Veterinary-Science. 1996; 16(2):66-72.

12

1.2.2 Desarrollo Folicular: El ovario es una glndula con funciones gametognicas y endocrinas, que se encuentran reguladas a travs del eje hipotlamo-hipfisis-ovario. Las neuronas peptinrgicas hipotalmicas del ncleo arcuato son las encargadas de la sntesis y secrecin pulstil de la hormona liberadora de gonadotropinas, la cual regula la sntesis y la liberacin de las gonadotropinas (hormonas estimulante del folculo [FSH] y luteinizante [LH]), que viajan a travs de la circulacin sistmica hasta unirse a sus receptores especficos en las gnadas femeninas. En el ovario, la FSH induce la maduracin folicular as como la biosntesis de estrgenos y progesterona, en tanto que la LH estimula la secrecin de andrgenos y la luteinizacin de los folculos posovulatorios.16

16

PARROT & SKINNER, Encyclopedia of Reproduction III: 483-490 (2004)

13

Anatmicamente, el ovario consiste en tres regiones: una corteza externa que contiene al epitelio germinal que origina a los folculos, una mdula central constituida por un estroma de tejido conectivo laxo y fibroso, y un hilum, que se encuentra alrededor de la zona de unin del ovario al mesovario, a travs del cual se insertan en la gnada las fibras nerviosas y los vasos sanguneos. El ovario se encuentra dividido funcionalmente en dos compartimentos: el intersticial, conformado por clulas del estroma y de la teca externa, y el folicular, que contiene el ovocito, las clulas de la granulosa y las clulas de la teca interna, que interaccionan entre s durante las diversas etapas de la maduracin folicular. De acuerdo a su organizacin estructural, pueden definirse cinco fases del desarrollo folicular: folculos primordiales, primarios, secundarios, terciarios y de Graff o preovulatorios, si bien es comn clasificar los folculos en preantrales (desde primordiales hasta secundarios) y antrales (desde terciarios hasta preovulatorios). Una vez llevada a cabo la ovulacin, la estructura folicular evoluciona hacia la formacin de un cuerpo lteo, considerado como la fase final de maduracin del folculo. Normalmente el desarrollo folicular en el ovario se mantiene detenido en la fase de folculos primordiales hasta que se inicia la pubertad. De aqu en adelante, y dependiendo de la especie estudiada, uno o ms folculos considerados dominantes lograrn terminar su desarrollo y sus ovocitos se liberarn al trmino de los correspondientes ciclos estrales. Los folculos que no llegan a terminar su desarrollo degenerarn, convirtindose en atrsicos17

17

VAN VOORHIS, Encyclopedia of Reproduction II: 376-389 (2004)

14

Diferenciacin ovrica durante el desarrollo Embrionario: En el embrin del mamfero, el rudimento gonadal puede diferenciarse indistintamente en un ovario o un testculo. Durante su etapa indiferenciada, la gnada se aprecia inicialmente como un engrosamiento del epitelio celmico y una evaginacin del mesnquima en el lado medial de la cresta mesonfrica. Conforme el tejido engrosado se distingue del mesonefros. Las clulas del epitelio celmico en la cresta genital proliferan y migran hacia el tejido mesenquimtico laxo adyacente en el reborde de la gnada indiferenciada, la cual ya es reconocible durante la semana 6 del desarrollo embrionario. En etapas posteriores del desarrollo de la hembra, los primeros sufrirn una regresin debido a la falta de andrgenos, mientras se darn origen al oviducto, tero y la parte superior de la vagina, sin que el desarrollo del tracto reproductivo de la hembra sea dependiente de los estrgenos.18 El nmero de clulas germinales primordiales es relativamente pequeo y stas proliferan durante su migracin, alcanzando un nmero final de 2500 a 5000 ovogonias en la gnada. Estas se organizan posteriormente en grupos y continan su proliferacin hasta entrar a la profase meitica, disponindose en la periferia de la corteza del futuro ovario.

18

KALTHOFF, Analysis of biological development, McGraw-Hill, NY, USA, 687-692 (2005)

15

Los ovocitos primarios no avanzan su divisin meitica ms all de la fase de diploteno I, completndola finalmente en la etapa pospuberal. Sin embargo, no todas las ovogonias entran en la meiosis simultneamente, por lo que las ovogonias y los ovocitos primarios pueden encontrarse presentes en los ovarios embrionarios al mismo tiempo. La proliferacin temprana de las ovogonias en el embrin establece su abundancia en las hembras adultas, si bien algunas clulas germinales degeneran durante el desarrollo embrionario. Desarrollo folicular en el ovario: Las ovogonias que han iniciado la meiosis comienzan a organizar a las clulas estromticas cercanas a ellas, las cuales darn origen a clulas de tipo escamoso (pregranulosa) que en nmero de 6 o 7 constituyen, junto con el ovocito, un folculo primordial. Posteriormente, estas clulas se diferencian hacia clulas de la granulosa (CG), que proliferan hasta formar una capa de clulas cuboidales que circundarn totalmente el ovocito, formando el folculo primario.(Ver Figura N 2)

16

Figura N 2 Corte transversal del ovario (25 X) donde se muestran las diferentes etapas del desarrollo de los folculos ovricos. 1.- Folculo primario, 2.- Folculo secundario, 3.-Folculo terciario, 4.- Folculo de Graff, 5.- Cuerpo lteo, Inserto: Folculo preovulatorio. a.- Clulas de la granulosa, b.- Clulas de la teca interna, c.- Clulas de la teca externa, d.- Ovocito, e.Corona radiada, f.- Antrum Hacia el final de esta etapa, el ovocito inicia la sntesis de las glucoprotenas que formarn la zona pelcida que terminar rodendolo. Ambas estirpes celulares inician el desarrollo de extensiones citoplsmicas que atraviesan la zona pelcida para mantener una comunicacin intercelular a travs de uniones de tipo gap; adems, se inicia una regulacin continua de tipo paracrino que involucra productos, tanto del ovocito como de las CG, que son secretados hacia el espacio intercelular.19 La transicin a folculo secundario se ha identificado como la etapa crtica de este proceso, ya que las CG proliferan hasta completar de 2 a 3 capas que rodean el ovocito, inicindose la formacin de la lmina basal y la diferenciacin de las clulas estromticas prximas a sta, para dar origen a las que sern las clulas de la teca (CT). Las CG expresan en esta etapa el receptor de la FSH y, en presencia de esta gonadotropina, incrementan su actividad estrognica, la cual ser fundamental para continuar con el desarrollo del folculo.

19

ALBERTINI Y COLS, Reproduction 121: 647-653 (2005)

17

A partir de esta etapa, la esteroidognesis folicular es dependiente de ambas gonadotropinas. As, la LH incrementa la esteroidognesis de nuevo a partir del colesterol en las CT, produciendo andrgenos (principalmente androstendiona) como producto final. Estos difunden a travs de la lmina basal y se convierten en estradiol en las CG por la accin del complejo enzimtico de la aromatasa, estimulado por la FSH.20 (Ver Figura N 3).

20

LOVEKAMP-SWAN & DAVIS, 2003 Environ. Health Perspect. 111: 139-145

18

Figura N 3 Esteroidognesis en clulas de la granulosa (CG) y de la teca (CT) en folculos antrales. SCC = C20,22 demolasa dependiente de cyt P450scc. 3HSD = 3hidroxiesteroide deshidrogenasa. 17-20 D = C17,20 desmolasa dependiente de cyt P450c17. 17HSD = 17hidroxiesteroide deshidrogenasa Adems de sus mltiples efectos sistmicos, los estrgenos actan en forma sinrgica con las gonadotropinas promoviendo el crecimiento ovrico, la formacin de los receptores de LH y FSH y la actividad misma de la aromatasa, lo que explicara el aumento preovulatorio de los niveles circulantes de estradiol. Algunos autores consideran que estas hormonas tambin podran desempear un papel central en el proceso de seleccin y dominancia folicular.21

Al inicio de la etapa de folculo terciario, la capa de CG que se encuentra rodeando directamente al ovocito dar origen a las clulas del cmulo, mientras que las clulas alejadas de ste comenzarn la formacin de los cuerpos de Colexnert, espacios que coalescern para dar origen al antrum y, a partir de este momento, los folculos antrales seguirn creciendo hasta alcanzar su mximo tamao, mientras que las CT gradualmente se irn diferenciando en una capa interna y otra externa.

21

RICHARDS, Endocrinology 142: 2184-2193 (2004)

19

Los

folculos

antrales

completamente

desarrollados

se

denominan

preovulatorios o de Graff. Las CG que los conforman se encuentran diferenciadas regionalmente, y en esta fase la presencia del pico preovulatorio de LH iniciar la rediferenciacin de las CG y las CT hacia clulas lteas, la cual se completar una vez que se haya liberado el ovocito del folculo. La etapa final del desarrollo folicular es la formacin del cuerpo lteo o amarillo. En ste, las clulas lteas producirn principalmente progesterona, aunque pueden sintetizar tambin progestinas 20- hidroxiladas o 5- reducidas, andrgenos y estrgenos. Este cuerpo lteo se considerar funcional mientras la produccin de progesterona se mantenga constante, lo que variar de acuerdo a cada especie. La disminucin de la esteroidognesis promover la etapa luteoltica o de regresin ltea, a menos que la presencia de la gonadotropina corinica de origen placentario pueda mantener o rescatar un cuerpo lteo en proceso de degeneracin.22

1.2.2.1 Factores que regulan el desarrollo folicular:I folculos preantrales, El proceso de foliculogensis es el resultado de la interaccin entre todos los componentes celulares que constituyen el folculo y en l intervienen una multitud de factores producidos ya sea por el ovocito, las clulas de la granulosa (CG) o las de la teca (CT), en distintos momentos y bajo el influjo
22

DEVOTO Y COLS, MOL. Cell. Endocrinol. 186: 137-141 (2004)

20

de diferentes factores autocrinos, paracrinos o endocrinos (Tabla 1). No slo es la foliculogensis el resultado de mltiples influencias, sino que es un proceso en el cual un mismo elemento de regulacin puede participar de manera diferente, dependiendo del estado de desarrollo, no nicamente del folculo en s, sino tambin de otros folculos previamente desarrollados dentro del ovario. Tabla 1 Factores involucrados en el desarrollo folicular temprano FACTOR ORIGEN Protena , Clulas somticas FUNCIN Migracin y proliferacin de clulas germinales Generacin de clulas germinales

BMP4 y Ectodermo BMP8b extraembrionario Conexina Ectodermo Generacin de clulas germinales 43 extraembrionario Figla o Fig Ovocito Coordinacin de genes estructurales que codifican la zona pelcida BMP15 Ovocito Diferenciacin y proliferacin celular (granulosa) GDF 9 Ovocito Diferenciacin y proliferacin celular (granulosa) bFGF Ovocito Estimulacin de mitosis y diferenciacin a clulas de la granulosa KL Clulas Promocin de la transicin folculo pregranulosa primordial-primario LIF Clulas Promocin de la transicin folculo pregranulosa primordial-primario Insulina Endocrino Promocin de la transicin folculo

21

primordial primario. Estimulacin de la esteroidognesis en clulas de la granulosa y teca Clulas de la Inhibicin del desarrollo de los folculos granulosa primordiales Clulas de la Regulacin del tamao de la poza del granulosa ovocito Clulas de la Mantenimiento del fenotipo celular y granulosa reclutamiento de la teca Clulas de la Proliferacin celular y estimulacin de la granulosa esteroidognesis (granulosa) Clulas de la teca Proliferacin celular y crecimiento folicular

AMH AhR CTGF Activina KGF

Durante el desarrollo embrionario, para que se inicie la migracin y proliferacin de las clulas germinales, los factores ms importantes parecen ser el producto polipeptdico del gen c.kit, un receptor de protooncogn sintetizado por las clulas somticas, y las protenas morfogenticas de hueso BMP4 y BMP8b, adems de la protena conexina-43, todas ellas producidas por el ectodermo extraembrionario, las cuales parecen ser esenciales para la generacin de las clulas germinales.22 Transicin de folculo primordial a primario: Estudios recientes han demostrado que es necesario que el ovocito, detenido en la fase de diploteno I, exprese cuanto menos un gen llamado Figla o Fig , que codifica un factor de transcripcin con estructura tipo hlice-giro-hlice, para lograr completar exitosamente la estructura de un folculo primario. Figla parece coordinar, a su vez, la expresin de los genes estructurales que codifican algunos

22

VAN VOORHIS BJ. Encyclopedia of Reproduction II: 376-38 (2004)

22

componentes de la zona pelcida y de uno o ms factores que contribuyen a la estructuracin de las clulas de la pregranulosa alrededor del ovocito desnudo, ya sea como elementos quimiotcticos o como molculas de adhesin. Se ha demostrado la existencia de varios factores que influyen directamente sobre la transicin de folculos primordiales a primarios, entre los que se encuentran el ligando kit (KL), el factor inhibidor de la leucemia (LIF), el factor de crecimiento bsico derivado de fibroblastos (bFGF) y la insulina.23 Algunos factores, como el KL y el LIF producidos por las clulas de la pregranulosa, promueven la transicin ms favorablemente en presencia de la insulina, para la que aparentemente existen receptores presentes en el ovocito, mientras que el bFGF es sintetizado por ste y acta sobre las clulas de la pregranulosa, favoreciendo la supervivencia de los folculos primarios, establecindose de esta forma un circuito de retroalimentacin entre ambos tipos celulares.24 Otros factores pueden influir de manera indirecta sobre la transicin de folculo primordial a primario a travs de las interacciones que se establecen entre folculos en desarrollo provenientes de ciclos estrales o menstruales anteriores y los folculos primordiales. Ejemplos de estos factores son la hormona anti-Mlleriana (AMH), producida por las CG plenamente diferenciadas, que acta inhibiendo el desarrollo de los folculos primordiales, as como el receptor de hidrocarburos de tipo arilo (AhR), que parece ser

23 24

EPPIG. Reproduction 122: 829-838,2005 KEZELE Y COLS. Mol. Cell. Endocrinol. 192: 37-43 , 2005

23

importante para regular el tamao de la poza de ovocitos, si bien su mecanismo de accin es hasta ahora desconocido.25 De acuerdo a lo anteriormente sealado, en las primeras fases del desarrollo folicular no parece necesitarse la presencia de gonadotropinas, ya que las seales de tipo paracrino entre el ovocito y las clulas circundantes son las responsables directas del inicio de la maduracin folicular. Transicin de folculo primario a secundario: Aunque los mecanismos necesarios para que los folculos prosigan su desarrollo no se comprenden bien, el ovocito juega claramente un papel clave en la maduracin folicular ms all de la etapa de folculo primario, presumiblemente a travs de la produccin de diversos factores implicados, principalmente, en la proliferacin de las CG ya diferenciadas, as como en el reclutamiento posterior de las CT. Algunos factores que se encuentran presentes en la transicin entre estas fases del desarrollo folicular son el bFGF, el factor de crecimiento y diferenciacin 9 (GDF9), la BMP15, el KL, el LIF, el factor de crecimiento derivado del tejido conjuntivo (CTGF), las activinas y el factor de crecimiento derivado de queratinocitos (KGF). Los tres primeros los sintetiza el ovocito, mientras que KL, LIF, CTGF y las activinas los producen las CG y el KGF las CT. En esta etapa, el bFGF actuara inicialmente estimulando la mitosis y posteriormente favoreciendo la diferenciacin final de la capa de CG que rodea al ovocito, una labor que parece ser reforzada tanto por el GDF9, como por el BMP15, si bien el fenmeno parecera ser ms complejo de lo
25

MARKSTRM Y COLS. Reproduction 123: 23-30 ,2004

24

que parece a simple vista.

26

Por otra parte, KL y LIF favoreceran ahora la

supervivencia del ovocito y su maduracin citoplasmtica, lo cual tendra como resultado la estimulacin de su crecimiento y desarrollo, mientras que el CTGF permitira el mantenimiento de los fenotipos celulares iniciales del folculo primario y podra contribuir al proceso del reclutamiento de las futuras CT, as como a su proliferacin.
27

Finalmente, las activinas y el KGF, quiz

junto con el bFGF y concentraciones relativamente bajas de estradiol, promoveran tambin el crecimiento y proliferacin de los folculos a travs de mecanismos an no bien definidos. Se ha propuesto un modelo que explicara la participacin de los factores producidos tanto por los ovocitos como por las CG en la promocin del crecimiento de los primeros, lo que les permitira alcanzar un tamao definido claramente para cada especie en particular. El KL producido por las CG continuara estimulando tanto el crecimiento del ovocito como la sntesis de sus productos reguladores, hasta que la concentracin de estos ltimos (particularmente del GDF9), actuando a travs de procesos de regulacin negativa, suprimiera la sntesis del primero, disminuyendo o deteniendo el crecimiento del ovocito. Cabe sealar que, si bien este modelo parecera funcionar en folculos preantrales, la presencia de gonadotropinas podra alterar este equilibrio dinmico.28 Como resultado de estos eventos, hacia el final de esta transicin, las clulas del folculo comenzarn a expresar todas sus caractersticas fenotpicas, que
26

FINDLAY Y COLS. MOL. Cell. Endocrinol. 191: 35-42 , 2004

27 28

HARLOW & HILLIER. Mol. Cell. Endocrinol. 187: 23-27 ,2004 RICHARDS, Endocrinology 142: 2184-2193 (2004)

25

las prepararn para responder a los acontecimientos finales del desarrollo folicular, ahora dependientes completamente de las gonadotropinas circulantes. 1.2.2.2 Angiognesis en el desarrollo folicular: Los folculos primordiales no poseen una red vascular propia, la cual puede observarse ms tarde en los folculos en desarrollo. En estos ltimos, que se presentan despus de la pubertad, el desarrollo de una red vascular incipiente puede ser observado en la teca de los folculos preantrales.
29

La densidad de esta red vascular

crece con la formacin del antro folicular pero se mantiene exclusivamente en la teca, la cual por este motivo ha sido llamada cubierta vascular del folculo. Esta cubierta vascular est constituida por dos redes vasculares concntricas en las tecas externa e interna. Los vasos no penetran la membrana basal que separa la teca de la capa de clulas de la granulosa que permanece avascular. Particularmente el crecimiento de la red de capilares en la teca interna coincide con el periodo de crecimiento rpido y la diferenciacin del folculo.30 Esta observacin ha llevado a especular que el establecimiento de una red vascular adecuada en la parte ms prxima a la membrana basal que permita la rpida difusin de oxgeno y nutrientes hacia la capa de clulas de la granulosa es indispensable para el desarrollo folicular normal y puede estar relacionado con el mecanismo de seleccin del (de los) folculo(s) dominante(s), (p.ej; los folculos que son destinados a ovular). A su vez, el insuficiente desarrollo de esta red vascular interna, sin

29

. SUZUKI T, SASANO H, TAKAYA R, FUKAYA T, YAJIMA A, NAGURA H. Cyclic changes of vasculature and vascular phenotypes in normal ovaries. Reprod 1998; 13: 953-9.
30

. RICHARDS JS. Maturation of ovarian follicles: actions and interactions of pituitary and ovarian

26

modificacin notable del resto de la circulacin tecal, parece actuar como disparador de la atresia de los dems folculos en desarrollo. La regulacin hormonal del desarrollo y la maduracin folicular debe estar relacionada con los procesos angiognicos. De los factores endocrinos presentes durante estos procesos, los estrgenos parecen tener una accin determinante.4 Los estrgenos inducen activamente la angiognesis in vivo. El 17-estradiol estimula la proliferacin y migracin de las clulas endoteliales y promueve, in vitro, la formacin de tubos capilares no slo en el tejido ovrico sino en varios otros tipos de tejidos. Por el contrario los antiestrgenos, tanto in vivo como in vitro, inhiben especficamente la movilidad endotelial inducida por el VEGF y por el FGF-2. La expresin del VEGF durante el ciclo estral sugiere un papel importante de este factor en el crecimiento y maduracin de los folculos antrales y en el desarrollo, mantenimiento y regresin del cuerpo lteo. En el ovario de los primates, el RNAm del VEGF, y por lo tanto la protena misma, estn ausentes en las clulas de la granulosa de los folculos primordiales y primarios y presentes en las clulas de la teca y, ocasionalmente, en las clulas del cummulus que rodean a los ovocitos en los folculos preovulatorios. Durante la foliculogensis, fundamentalmente durante los estadios preantrales se ha determinado la presencia del VEGF por tcnicas de tincin inmunohistoqumica en las tecas.31 Las clulas de la teca interna del folculo en desarrollo, se tien intensamente con anticuerpos contra el factor de crecimiento del endotelio
31

SUZUKI T, 1998 SASANO H, TAKAYA R, FUKAYA T, YAJIMA A, NAGURA H.; 13: 953-9.

27

vascular. Esta tincin es particularmente notable en el folculo dominante. En contraste, la tincin inmunohistoqumica de las clulas de la granulosa es dbil en los folculos pequeos, y se hace notable slo en los preovulatorios. Esto sugiere que la secrecin paracrina del factor de crecimiento del endotelio vascular por las clulas de la teca interna y de la granulosa puede ser esencial para la angiognesis durante las fases finales del desarrollo folicular y necesario probablemente en preparacin para la luteognesis. En folculos atrsicos el factor de crecimiento del endotelio vascular no es observable ni en las clulas de la granulosa ni en las clulas de la teca. Durante el crecimiento folicular, el folculo dominante desarrolla un complejo vascular de redes infiltrado en la capa de la teca.32 Debe sealarse que en los ltimos aos se ha demostrado que las clulas de la granulosa son las que activamente producen VEGF durante el desarrollo folicular inducido por la aplicacin de gonadotropinas,33 mientras que la produccin de este factor de crecimiento por las clulas de la teca no se modifica por el estmulo de estas hormonas. Estos autores han demostrado que, durante el desarrollo folicular, las clulas de la granulosa son los mayores productores de VEGF lo cual puede demostrarse tanto por la determinacin del RNAm encargado de codificar su produccin, como por la determinacin directa de la sntesis in vitro de este factor. Es posible que la sntesis de VEGF en las clulas de la teca parezca inferior debido a que es
32

. RICHARDS JS. 1980 Maturation of ovarian follicles: actions and interactions of pituitary and ovarian hormones on follicular cell diferentiation. 60: 51-89.
33

. BARBONI B, TURRIANI M, GALEATI G, SPINACI M, BACI ML, FORNI M, MATTIOLI M. 2000 Vascular endothelial growth factor production in growing pig antral follicles. 63: 858-64.

28

fcilmente arrastrado por la circulacin, mientras que el producido por las clulas de la granulosa tiende a acumularse en el lquido folicular. Tambin es posible aceptar que el VEGF producido en el interior del folculo bajo la accin de las gonadotropinas sea utilizado, sobre todo en las fases finales del crecimiento folicular, como un factor paracrino que difunde a travs de la membrana basal del folculo para estimular, en las tecas, la formacin de las capas vasculares internas, prximas a la membrana basal, que parecen ser determinantes en la fisiologa folicular. Un hecho que apoya esta ltima posibilidad es que la presencia de receptores a FSH es particularmente notable en las clulas de la granulosa en este tipo de folculos.34 En el folculo dominante se produce un incremento importante en la red vascular ms prxima a la membrana basal que parecera depender de la difusin de VEGF a partir de la granulosa. La escasa formacin, o la desaparicin de esta red vascular interna es uno de los signos ms tempranos de atresia folicular. Esto permite concluir que el suministro vascular tiene un papel crtico no slo en la seleccin del folculo dominante destinado a la ovulacin, sino tambin de los folculos que debern terminar su desarrollo en la atresia. Debe dejarse bien claro que en el momento actual ninguno de los cambios vasculares y/o endocrinolgicos conocidos puede considerarse, todava, como el mecanismo molecular preciso que conduce a la seleccin del folculo dominante. El VEGF tiene un papel importante en la regulacin del pO2 intrafolicular y a travs de este parmetro en la
34

RICHARDS JS. Maturation of ovarian follicles: actions and interactions of pituitary and ovarian hormones on follicular cell diferentiation. Physiology Rev 1980; 60: 51-89.

29

determinacin del desarrollo folicular y, tal vez, en el establecimiento del (de los) folculo(s) dominante(s).

1.2.3 Cuerpo lteo: Despus de la ovulacin el cuerpo luteo se diferencia por completo como una glndula tpicamente endocrina, que secreta progesterona, la hormona esteroide que secreta el cuerpo luteo tiene varias funciones: a. prepara el endometrio para la implantacin, b. Permite que se implante el blastocito, c. mantiene la implantacin despus de la gestacin. La duracin de la vida til del cuerpo luteo depende primordialmente del desarrollo del embrin. Despus de la implantacin el cuerpo luteo sufre un aumento considerable de tamao y continua sintetizando y secretando hormonas esteroides (cuerpo luteo de la gestacin). En la yegua despus de la ovulacin el folculo se llena de sangre y se denomina cuerpo hemorrgico (Ver Figura N. 4), el cual se caracteriza por ser esponjoso y es muy variable en tamao. En 4-10 das el tamao va disminuyendo progresivamente hasta que se hace indetectable.

30

Figura N 4 Ecopgrafa del Cuerpo hemorrgico (CH)

Una yegua en diestro presenta al examen clnico el tero y cervix firmes, sin contenido. Los ovarios en general no presentan folculos de ms de 30mm. El cuello del tero se encuentra alto, plido y cerrado al examen vaginoscpico. La yegua tampoco manifiesta signos de celo. El examen ecogrfico el tero es homogneo.35 1.2.4 Dinmica folicular: En yeguas que ciclan normalmente, ocurren dos oleadas de FSH, 20 y 11 das antes de la ovulacin. Ambas concentraciones de FSH Y LH se elevan hacia el momento de la ovulacin. Las oleadas de FSH y LH causan el desarrollo de los folculos de menos de 2mm de dimetro a travs de la ovulacin. La oleada de FSH al final del estro y al inicio del diestro pude ser importante para el desarrollo subsecuente de los folculos destinados a ovular de 10 a 13 das despus. El ovario de las yeguas es menos sensible a la FSH que el de la vaca, borrega y cabra. La administracin de HCG acorta el estro y acelera la ovulacin de manera ms exacta con el apareamiento.36 La regulacin de las secreciones de LH involucra dos mecanismos: 1. Un componente hipofisiario del sistema nervioso central responsable del ciclo circarnual basal de la liberacin de LH sincronizado con un parmetro
35

36

. KING M. 2000 Mares which fail to show estrus.. 39-47. MCKINNON AO, Voss JL. Equine Reproduction. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993: 5-19.

31

ambiental posiblemente fotoperiodico e independiente de las influencias ovricas. 2. Un componente ovrico esteroidal que modifica el ritmo primario de LH durante la temporada de crianza. En las yeguas ovariectomizadas, las concentraciones de LH siguen su patrn estacional con concentraciones bsales bajas en el invierno y altas en el verano. Los cambios cclicos en las concentraciones de LH durante la temporada de crianza parecen ser el resultado de la modulacin de las concentraciones bsales elevadas de LH y los esteroides ovricos. Los niveles de LH aumentan para el inicio del estro, alcanzando su mximo, uno o dos das despus de la ovulacin. Esta elevacin de LH puede estimular la moderacin de los folculos a travs del estro. Hay una relacin inversa entre la progesterona y los niveles de LH, que sugiere una retroalimentacin negativa, pero no hay relacin entre las concentraciones de FSH y progesterona. Los niveles de LH muestran una elevacin prolongada durante el estro que continua despus de la ovulacin. No se observa una disminucin significativa en los niveles mximos hacia el tercer da despus de la ovulacin; a partir de este momento los niveles continan declinando hasta alcanzar los valores del diestro. El patrn de LH plasmtico en la yegua difiere delas otras especies y es posible que la persistencia de concentraciones elevadas de LH de cmo resultado una larga vida media de la LH endgena. Esto a su vez puede explicar el numero

32

relativamente grande de ovulaciones secundarias detectadas en muchos ciclos estrales.37 Parece se que se puede sensibilizar a la LH al control de la retroalimentacin de progesterona de manera que los niveles no empiecen a elevarse hasta despus que el cuerpo luteo haya entrado en regresin completamente. Por otro lado los niveles de progesterona circulantes elevados no parecen constituir un control efectivo de retroalimentacin una vez que empieza la liberacin de LH. En ausencia de ovulacin, con o sin crecimiento folicular, hay perodos prolongados bajos de niveles de progesterona. La aplicacin de esta durante la mitad del ciclo impide el estro y la ovulacin. Ondas Foliculares: En la yegua tambin se reportan ondas de desarrollo folicular. Algunas yeguas presentan dos ondas mientras que la mayora de ellas presenta una onda que culmina con la ovulacin. Los folculos crecen pero en forma similar hasta siete das antes de la ovulacin. A este tiempo uno de ellos sobresale ocasionando atresia del resto de folculos. Al inicio del celo los folculos alcanzan un tamao de 20 a 40mm y crecen a una tasa de alrededor de 3mm hasta alcanza su tamao ovulatorio que varia de 35 a 50mm. La yegua no presenta un patrn bien definido de crecimiento folicular, ya que un pequeo grupo de folculos se desarrolla durante el fin del diestro, uno de los cuales crece diferencialmente y que madura y se ovla durante el estro. Mientras tanto los folculos restantes pueden continuar desarrollndose, uno
37

BOLLWEIN H, Braun J. Follicular dynamics in mares treated with hCG for induction of ovulation.

Tierarztliche Praxis. Ausgabe G, Grosstiere/Nutztiere 1999; 27(1):47-51.

33

o mas pueden ovularse durante la fase ltea inicial, y los otros entrar en regresin sin ovularsen.38Este patrn de crecimiento folicular causa una elevada incidencia de ovulaciones mltiples. Los folculos preovulatorios aumentan de 3 a 6 cms los das seis y uno previo a la ovulacin, y justo antes de la ovulacin miden de 3 a 6 cms de dimetro. Rara vez puede ocurrir la ovulacin de folculos de menos de 2 cm de dimetro. Unos pocos folculos anovulatorios desarrollan hasta 10 cms de dimetro, y persisten hasta dos meses y despus entran en regresin. Ellos no afectan la duracin del estro ni inhiben la ovulacin. Algunos folculos se reblandecen y despus se vuelven turgentes de nuevo antes de la ovulacin, mientras que otros permanecen turgentes durante toda ella. La palpacin del ovario justo antes y despus de la ovulacin ocasionalmente provoca dolor. A la mitad de los perodos estrales dos o ms folculos, adems del que se va a ovular, tienen mas de 25mm de dimetro y son palpables.( Ver Figura N 5) La mitad de estos entra en regresin antes de la ovulacin y el resto despus de ella.39

38

BOLLWEIN H, Braun J. Follicular dynamics in mares treated with hCG for induction of ovulation.

Tierarztliche Praxis. Ausgabe G, Grosstiere/Nutztiere 1999; 27(1):47-51.

39

GINTHER OJ, Pierson RA: Ultrasonic Anatomy of equine ovaries. Theriogenology 21:471-483,

1984.

34

Figura N 5 Folculo de 45 mm (prximo a ovular) La ovulacin que ocurre durante la fase ltea del ciclo estral no se acompae de estro y puede causar confusin durante el examen rectal. Estas ovulaciones no afectan las concentraciones plasmticas de progesterona o de cualquiera de las otras caractersticas del ciclo estral. La ovulacin ocurre por accin de la LH. En la yegua se reportan ms ovulaciones por el ovario izquierdo las cuales ocurren a nivel de la fosa de la ovulacin. El 80% de las ovulaciones ocurren 24 a 48h antes de que finalice el celo. La mayora de las ovulaciones ocurre durante horas de la noche (76%). Sin embargo, otros autores no concuerdan con esta afirmacin (55% durante el da).40 La conclusin es que no es posible utilizar en forma confiable la duracin del celo, ni el tamao del folculo como predictores de la ovulacin. Tampoco es confiable basar la cercana de la ovulacin en la firmeza del folculo. Sin embargo combinar todas estas caractersticas mas
40

BERGFELT DR 1996 and Ginther OJ. Ovarian, uterine and embryo dynamics in horses versus ponies. Journal-; 16(2):66-72.

35

un adecuado conocimiento de celos anteriores es til en predecir la ovulacin. Existen ciertas variaciones en cuanto al desarrollo folicular y la ovulacin: - Ovulaciones Dobles: Al rededor del 25% de las yeguas presentan ovulaciones dobles; la segunda ovulacin ocurre entre cero a cinco das de la primera y pueden desencadenar en gemelos que deben ser diagnosticados lo ms tempranamente posible para evitar abortos tardos. La incidencia vara entre razas. (Ver Figura N 6 - 7).

Figura N 6 Preez doble de 14 das con un da de diferencia

36

Figura N 7 Mellizos de 35 das (adheridos entre si)

- Ovulacin Diestral: Otra entidad comn es la conocida como ovulacin diestral. Dichas ovulaciones ocurren durante el diestro tardo (> da 11) cuando la progesterona se halla elevada. En estos casos, un nuevo cuerpo lteo se forma y el ciclo estral se prolonga debido a que el nuevo cuerpo lteo no es sensible la PG al momento de la luteolisis del anterior. Esta es la causa ms comn de ciclicidad irregular en yeguas. Este fenmeno tambin explica porque algunas yeguas no responden a la PG exgena sabindose que estn en diestro. En un estudio se encontr una incidencia del 24% en ovulaciones diestrales. Los ciclos en estas yeguas se extendieron en un rango de 35-90 das.41

. LOFSTEDT RM and Patel JH. 1990 Evaluation of the ability of altrenogest to control theequine
1

estrous cycle. Journal- 194(3):361-364.

37

- Celo Silente: El anestro posparto no es frecuente en la yegua. Sin embargo las yeguas paridas tienden a no presentar signos de celo debido a la presencia del potro. En estos casos es importante hacer un seguimiento cercano de la yegua para lograr detectar las ovulaciones silentes. - Celos Anovulatorios: Se presentan durante el periodo de transicin estacional y se puede presentar en algunas yeguas importadas. - Anestro: Es mas frecuentemente debido a una fase luteal prolongada que a una inactividad ovrica. Dentro de las causas se encuentran las ovulaciones en diestro, la preez, la mortalidad embrionaria o fetal despus del da 13-14 y pimetra. El anestro posparto por inactividad ovrica esta relacionado con mala condicin corporal.42 1.2.5 Deteccin de celo: A las yeguas se les debe estimular diariamente el garaon en un prado es especial para la estimulacin. El recelo es la forma ms adecuada para detectar una yegua en celo. Se requiere de la presencia del garan aunque puede ser riesgoso. Otras formas incluyen el uso de ponies enteros o de hembras androgenizadas (propionato de testosterona 150mg q/48h por 20d y despus cada 10 das o undecilinato de boldenona 500mg cada 1-2 semanas). Ninguno de estos casos supera el uso del garan y en muchos casos se deben ensayar varios animales hasta lograr uno que si sea adecuado. Se reportan tasas de deteccin del 30-50%. Es importante recelar la yegua en forma individual pues las tasa de deteccin en

42

PYCOCK JF.2003 Early embryonic death. The Essential Horse. 333.

38

grupo son bajas (50-60%). EL recelador debe tener acceso al rea perineal y se le debe permitir entrar en contacto con la yegua para as estimular las manifestaciones de celo. 1.2.4.1 Signos de celo: Los signos de celo son variables y se requiere experiencia y conocimiento de las yeguas para interpretar su estado. El comportamiento estral vara en las yeguas dependiendo del garan que se utilice. Los sntomas ms comunes son la receptividad del macho, postura, miccin frecuente, guio vulvar, elevacin de la cola. Si la yegua no est receptiva se muestra nerviosa, orejas dirigidas hacia atrs, agresiva, muerde, patea y no manifiesta ninguno de los signos de celo anteriores. Es importante anotar que hay yeguas que no manifiestan celo a pesar de estarlo particularmente si estn paridas, igualmente hay yeguas que muestran signos de celo sin estarlo.43 Tambin hay yeguas que varan la intensidad de los sntomas del celo durante el mismo celo. A la palpacin rectal el tero se halla flcido, el cervix est relajado, descendiendo hacia el piso de la vagina y edematoso. En los ovarios se halla uno o dos folculos de ms de 30mm de dimetro y la yegua muestra signos de receptividad. Con la ecografa el tero se muestra edematoso.44 1.2.6 Frmacos Utilizados en la Manipulacin del Ciclo Estral: Es posible sincronizar el momento del estro y al ovulacin manipulando el ciclo estral, mediante la aplicacin de hormonas exgenas. Los objetivos de los

SQUIRES EL 2001. Estrous detection. In: Equine Reproduction. McKinnon and Voss Ed.:186-194.
4

PERKINS N.1996 Equine reproductive ultrasonography. , No. 172, 129-146;.

39

programas de sincronizacin de estro son los siguientes: 1. tener la posibilidad de predecir el da y el momento en que la hembra esta lista para aparearse,2. obtener fertilidad normal de estro controlado. Prostaglandina: Ocasiona luteolisis en tres das y la ovulacin se presenta en 7-10 das. Si existe un folculo dominante al momento de la inyeccin la yegua puede ovular rpidamente (en menos de 48h) y el celo no se manifiesta. La PG acta sobre cuerpos lteos de ms de cinco das de edad. Se pueden aplicar dos inyecciones de PG con 14 das de intervalo y el celo se presenta en seis das en un 77-92% de los animales.45(Ver Figura N 8)

Figura N 8 Presentacin comercia prostaglandina f2alfa

PERKINS, N. R.1999 Equine reproductive pharmacology. Dec; 15(3):687-704.

40

Gonadotropina Corinica: Induce la ovulacin en 36-40h (2000-3000 UI IV/IM) cuando el folculo esta estrognicamente activo (generalmente mas de 35mm). GnRH y Anlogos: Implante de Deslorelina. SC. Induce la ovulacin en 36-40h cuando el folculo esta estrognicamente activo (generalmente mas de 35mm).46 Progestgenos: Progesterona inyectada diariamente (150-300mg) y Altrenogest (0.0044mg/kg/d) PO. El tratamiento se realiza por 10-18 das. Y al detener el tratamiento la yegua presenta celo en aproximadamente 3 das. Tambin se puede incluir junto con la P4 inyecciones de estradiol (10mg/d) para mejorar el porcentaje de animales que presentan estro (alrededor del 75%). Si el tratamiento solo se realiza por 10 das se debe inyectar PG el da que se termina el tratamiento de P4 para inducir luteolisis.47

2. BIOTCNICAS APLICADAS EN REPRODUCCIN EQUINA Diferente a lo que ocurre en bovinos en donde varias biotcnicas aplicadas han sido utilizadas como suceso a nivel de campo ,la aplicacin de estas

ROSSDALE PD 1998 and Lambrecht P. Comparison of the interval between administration of hCG or GnRH implant and ovulation in oestrous mares. 10(2):76-79.
7

WEBER, J. A.; 2001 Causey, R. C., and Emmans, E. E. Induction of luteolysis in

41

mismas tcnicas en equinos ha presentado resultados insatisfactorios imposibilitando el uso en una larga escala para la industria equina. Por el contrario otras biotcnicas ms modernas utilizadas a gran escala en bovinos como lo es la fertilizacin in vitro a arrojado buenos resultados en la aplicacin comercial. 2.1 Superovulacin en Yeguas: La Superovulacin es otro obstculo que ha de ser vencido por la ciencia al respecto del desenvolvimiento de tratamientos hormonales que permitan la induccin de Superovulacin en yeguas. La tcnica de transferencia de embriones esta plenamente difundida en la industria equina, siendo Brasil el pas que ms utiliza esta tcnica en el mundo, en donde cerca de 4000 Transferencias de Embriones son realizadas anualmente. Con todo un protocolo de Superovulacin se ha permitido la obtencin de ms de una dosis de embriones por yegua donadora. Los tratamientos de hormonas son rutinariamente utilizados en bovinos como FSH de origen suino. O el nico compuesto que regularmente induce una respuesta superovulatoria en yeguas es Extrato Pituitario Equino (EPE). En protocolos propuestos con el uso de EPE en dos aplicaciones da se obtiene una mejora significativa respecto a la Superovulacin, al contrario de tratamientos aplicados una vez al da. Se obtiene en este estudio una medida de 7 ovulaciones por yegua con 3.0 embriones recuperados en medida que el tratamiento se realice dos veces al da, contra 2 ovulaciones y 1.6 embriones recuperados en un tratamiento de una vez al da.48 En estudios
48

ALVARENGA MA, Papa FO, Buratini Jnior,. The effect of breeds spermatic paramenters over equine semen frezability in : symposium on stallion Semen, Amesfort Anais, 1996, p,82

42

subsecuentes se observa que dosis decrecientes de EPE permiten un menor indice de recuperacin embrionaria49.Se acredita que las altas tasas de LH no EPE pueden estar relacionadas con bajas tasas de Recuperacin Embrionaria. Se realiz un estudio no publicado para valorar la respuesta superovulatoria y consecuentemente el ndice de recuperacin de embriones en yeguas tratadas con FSH equino purificado. Se utilizaron 14 yeguas, estos animales fueron monitoreados a travs de exmenes ultrasongraficos para deteccin de la ovulacin (DO). Despus de 7 das (D7) se administra una dosis de PGF2 para induccin de luteolisis. Los mismos animales se utilizan como control en un ciclo anterior de tratamiento. Estos animales son tratados con FSH equino purificado (12 Mg., va intramuscular, 2 veces al da), a partir del D7 el tratamiento se interrumpe cuando por lo menos la mitad de los folculos en desenvolvimiento miden 35mm de dimetro. En este momento se aplica 300 UI de hCG y se realiza la 1 inseminacin repitiendo diariamente antes de la ltima ovulacin. Los animales se tratan con FSH equino purificado por un periodo mximo de 8 das. La colecta de embriones se realiza en el 8 da despus de la ovulacin. Se observan medidas de 1.0 4.0 ovulaciones/yegua (P<0.05) y 0.6 2.0 embriones / yegua (P<0.05) para los grupos 1 y 2 respectivamente. Todos los embriones recuperados se

49

CARMO, Comparacao entre doses constants e descrecentes de Extrato de pituitaria equina na inducao de supervulacao em eguas, 2003,p,156

43

clasifican como viables. Los resultados de este trabajo permiten concluir que el FSH equino purificado es capaz de promover un aumento en el nmero de ovulaciones y en el nmero de embriones recuperados por yegua, cuando es comparado con un grupo no tratado. Se puede utilizar para aumentar la eficiencia y rentabilidad de programas de Transferencia de Embriones Equinos. 2.2 Produccin In Vitro de Embriones: Los sucesos de produccin in vitro de embriones dependen de una serie de factores como: Disponibilidad de ovocitos inmaduros saludables, mtodos de maduracin in vitro y capacitacin espermtica eficiente en condiciones ptimas de cultivo. Los ndices de sucesos de etapas individuales que envuelven la produccin in vitro de embriones en equinos permiten la utilizacin de tcnicas en protocolos de rutina, como acontece en los bovinos. Los nicos potros nacidos de procedimientos in vitro han sido originados de fertilizacin de un ovocito madurado in vivo con semen equino capacitado con Ca++ ionoforo A2318750 y la inyeccin espermatica intracitoplasmatica de un espermatozoide en ovocitos equinos madurados in vitro51. Los cambios que ocurren en el ovocito en preparacin para la fertilizacin son llamados de maduracin ovocitaria y consisten en la maduracin nuclear y citoplasmtica. In vivo, la maduracin es un proceso que coincide con el desenvolvimiento folicular y el progreso de la meiosis. Informaciones sobre la endocrinologa y
50

PALMER E, Magistrini M, Bezard J, Duchamp G. 1990. Gestegatin apres fecondatin in vitro dans`espece equine. C R Acad, Sci, Paris, p, 310: 71-4
51

Opcit 20

44

morfologa del ovocito equino en el final de la maduracin en el interior del folculo es bastante restringida, y estudios correlacionando las modificaciones morfolgicas que ocurren durante la maduracin nuclear con la endocrinologa del fluido folicular son raros. Un mtodo de capacitacin espermatica y reaccin acrosomal que fortalece los mejores resultados en equinos es un tratamiento de 2 espermatozoides con calcio ionoforo A23187 con un 33% de fertilidad.52El uso de cafena o heparina en la capacitacin espermatica no arrojan resultados en mejora con los ndices de fertilizacin.53La cuestin de cuanto espermatozoide equino es excepcional en sus necesidades para estos agentes capacitantes permanece abierta. Las condiciones para maduracin in vivo del ovocito equino son diferentes a las observadas en otros animales domsticos; no ocurre un pico preovulatorio de LH, ms si un aumento progresivo de los niveles de este, lo cual demora varios das, presentando concentraciones mximas un da pos ovulacin54. Las condiciones para la maduracin in vitro tambin parecen ser diferntes. La utilizacin de medios clsicos adaptados de trabajos en bovinos han resultado en bajos ndices de maduracin. En comparacin con otras especies la maduracin in vitro de ovocitos equinos es baja. En medida de 40% a 60% los ovocitos alcanzan la metafase
52

GRONDHAL C, Host T, 1995. In vitro production of equine embryos. Biol. Reprod, Mono 1: 299307
53 54

Opcit 29 WHITMORE KE; Casey PL Mitchell PS, 1989. Pregnacies following 24-hour co culture of equine embryos of foetal bovine uterine monolayers. Equine Vet J, 8: 117-22

45

II in vitro, comparado con un 97% en ovocitos bovinos. La razn por la cual la maduracin in vitro del ovocito equino no es completa no es conocida. Tcnicas como la aspiracin folicular guiadas por US han permitido colectas repetidas de ovocitos de una misma yegua55, acrecentando en una exploracin ms promisoria de tcnicas de IVP en caballos. La puncin de folculos inmaduros permite la aspiracin de un mayor nmero de folculos. En la tcnica los ovocitos son aspirados de folculos pre ovulatorios sea madurados in vivo, a travs de Ultrasonografa trans-vaginal y transferidos va acceso quirrgico por el flanco para el oviducto de una receptora. La yegua receptora es inseminada (Intra Uterino) inmediatamente despus de la Transferncia de Ovocitos (TO). De esta forma tanto la maduracin de ovocitos como la capacitacin espermatica ocurren de manera natural.

3. INSEMINACIN ARTIFICIAL DE LA YEGUA Varios factores pueden afectar el xito de un programa de inseminacin artificial. La calidad del semen es una de ellos y por lo tanto la fertilidad del macho y su potencial reproductivo deben ser investigados. Se debe tener conocimiento de las tasas de preez logradas por el macho con monta directa, semen refrigerado y/o con semen congelado. Si se usa semen refrigerado o congelado es importante conocer los tipos de empaques utilizados para transportar semen, tiempo que transcurre entre la toma de
55

COOK NL. Squires EL, Transvaginal ultrasound-guied follicular aspiration of euine oocytes. Equine vet. Sci, 18: 736-40

46

semen y el arribo del semen a la hembra, cuantas dosis se envan as como la concentracin en cada dosis y una evaluacin mnima de motilidad. 3.1 Procedimiento de Inseminacin: La yegua debe inmovilizarse

mediante una traba, o puesta en potro para reproduccin a fin de proteger al inseminador. El rea alrededor de la vulva debe lavarse antes de la inseminacin para minimizar la contaminacin. Se utiliza una manga de palpacin, ligeramente lubricada, se inserta a la vagina y el dedo ndice se inserta en el cuello. El catter de inseminacin se gua fcilmente hacia el tero, donde se depositan de 20 a 50 ml de semen crudo o diluido. Para obtener mejores resultados con semen fresco o semen almacenado no congelado se deben depositar 500 millones de espermatozoides mviles con la inseminacin. 3.1.1 Inseminacin con Semen Refrigerado: La supervivencia del semen refrigerado vara con cada reproductor, el tipo de contenedor en que el semen es refrigerado y transportado y con la experiencia de las personas involucradas en el manejo del semen. Las tasas de preez usando semen refrigerado pueden variar entre 0% y 70% debido a las variaciones anteriormente mencionadas. Los contenedores mas comnmente utilizados deben mantener la temperatura de refrigeracin (4-60C) por 24-48h. Es importante evaluar la calidad del semen al momento que se realiza la inseminacin en especial cuando es la primera vez que se utiliza un reproductor. En algunos casos el semen puede llegar muerto al sitio donde se halle la yegua y no es conveniente inseminarla con ese tipo de semen. Si

47

es un garan donde la viabilidad del semen ya es conocida, la yegua puede ser inseminada pero si es posible una gota de semen debera ser evaluada despus de la inseminacin particularmente si se ha observado repeticin de calores en las yeguas inseminadas con ese mismo semen en un celo anterior. Es frecuente empacar 109 espermatozoides por dosis de inseminacin para lograr una dosis ideal al momento de la inseminacin de 500 millones espermatozoides mviles. Una gota de semen sobre una laminilla precalentada a 370C debe contener por lo menos un 30% de motilidad. Si existe duda de la concentracin del semen enviado se debe realizar un conteo con un hemocitmetro o con un espectrofotmetro si se encuentra accesible. 56Con ste examen se asegura que el semen esta vivo tambin se puede realizar ajustes a la dosis de inseminacin en caso de que dos dosis sean enviadas y una de ellas tenga un nmero de espermatozoides menor de 500 x 106 o tiene pobre motilidad. Es frecuente dividir una dosis de inseminacin para servir la yegua dos veces con un intervalo de 24h. Esto ha demostrado que por el contrario disminuye los chances de que la yegua quede gestante adems de que en la mayora de los casos la segunda dosis tiene una viabilidad mucho menor por haber sido colectada hace mas de 48h. Si se envan dos dosis y el semen tiene una buena viabilidad 24h despus de la primera inseminacin, entonces realizar la segunda inseminacin pude incrementar las tasas de preez. Squires et al., (1998) insemin un grupo de yeguas dos veces con 24horas de intervalo y con 1000 x 106 de espermatozoides cada vez y lo comparo con una sola
56

LOVEKAMP-SWAN & DAVIS 2003 Environ. Health Perspect. 111: 139-145

48

inseminacin con 2000 x 106 de espermatozoides. Las tasas de preez fueron 64% y 41% respectivamente. Concluyendo que si el semen tiene buena supervivencia es til enviar dos dosis de inseminacin las cuales pueden ser usadas con in intervalo de 24horas en caso de que la yegua no haya ovulado.35Servir a las yeguas una sola vez por ciclo es lo ideal para disminuir costos de envo de semen y para disminuir el riesgo de endometritis post servicio en yeguas susceptibles. Se debe examinar a la yegua tan temprano como sea posible en su celo. Los hallazgos de ultrasonido de un folculo mayor de 30-35mm generalmente, y la presencia de edema en el tero son importantes para confirmar el celo. El examen vaginal tambin es til para evaluar la relajacin del cervix. Por palpacin rectal los cuernos uterinos deben estar relajados debido a la alta concentracin de estrgenos por el folculo activo.57 La induccin de la ovulacin es una herramienta farmacolgica cada vez mas utilizadas. Se pueden utilizar agonistas de la GnRH/LH. En el caso de la yegua dichos agonistas deben imitar el prolongado pico de LH que ocurre fisiolgicamente en la yegua. Por consiguiente solo molculas de larga vida son efectivas en inducir la ovulacin. Las ms comunes son la Gonadotropina Corinica Humana (hCG) y la Deslorelina. La primera es inyectada por va intravenosa, intramuscular o subcutnea, mientras que la segunda es un implante que generalmente no se retira. Ambos productos inducen la ovulacin en 36-48h en un 80-90% de los casos siempre y cuando

DASCAINO J, Ley W, 2000H the American Association of Equine Practiotioners ;

46:316-8.

49

el pico endgeno de LH no haya ocurrido antes de la inyeccin o el implante.58 Las yeguas deben ser examinadas 48 horas despus de haber sido inseminadas para determinar la ovulacin. Si la ovulacin no ha ocurrido entonces la yegua debe ser re-inseminada. La yegua tambin debe ser examinada para determinar si sufre de endometritis post-servicio la cual debe ser tratada prontamente para incrementar las posibilidades de gestacin. Uno o varios tratamientos de 10 UI de oxitocina es el tratamiento que ms se esta empleando actualmente. Los lavados con solucin salina con o sin antibiticos tambin se emplean con xito.59 3.1.2 Inseminacin con Semen Congelado: Las yeguas destinadas a inseminacin con semen congelado deben tener excelente historial reproductivo. La tasa de xito depende de muchos factores incluyendo la supervivencia del semen despus de la congelacin y una adecuada determinacin del momento de la ovulacin. Para lograr una fertilidad

58

BOLLWEIN H,1999 Braun J. Follicular dynamics in mares treated with hCG for induction of

ovulation. Tierarztliche Praxis. Ausgabe G, Grosstiere/Nutztiere27(1):47-51.

5
9 38

WATSON ED.2000 Post-breeding endometritis in the mare.; 60-61:221-32.

50

mxima el semen congelado debe ser depositado en el tracto de la hembra dentro de las seis horas de la ovulacin debido a su corta vida despus de descongelado. En la mayora de los casos es mejor confirmar la ovulacin antes de realizar la inseminacin. Para lograr esto se recomienda examinar la yegua cada seis horas hasta que la ovulacin se confirme. Barbacina et al., (1999) reporta 38% y 38.3% de tasas de preez cuando la inseminacin se realiz seis horas antes o seis horas despus de la ovulacin. Debido al examen exhaustivo este tipo de procedimientos generalmente debe ir acompaado de tratamientos que induzcan la ovulacin para reducir el nmero de exmenes.60 El semen congelado viene en varias presentaciones. Las ms comunes son los pellets de 5.0ml o pajillas de 0.5 ml (generalmente 1-8). Sin importar la presentacin, la yegua debe ser inseminada con al menos 300 x 10 6 de espermas motiles con un mnimo de 30% de motilidad. Las tasas de preez

BARBACINI S, Zavaglia G, Gulden P, Marchi V, Necchi D. Retrospective study on the

efficacy of hCG in an equine artificial insemination program using frozen semen. Equine Veterinary Education 2000; 12(6):312-7.

51

se incrementan cuando la motilidad se incrementa. En un estudio no se reportaron tasas de preez cuando la motilidad fue menor del 20%. Las tcnicas para congelacin de semen son muy variadas probablemente debido a la individualidad del semen para resistir los procesos de congelacin. Por esta razn cada envo de semen debe incluir la informacin completa sobre el procedimiento de descongelacin as como el nmero de pajillas a utilizar por cada servicio. Las pajillas de 0.5ml generalmente se descongelan a 370C pero el nmero puede variar de una a ocho para cada servicio. Si el numero de pajillas es mas de uno las pajillas deben ser descongeladas y el semen se debe colocar en un tubo estril para posteriormente inseminar la yegua con una jeringa. Tambin existe actualmente una pistola de inseminacin en la que se pueden colocar todas las pajillas para inseminar la yegua.61 3.1.3 IA Intracornual Profunda con Dosis Bajas de Semen Refrigerado y Congelado: Mxima Fertilidad ha sido obtenida en yeguas inseminadas con dosis de 500 X 10 espermatozoides motiles progresivos (pms) mientras la yegua esta en estro. Sin embargo, el nmero mnimo requerido de

61

LEIPOLD SD,1998 Squires GEL, McCue PM, Brinkso SP, Vanderwall DK. Effect of

spermatozoal concentration and number on fertility of frozen equine serum. Theriogenology 49(8):1537-43.

52

espermatozoides motiles para una optima fertilidad se ha establecido en alrededor de 250 500 X 10 pms. Bajo condiciones ideales las yeguas pueden ser inseminadas con tan poco como 100 X 10 pms cada da durante el estro sin disminuir la fertilidad. La inseminacin Artificial (IA) en yeguas con un bajo nmero de espermatozoides puede ser necesario cuando la cantidad es limitada, de difcil consecucin o cuando se usan espermatozoides sexados. En el evento de apareamiento natural, la mayora del eyaculado es depositado directamente dentro del tero de la yegua. Esto es similar a cuando se realiza la rutina de IA. Este sitio de deposicin es aceptable cuando un alto nmero de espermatozoides frtiles son disponibles, pero cuando un nmero limitado de espermatozoides es disponible una alternativa de acercamiento hacia el cuerno uterino puede ser adoptada. Varias razas de equinos registrados recientemente han aceptado el uso de semen refrigerado eliminando la necesidad de la yegua y del semental de alojarse en la misma finca. El semen del garaon es usualmente transportado en un dispositivo pasivo como es Equitainer
R.

( Hamilton Torn USA ) el cual refrigera las muestras

de semen a un ndice inicial de 0.03 C/min. Caiser y Col reportaron que el espermatozoide del equino puede ser refrigerado rpidamente de 37 a 20C, pero de 20 a 5 C este puede ser refrigerado a <o.1C/min. Para una optima sobrevivencia el semen del garaon debe ser diluido con un medio que contenga leche descremada y glucosa en proporcin 3:1 a una concentracin de aproximadamente 25 X 10 pms / ml.62
6
2

SQUIRES EL.2003 Estrous detection. In: Equine Reproduction. McKinnon and

53

Son pocos los estudios dirigidos a evaluar la fertilidad del semen de 24 a 48 horas. Usualmente se intenta inseminar yeguas con semen refrigerado transportado, lo ms cercano posible a la ovulacin que puede requerir 2 envos de semen o un solo envo que contenga 2 dosis del mismo eyaculado. Una estrategia comn de manejo es esperar hasta que llegue el semen, y luego aplicar un agente inductor de la ovulacin como la hCG o GnRH previo o a tiempo de la IA. Sin embargo no se ha determinado si es mejor inseminar la yegua con ambas dosis al comienzo o almacenar una dosis a 5C para una inseminacin adicional 24 horas despus de la primera inseminacin. El nmero de razas puras que han usado semen de equino congelado ha incrementado recientemente. Sin embargo, el nmero de yeguas inseminadas con semen congelado permanece limitado, primariamente porque los ndices de preez son generalmente menores a las yeguas inseminadas con semen fresco o refrigerado. Varios protocolos han sido han sido desarrollados para la criopreservacin de semen equino. Cada protocolo tiene una combinacin especfica de sistema de empaque y una concentracin espermtica resultado en dosis para inseminacin en diferentes volmenes. El semen equino es comnmente empacado en pajillas de 0.5 ml, 2.5 o 5 ml. Las pajillas de bajo volumen poseen un a amplia rea de superficie en relacin al volumen, lo que permite la
Voss 186-194

54

refrigeracin, congelacin y descongelacin de los espermatozoides ms uniformemente y optimizar el ndice de preez.63 Sin embargo cuando los espermatozoides son congelados en pajillas de 0.5 ml, a concentraciones previamente determinada para una ptima supervivencia espermtica 2 a 8 pajillas son requeridas para lograr una dosis inseminatoria de 175 a 300 X 10 de espermatozoides progresivos mviles. Monitoreo Ecogrfico: Las donantes se evalan cada 24 horas o cada 6 horas mediante examen ecogrfico (Aloka SSD 500 5 Mhz.) en los casos de IA con semen congelado o refrigerado respectivamente. Preparacin del Semen: Semen Refrigerado: Una vez colectado es diluido en un extender comercial y se desciende hasta 5C para su utilizacin 24 72 horas despus. El volumen total ha usar es de 7 ml. Contenido 200 X 10 espermatozoides con motilidad progresiva. Semen Congelado: Se colecta, diluye y congela en pajillas de 0.5 ml, con una concentracin estimada / pajilla descongelada = 100 X 10 espermatozoides con motilidad progresiva. IA Intracornual Profunda (IAIP): Se realiza utilizando un cateter flexible de 65 o 75 cm de longitud (semen congelado o refrigerado) respectivamente que
63

se

inserta

en

el

cuerno

ipsilateral

al

folculo

verificndose

LEIPOLD SD,1998 Squires GEL, McCue PM, Brinkso SP, Vanderwall DK. Effect of spermatozoal

concentration and number on fertility of frozen equine serum.; 49(8):1537-43.

55

transrectalmente. En caso del semen refrigerado las inseminaciones se realizan en promedio de 8 a12 horas previo a la ovulacin y cuando se usa semen congelado se realiza posterior a la ovulacin con una pajilla por cada folculo ovulado. Colecta de Embriones: Se realiza entre el da 7-9 post-ovulacin, el medio de coleccin es Ringer Lactato y mediante la tcnica de circuito cerrado. (Ver Figura N 9)

Figura N 9 Colecta de Embriones

Transferencia

de

Embriones:

Los

embriones

son

evaluados

posteriormente empacados en pajillas francesas irradiadas para transferncia transcervical entre 0.05 4 horas post colecta. El diagnostico de gestacin

56

se realiza mediante ecografa a los 7 das y la confirmacin a los 45 y 60 das post- transferencia.(Ver Figura N 10-11-12).

Figura N 10 Embrin de 8 das (blastosito expandido)

Figura N 11 Transferencia del embrin en receptora ovulada 2 das despus

57

En este caso se realiza la colecta de 352 embriones en yeguas deporte utilizando la tcnica de IAIP con bajas dosis de semen refrigerado y congelado y se compara con la tasa de Recuperacin Embrionaria (TRE) y Tasa de concepcin (TC), durante un periodo de 6 meses. La TRE se observa en la tabla 2.

Figura N 12 Embrin de 15 das transferido a una Receptora hace 7 das

Tabla N 2. Tasa de Recuperacin Embrionaria (TRE) Tipo de Semen Refrigerado Congelado Total Caballos 14 19 33 IA 148 384 532 Embriones Recuperados 65 177 242 TRE (%) 43.20 46.09 45.49

58

TRE = N Embriones Recuperados / N Colectas X 100

Como se observa, no hay diferencia entre el uso de la tcnica con los dos mtodos de conservacin de semen equino con respecto a la TRE. En la tabla 3, se relacionan los datos de las colectas que se realizan con semen refrigerado de 14 garaones pudindose notar diferencias en las TRE por individuos en particular Tabla N 3 Tasa de Recuperacin Embrionaria (TRE) con Semen Refrigerado Caballo A B C D E F G H I J K L M N 14 IA (n) 23 10 28 27 4 1 5 14 1 20 6 4 1 4 148 Embriones Recuperados (n) 9 5 11 16 3 0 2 7 0 5 4 1 1 1 65 TRE (%) 39.13 50.0 39.9 59.26 75.00 0.00 40.00 50.00 0.00 25.00 66.67 25.00 100.0 25.00 43.92

TRE = N Embriones Recuperados / N Colectas X 100 Se muestra en la tabla 4, los resultados obtenidos utilizando semen congelado en 19 sementales y son notorias las diferencias en la (TRE), las

59

cuales pueden deberse a factores como: Interaccin entre donante y semental, capacidad fecundante, sensibilidad individual de los espermatozoides por enfriamiento o congelacin. Tabla N 4. Tasa de Recuperacin Embrionaria (TRE) con Semen Congelado Caballo IA (n) Embriones TRE (%) Recuperados A 135 57 42.22 B 23 5 21.74 C 3 2 66.67 D 5 3 60.00 E 14 4 28.57 F 2 0 0.00 G 10 6 60.00 H 10 1 10.00 I 2 1 50.00 J 22 11 50.00 K 15 5 33.33 L 32 26 81.25 M 3 0 0.00 N 61 34 55.74 O 3 1 33.33 P 20 9 45.00 Q 18 11 61.11 R 3 0 0.00 S 3 1 33.33 19 384 177 46.09 TRE = N Embriones Recuperados / N Colectas X 100 En la tabla 4, se muestran los resultados de las tasas de concepcin (TC) en receptoras de embriones de donantes que reciben IAIP. Se observa la diferencia a favor de TC superior con embriones de donantes inseminadas con semen refrigerado.

60

Tabla N 5 Tasa de Concepcin (TC) con Semen Refrigerado y Congelado Tipo de Semen Refrigerado Congelado Total Embriones Transferidos (n) 65 177 242 Receptoras Gestantes (n) 55 104 159 TC (%) 84.62 58.76 65.70

TC= N Receptoras Gestantes / N Embriones Transferidos X 100 La IAIP con bajas dosis de semen congelado o refrigerado en IA convencional, es una biotecnologa factible de aplicar en el campo y no hay diferencias entre el tipo del mtodo de conservacin del semen equino y la TRE y TC en embriones.

4. EVALUACIN

REPRODUCTIVA

DE

LA

YEGUA

POR

ULTRASONOGRAFA El US (Ultrasonido) en los equinos y en particular en el diagnstico reproductivo es una herramienta de gran utilidad. No se debe olvidar como ella es una prueba diagnstica que debe ser adecuadamente correlacionada con las dems pruebas que hacen parte del abordaje reproductivo de la yegua. Adems del examen clnico que es fundamental, hace parte de eventos tales como la palpacin rectal, vaginoscopa, citologa vaginal, biopsia uterina, medicin de perfiles hormonales entre otros. Esto quiere decir que en el US reproductivo de la yegua es fundamental conocer la anatoma y fisiologa reproductiva en forma profunda, para hacer de esta una prueba diagnstica de real utilidad. Igualmente es de importancia conocer

61

aspectos bsicos del US para un completo entendimiento de esta tcnica y su adecuada aplicacin en el mbito clnico. (Ver Figura N13)

Figura N 13 Examen con Ultrasonografa

4.1 Generalidades US: El ultrasonido se caracteriza por la produccin de ondas de sonido con una frecuencia ms alta que las ondas de la escala audible.64 El US es enviado hacia los tejidos a travs de un elemento que se conoce como transductor, el cual igualmente recibe las ondas reflejadas para convertirlas en impulsos elctricos, procesada y mostrada de acuerdo al tipo de US utilizado.65

Los sistemas de US que existen bsicamente son de dos tipos:

64

RANTANEN NW : Instrumentation and physical principles of ultrasound use. Proceedings of the

th

39 ANNUAL MEETING of the American Association of Equine Practice, 1993.

65

REEF VB. Equine Diagnostic Ultrasound. Saunders: 405-423, 1998.

62

Modo A: Modulacin por amplitud. Los ecos son representados en un oscilgrafo en forma de picos a diferentes alturas en funcin del tiempo. Es un sistema de difcil interpretacin y poco utilizado en Medicina Veterinaria66

Modo B: Modalidad de brillo. Se caracteriza por una imagen bidimensional compuesta por lneas de puntos grises, de diferente brillo de acuerdo con la biotextura del tejido.

Modo real tipo B: Da gran informacin en poco tiempo, permitiendo un diagnstico dinmico en poco tiempo en anatoma tridimensional. Realmente se genera una imagen bidimensional, que con el movimiento generado por el operario a travs del transductor da una sensacin de movimiento de tiempo real y en tercera dimensin de los tejidos apreciados. Este es el sistema mas utilizado en Medicina humana y Veterinaria. 67

Modo B Esttico: Esta compuesto por un brazo articulado no mvil, de muy poco uso en Veterinaria.

Sistema Doppler: El US cambia de frecuencia al chocar en su trayectoria con interfases en movimiento que se acercan o se alejan. Cambios que se dan particularmente a nivel vascular (pulstil), los cuales son captados por el ecgrafo y se representan en forma de seal acstica grfica o digital.68
66 67

Opcit 34 Opcit34 68 RANTANEN NW , Instrumentation and physical principles of ultrasound use. Proceedings of the 39th ANNUAL MEETING of the American Association of Equine Practice, 1993.

63

Para lograr que las molculas de los tejidos vibren, se requiere que el US venza una resistencia especfica de los tejidos que se conoce como impedancia acstica. Un material de alta impedancia acstica es aquel que presenta un mayor nmero de molculas por unidad de volumen permitiendo que el sonido se transmita ms rpido, pero igualmente esto hace que haya una menor comprensin del material a analizar. Un tejido de alta impedancia acstica es el hueso, mientras que uno de baja es la vejiga urinaria distendida.

El principal tipo de Ultrasonografa que se utiliza en reproduccin equina es Tiempo real tipo B. Este sistema se rige por una escala de grises dependiendo del brillo generado por el ultrasonido al chocar con un tipo particular de tejido. A mayor impedancia acstica de un tejido especfico, la escala de grises ser mayor, por tanto ser ms gris, ms brillante. Mientras que un tejido lleno de lquido, como un folculo, se apreciar oscuro por el lquido en su interior. Para ello existen los siguientes trminos para clasificar los hallazgos de US en la pantalla: Ecognico o ecico - tono claro Anecognico o anecico -tono oscuro.

Esta clasificacin se da dentro de la escala de grises, que van desde el negro hasta el blanco, existiendo en los ecgrafos modernos por encima de

64

300 matices de gris, aunque el ojo humano solo esta en capacidad de percibir de 10 a 12 en el monitor69

La intensidad del sonido se da en una unidad fsica que se conoce como Megahert (MHZ), el cual equivale a un milln de ondas sonoras / segundo.

Por ello los transductores se mencionan de acuerdo al nmero de ondas sonoras que se encuentran en capacidad de enviar. Existiendo de 3.5, 5, 6, 7.5 Megahertz (MHZ). A su vez la intensidad de la onda sonora indica la capacidad de penetracin y de resolucin que se puede tener de un tejido en estudio de la siguiente manera: A mayor nmero de MHZ, menor penetracin pero mayor resolucin, mientras que un transductor con menor nmero de MHZ tiene una mayor penetracin, pero una menor resolucin o nitidez.

Los ARTEFACTOS son interferencias entre la onda sonora y los tejidos, lo cual afecta la visualizacin de la imagen y que carecen de valor biolgico. Los hay de diferentes tipos, pero los ms representativos son: Reverberancia, de sombra, cola de cometa entre otros.70

69

MCKINNON AO, Squires EL, Voss JL: Ultrasonic evaluation of the mare's reproductive tract, Part

I Compend Contin Educ Pract Vet 9:336-345, 1987.

70

COLBY J : Artifacts and image quality in ultrasound. J Equine Vet Sci 5:295-297, 1985.

65

4.1.1 Aplicaciones del US en la yegua vaca:

4.1.1.1. Actividad ovrica: Un adecuado examen de los ovarios de la yegua por medio del US, requiere de habilidad por parte del examinador para lograr ubicarlos en la cavidad pelviana, del mismo modo se necesita habilidad para manipularlos y lograr as suficientes imgenes que nos muestren las estructuras ms relevantes dentro del mismo.

Para lograr estas imgenes de la mejor forma es necesario que el transductor se encuentre en estrecho contacto con el tejido a evaluar, en este caso el ovario y sus diferentes estructuras.

Los folculos se caracterizan por ser estructuras relativamente circulares de contenido anecognico, pared delgada y con dimetros que pueden ir desde 5mm hasta folculos preovulatarios de entre 40 y 60 mm.71

Por medio del ecgrafo es posible apreciar la dinmica folicular de una forma adecuada, lo que junto a otros elementos nos permite determinar el crecimiento de los folculos y en particular el ovulatorio y de esta forma lograr precisar el momento ms cercano de la yegua a la ovulacin.

71

GINTHER OJ, Pierson RA: Ultrasonic Anatomy of equine ovaries. Theriogenology 21:471-483,

1984.

66

Las diferentes formas que adopta el folculo antes, durante y despus de la ovulacin se pueden apreciar con relativa facilidad por medio del US. Siendo fundamental correlacionar estos hallazgos con otros aspectos anatmicos de la yegua como son los cuernos y el cuerpo del tero, al igual que estructuras que hacen parte del tracto genital externo. Sumado a este el comportamiento de la yegua al igual que ciertos perfiles hormonales, hacen del US un til pero no nica herramienta dentro del diagnstico reproductivo equino.72

Es

necesario

recordar alto de

como

las

yeguas dobles,

presentan las cuales

un

porcentaje ser

relativamente

ovulaciones

pueden

corroboradas en un momento dado por medio del US.

La formacin del cuerpo hemorrgico, el cual luego se ha de constituir en cuerpo lteo es fcilmente apreciable cuando el transductor se ha colocado cerca del ovario y este se manipula adecuadamente. La importancia de la deteccin del cuerpo lteo a travs del US tiene relevancia desde el punto de vista clnico si se recuerda como este no es detectado por medio de la palpacin rectal.73 (Ver Figura N 14)

72

PIERSON RA, Ginther OJ: Ultrasonic evaluation of the corpus luteum of the mare. Theriogenology

23:795-806, 1985.
73

Opcit 41

67

Figura N 14 Cuerpo luteo de 7 das post ovulacin

A nivel de otras estructuras como los oviductos, estos no son fcilmente apreciables a menos que haya un proceso en el cual se presente un aumento de tamao como es el caso de una salpingtis.74

1.4.2.2 Evaluacin Uterina: Para el examen del tero, el transductor se coloca dorsal a las estructuras. Examinando primero la vagina, continuando con el cuello, cuerpo y finalmente los cuernos. El punto de referencia durante el inicio de este abordaje es el buscar la vejiga urinaria, encontrando que la

74

MCKINNON AO, Squires EL, Voss JL: Ultrasonic evaluation of the mare's reproductive tract, Part

I Compend Contin Educ Pract Vet 9:336-345, 1987.

68

vagina se encuentra caudo-dorsal mientras que el cuello uterino esta dorsal a la misma.

Es importante por medio del US lograr apreciar la presencia o ausencia de contenido dentro del mismo,(ver Figura N 15) Para ello es til la observacin en forma independiente de los cuernos y la comparacin entre ellos al igual que la evaluacin del cuerpo uterino.75

Figura N 15 Determinacin grado de estrogenizacin

El contenido dentro de los cuernos o cuerpo nos puede indicar procesos fisiolgicos, como en el caso de la presencia de escaso lquido y edema en los cuernos durante la fase folicular del ciclo e igualmente durante la gestacin. Igualmente en la evaluacin de preeces gemelares de la yegua el US es una herramienta de gran ayuda .Del mismo modo contenido en

75 43

SQUIRES EL 2001. Estrous detection. In: Equine Reproduction. McKinnon and Voss .:ED 186194.

69

procesos

patolgicos

como

en

el

caso

de

endometritis,

quistes

endometriales, mucmetra, neummetra, pimetra entre otros.