OBTENCIN DE HARINA A PARTIR DEL CULTIVO DE Chlorella vulgaris Y SU ANLISIS PROTEICO OBTAINING OF FLOUR TO LEAVE OF THE CULTIVATION OF Chlorella

vulgaris AND THEIR PROTEIN ANALYSIS

Ricardo D. Andrade 1, Ramiro Torres1, Everaldo J. Montes1 y Alfredo C. Fernndez1
Recibido para evaluacin: Agosto 14 de 2006 - Aceptado para publicacin: Noviembre 1 de 2006

RESUMEN
La obtencin de protena a partir organismos unicelulares es una alternativa de fcil accesibilidad, bajo costo y alto rendimiento. En este trabajo se cultiv la microalga Chlorella vulgaris a nivel de laboratorio, posteriormente se transform en harina, a la cual se le determin la composicin bioqumica y las caractersticas del perfil de aminocidos esenciales. El cultivo, de pureza monoespecfica y extensiva, se realiz por lotes utilizando tres concentraciones (1, 3 y 5 ml l -1 de solucin) del fertilizante comercial triple 15. La mayor velocidad de crecimiento se dio a una concentracin de 1 ml de fertilizante l -1 de solucin, (Pr< 0.05). Las mediciones de concentracin de protena bruta revelaron valores relativamente altos, 56,25% (p/p), con un buen nivel de aminocidos esenciales, sin limitantes para adultos comparados con el patrn WHO/FAO/UNU y teniendo solo como primer limitante los aminocidos sulfurados (metionina y cisteina), mostrando una deficiencia del 6% para preescolares, la cual no es critica. Palabras clave: Protena microalgal, escore qumico, aminocidos esenciales.

ABSTRACT
Protein from unicellular organisms is a low cost and high yield alternative. Chlorella vulgaris was cultivated and processed, and its biochemical composition, characteristics and amino acids content determined. A pure sample was cultivated in the presence of three commercial fertilizer concentrations (1, 3 and 5 ml l -1) solution. Growth rate was higher at 1 ml l -1 fertilizer concentration. Protein content was 56,25% (w/w), with fair levels of amino acids according to WHO/FAO/UNU, but absence of methionine and cistein and 6% deficiency for pre-school level. Key words: Microalgal protein, chemical score, essential amino acids.

Universidad de Crdoba, Departamento de Ingeniera de Alimentos, Km 12 va Ceret - Cinaga de Oro. Tel (4) 894 0508, Fax (4) 786 0255, Email: randrade@sinu.unicordoba.edu.co

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INTRODUCCIN
La obtencin de protena a partir de productos alimenticios de fcil accesibilidad, bajo costo y alto rendimiento ha llevado a plantear investigaciones en la bsqueda de este importante alimento a partir de organismos unicelulares (De la Torre, 1985). En los ltimos aos, un creciente inters en el estudio de microorganismos como microalgas, algunos hongos y bacterias han sido de gran importancia debido a la posibilidad de aplicacin comercial en distintas reas como la nutricin, la salud humana y animal, el tratamiento de aguas residuales y la obtencin de compuestos de inters en las industrias alimentarias, qumicas y farmacuticas (Bruno, 2001; Grobbelaar, 2004; Richmond, 2004). Las microalgas se caracterizan por habitar todos los cuerpos de agua donde existan las condiciones ms simples para crecer (Abalde et al., 1995); su consumo se da desde tiempos inmemoriales, aunque las investigaciones sobre la utilizacin de stas en la alimentacin es un tema relativamente reciente (Garca et al., 1993). La obtencin de protena a partir del cultivo de microalga data de los aos 60, cuando los Alemanes en la ciudad de Dortmund, con el afn de contribuir a solucionar problemas alimenticios, estudiaron las posibilidades proticas de estos microorganismos (Uribe, 1995). En Latinoamrica se comenz la produccin semi-industrial de microalgas en Sausal (Per) en 1978, despus de los buenos resultados de estudios realizados sobre la posibilidad de la produccin masiva de la microalga Scenedesmus acutus var alternans (Castillo, 1978). En 1975, en la Universidad de Colima, Mxico, se estudi el valor nutritivo de la alga Spirulina gertleir, para dietas en pollos de engorde, Mule (1988) determin el contenido proteico de las

cianofitas en aguas residuales, con miras al aprovechamiento protenico para la alimentacin. Actualmente varias especies de microalgas son cultivadas comercialmente en algunos pases y la biomasa producida ha sido utilizada en la industria de alimentos. El mercado de alimentos funcionales, utilizando microalgas en panes, yogurt y bebidas, presenta rpido desarrollo en pases como Francia, Estados Unidos, China y Tailandia (Pulz y Gross, 2004). El valor biolgico de una protena depende fundamentalmente de su composicin en aminocidos esenciales. Conocida sta es posible predecir, dentro de ciertas limitaciones, su comportamiento en el organismo; para ello slo es necesario contar con un adecuado patrn de comparacin. El primer patrn utilizado fue la protena del huevo. Su uso ha sido muy criticado ya que su composicin en aminocidos no es constante y el contenido de algunos aminocidos es excesivo. Posteriormente, varios Comits de Expertos de la FAO han propuesto distintos patrones en los aos 1956, 1965, 1970, 1973. La ltima propuesta de este organismo es la realizada en 1985, que se bas en los trabajos experimentales de corta y larga duracin que evaluaron la cantidad de nitrgeno necesario para producir un balance de nitrgeno en equilibrio (Surez et al., 2006). Las principales microalgas cultivadas comercialmente son las especies Chlorella Beyerinck (Chlorophyceae) y Arthrospira Stizenberger (Cyanophyceae) para la formulacin en alimentos naturales y Dunaliella salina Teodoresco (Chlorophyceae) para la obtencin de betacarotenos (Richmond, 2004). En pases como Mxico, Estados Unidos y Japn, la Spirulina mxima se utiliza en la alimentacin humana para suplir la deficiencia de protena, y debido a su contenido de cido gammalinoleico es muy

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importante en la alimentacin de hipertensos y pacientes con tensiones premenstruales (Roughan, 1998). Esta es obtenida con sistemas de produccin, cosecha y secado muy tecnificados y costosos (Pedraza, 1989). Recientemente algunos cultivos han sido desarrollados en equipos especializados, denominados fotobiorreatores, donde se alcanzan elevadas productividades. Los cultivos son realizados en sistema construidos con tubos de plstico, vidrio o policarbonato, donde es posible controlar las condiciones de cultivo (cantidad de nutrientes, temperatura, iluminacin y pH); viabilizando una produccin comercial de productos con un mayor valor agregado (Richmond, 2004). Entre las microalgas de mayor importancia se encuentra Chlorella por su valor econmico y nutricional, tanto a nivel animal como humano. Chlorella vulgaris ha sido utilizada por su calidad proteica (Morris et al., 1999) e incluso presenta propiedades antitumorales (Noda et al., 1996). Actualmente, representa un sistema biolgico ideal para diferentes lneas de investigacin y adems presenta una alta eficiencia por su fcil adaptacin en condiciones de laboratorio (Huss et al., 1999; Morris et al., 1999; Ortega et al., 2 0 0 4 ) . M o r r i s e t a l. ( 1 9 9 9 ) , r e a l i z a r o n estudios sobre la composicin bioqumica y las caractersticas del perfil aminoacdico de la microalga Chlorella vulgaris, cultivada en rgimen autotrfico y evaluaron la calidad de su protena mediante mtodos qumicos. En este estudio se cultiv la microalga Chlorella vulgaris a nivel de laboratorio, con el objetivo de evaluar la concentracin del fertilizante Triple 15 y el tiempo adecuado para su ptima produccin. Adems, a su harina se le determin su calidad proteica mediante el escore qumico.

MATERIALES Y MTODOS
Microalga
Se utiliz una cepa de Chlorella vulgaris proveniente del Centro de Investigaciones Pisccola de la Universidad de Crdoba, Colombia.

Inoculo y nutrientes
Se adicion 1ml de inoculo a un erlenmeyer que contena 3 l de agua destilada y la cantidad a evaluar del fertilizante triple 15 (NUTRIMON 15-15-15 ) al 10% (p/v). Los cultivos inoculados en los erlenmeyers se mantuvieron durante 20 das iluminados artificialmente con una iluminancia de 2000 luxes y corriente continua de aire de 0,4 m3 h-1. Cada dos das se tomaron muestras, por triplicado, de 5 ml para determinar la concentracin de biomasa del cultivo (g ml -1) midiendo la absorbancia a 585 nm en un espectrofotmetro Merck SQ 118.

Elaboracin, anlisis y evaluacin de la calidad de la harina

A los 20 das, el cultivo se centrifug y la pasta hmeda se transfiri a un mortero de porcelana, colocndose en una estufa a 40C durante 18 horas, luego la pasta seca se macer hasta obtener la harina. Las variables que se determinaron fueron protena bruta (micro-kjeldahl, empleando 6,25 como factor de conversin para la estimacin del contenido proteico), humedad, fibra cruda, lpidos y cenizas, segn metodologa recomendada por la Association Of Official Analytical Chemists (Kirk et al., 1996), y los aminocidos esenciales se determinaron por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), utilizando un cromatgrafo lquido marca Shimadzu , integrado por dos bombas LC-6A, una columna Alltex Ultrasphere ODS de 12,5 cm y partculas de silica de 5 mm de dimetro, y un detector de fluoriscencia FLC-6A. El flujo fue constante

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a 1 mL min -1 . Para la preparacin de los solventes, as como el gradiente se utiliz el mtodo propuesto por Umagat y Kucera (1982) modificado por Torres et al. (1994). La identificacin y cuantificacin de los aminocidos se realiz por comparacin con los tiempos de retencin del estndar A A 1 8 S i g m a . E l e s c o r e q u m i c o s e determin teniendo en cuenta como protena de referencia el patrn de aminocidos para preescolares y adultos (WHO/FAO/UNU, 1985).

se realiz la prueba de Tukey para seleccionar el mejor tratamiento, utilizando el programa STATISTICA 5.5.

RESULTADOS Y DISCUSIN
En la tabla 1 se presenta la densidad ptica y el rendimiento de harina alcanzado, respectivamente, para los tres cultivos de Chlorella vulgaris, con diferentes concentraciones de fertilizante. El anlisis de varianza para las variables densidad ptica y rendimiento de harina alcanzado, indican que existen diferencias significativas (Pr< 0.0001) entre las medias de los tratamientos. La Prueba de Tukey, determin que la mayor produccin de biomasa se dio en el cultivo con una concentracin de 1 ml de fertilizante por litro de agua destilada, a los 20 das (figura 1). Este tiempo concuerda con los datos reportados por Uribe (1995). El rendimiento alcanzado de la harina producida fue en promedio de 444 g ml -1 de cultivo.

Diseo experimental y anlisis estadstico de los resultados

Se utiliz un diseo completamente al azar, con el factor concentracin de fertilizante triple 15 en tres niveles (1, 3 y 5 ml de fertilizante en un litro de agua destilada), evaluando la densidad del cultivo a travs del tiempo. Se realizaron tres repeticiones por tratamiento. Para determinar las mejores condiciones de crecimiento de los cultivos estudiados, se realiz un anlisis de varianza (ANAVA) (=0.05). Posteriormente,

Tabla 1. Densidad ptica, en absorbancia y rendimiento de harina (g de harina ml -1 de cultivo) promedio, para cultivos de Chlorella vulgaris. Tiempo (das) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Densidad ptica ml de Triple 15L -1 de solucin 1mL 0,098 0,202 0,363 0,640 0,878 1,191 1,449 1,620 1,721 1,804 1,860 3mL 0,170 0,280 0,446 0,485 0,672 0,875 1,213 1,242 1,326 1,376 1,448 5mL 0,244 0,326 0,422 0,572 0,689 0,746 0,821 0,948 1,084 1,162 1,220 Rendimiento de harina mL de Triple 15L -1 de solucin 1mL 23,4 48,2 86,7 152,8 209,6 284,3 346,0 386,7 410,8 430,7 444,0 3mL 40,6 66,8 106,4 115,8 160,4 209,0 289,6 296,5 316,5 328,5 345,7 5mL 57,4 78,3 99,9 137,3 164,7 177,6 196,4 225,6 258,9 277,8 290,8

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450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 1 mL L-1 3 mL L -1 5 mL L-1

Figura 1. Rendimiento de harina (g de harina ml -1 de cultivo) a los 20 das, para cultivos de Chlorella vulgaris

La tabla 2 muestra que la harina de Chlorella vulgaris, cultivada en presencia del fertilizante, presenta un mayor nivel de protena bruta (56,25% p/p) que la cultivada sin el fertilizante (44,56% p/p) reportada por Morris et al. (1999). El 9,8% (p/p) de cenizas, que representaron una fraccin considerable del peso seco, es comparable con los valores informados para otras especies dulceacucolas y est por debajo de los reportados para la Spirulina maxima (Shubert et al., 1995).

Como se observa en las tablas 3 y 4, el nivel aminoacdico de la Chlorella vulgaris al compararse con el patrn de referencia de WHO/FAO/UNU (1985) para preescolares, indica que su protena tiene como primer limitante a los aminocidos sulfurados (AAS) con 94,0%, es decir, la protena de Chlorella vulgaris tiene un dficit de AAS del 6,0% que, como se aprecia, no es muy crtico. Sin embargo, comparados con el patrn de referencia de WHO/FAO/UNU (1985) para adultos no presenta ningn limitante, lo que la convierte en una protena de alta calidad (tabla 5). Igualmente, la harina de Chlorella

Tabla 2. Composicin bioqumica (% p/p) de la harina de Chlorella vulgaris, comparada con la reportada por Morris et al. (1999). Componente Protena Bruta Humedad Grasas Cenizas Carbohidratos Fibra cruda Chlorella vulgaris 56,25 7,05 5,25 9,80 17,10 4,60 Morris et al. (1999) 44,56 7,18 0,29 8,90 16,00 8,20

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Tabla 3. Contenido de aminocidos de Chlorella vulgaris, comparado con diversas protenas y el patrn WHO/FAO/UNU (1985).
Aminocidos esenciales (g 100g-1 de Protena) Isoleucina Leucina Lisina Total de aminocidos sulfurados Total de aminocidos aromticos Treonina Triptfano Valina
1 2

Chlorella vulgaris 4,82 10,78 7,70 2,35 9,04 5,60 1,12 n.r

Scenedesmus Sp1 3,80 8,40 5,70 2,30 5,10 5,10 1,50 5,70

Maz2 3,68 12,53 2,67 3,47 8,70 3,60 0,70 4,85

Leche de vaca2 4,72 9,54 7,79 3,33 10,13 4,45 1,41 5,79

Huevo de gallina1 6,29 8,84 6,98 5,79 8,99 5,12 1,49 6,85

Patrn WHO/FAO/UNU (1985) preescolares 2,8 6,6 5,8 2,5 7,4 3,4 1,1 3,5 adultos 1,3 1,9 1,6 1,7 2,4 0,9 0,5 1,3

Morris et al. (1999); Fennema (2000); n.r = no reportado.

Tabla 4. Escore qumico de protenas de diferentes productos alimenticios para preescolares tomando el patrn WHO/FAO/UNU (1985) 1 .
Aminocidos esenciales Isoleucina Leucina Lisina Total de aminocidos sulfurados Total de aminocidos aromticos Treonina Triptfano Valina
1

Chlorella vulgaris 172,14 163,33 132,76 94,00* 122,16 164,71 101,82 n.r

Scenedesmus Sp1 135,71 127,27 98,28*** 92,00** 68,92* 150,00 136,36 162,86

Maz 131,43 189,85 46,03* 138,80 117,57 105,88 63,64** 138,57

Leche de vaca 168,57 144,55 134,31 133,20 136,89 130,88 128,18 165,43

Huevo de gallina 224,64 133,94 120,34 231,60 121,49 150,59 135,45 195,71

Clculos realizados por autores con base en datos reportados en tabla 5. n.r = no reportado; *Primer limitante; **Segundo limitante; ***Tercer limitante

Tabla 5. Escore qumico de protenas de diferentes productos alimenticios para adultos tomando el patrn WHO/FAO/UNU (1985) 1 .
Aminocidos esenciales Isoleucina Leucina Lisina Total de aminocidos sulfurados Total de aminocidos aromticos Treonina Triptfano Valina
1

Chlorella vulgaris 370,77 567,37 481,25 138,24 376,67 622,22 224,00 n.r

Scenedesmus Sp1 292,31 442,11 356,25 135,29 212,50 566,67 300,00 438,46

Maz 283,08 659,47 166,88 204,12 362,50 400,00 140,00 373,08

Leche de vaca 363,08 502,11 486,88 195,88 422,08 494,44 282,00 445,38

Huevo de gallina 483,85 465,26 436,25 340,59 374,58 568,89 298,00 526,92

Clculos realizados por autores con base en datos reportados en tabla 5; n.r = no reportado

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vulgaris presenta mejor perfil de aminocidos esenciales (AAE) que la protena de maz, la cual tiene como primer limitante a L-Lisina (46,03%), y como segundo limitante L-Triptfano (63.64%), con dficit relativos de 53,97% y 36,36% respectivamente, que son muy crticos (Tabla 4). Los niveles de L-Lisina en la microalga investigada fueron similares a los del huevo completo y leche; este es el aminocido esencial limitante en muchos cereales, como en la protena del maz que lo tiene como primer limitante (Badui, 1999).

La harina producida a partir de Chlorella vulgaris, cultivada con Triple 15 presenta un mayor nivel de protena bruta que la cultivada sin nutrientes; es una buena alternativa como complemento alimenticio en la elaboracin de concentrados para animales; y puede ser utilizada como suplemento en la dieta humana, debido a su alto contenido de protena y buen perfil de aminocidos esenciales. La protena de Chlorella vulgaris present menos limitantes en aminocidos esenciales que la protena del maz y la microalga Scenedesmus sp. La protena de Chlorella vulgaris muestra como primer limitante a los aminocidos sulfurados (94.00% p/p) con relacin al patrn de aminocidos esenciales, WHO/ FAO/UNU (1985) para preescolares.

CONCLUSIONES

La mejores condiciones para el crecimiento de biomasa de la Chlorella vulgaris, se presentaron para una concentracin de 1 ml de Triple 15 en la solucin al 10% (p/v) de fertilizante en agua destilada, a los 20 das de cultivo, con un rendimiento de 444 g de harina ml-1 de cultivo.

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