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酶工程
杨 晟
中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所
分子微生物学开放实验室
syang@sibs.ac.cn
2005.12.01
个人简 历
酶工程
2000-2002 生化细胞所 ( 酶工程组 ) 助理研究员
2002- 植物生理生态研究所 ( 酶工程组 ) 副研究员
上海生科院实验生物学课程
研究课题:半合成 β 内酰胺抗生素工业用酶
酶工程 定义
定义 :
将酶所具有的生物催化功能 , 借助工程手段应用于社会
生活的一门科学技术;
酶工程
利用酶催化的作用 , 在一定的生物反应器中 , 将相应的
原料转化为所需要的产品;
利用酶、细胞器或细胞的特异催化功能,通过适当的反
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应器工业化生产人类所需产品或达到某种特殊目的的一
门技术科学。 ( 大唐搜索 )
领域 : 酶学理论与工程技术相结合而形成的新技术
“ 工程” 的定义 (Webster)
超越 常规实 践技 巧运用 数学 或系统 性知
识设 计有实 用价 值的复 杂体 系
酶工程
“ 酶工程”的定义
运用酶 学知 识结合 数学 和 / 或其他 系统性 知识 设
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计有实 用价值 的新 酶
( 生物催 化剂, 固定 化生物 催化 剂,生 物催 化反
应体系 , 生物 催化反 应器 。。。 )
一门研究如何发挥酶的催化功能的技术科学
课程基 础
•生物化学 ( 氨基酸,酶学 )
•蛋白质化学 ( 蛋白质纯化,蛋白质结构
)
酶工程
•微生物学
张惠展 重组 DNA 技术与基因工程
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钟扬 基因组学与生物信息学
丁建平 蛋白质结构技术
参考资 料
酶工程
http://www.lsbu.ac.uk/biology/enztech/index.html
欧阳平凯,林章凛译。《工业生物转化过程》 2005
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Andreas S. Bommarius 《 Biocatalysis 》 . 2004
内容安排 (45 分钟休 息 5 分钟 )
复习与简介
复习酶的基本概念
酶工程发展概况
酶工程
基础
学习酶 的生产 方法
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重组表 达
酶的分离提取
酶的固定化技术
酶反应器
提高
酶的改 造
教学目 标
在具备生物化学 / 酶学 / 微生物学等基本
知识的前提下
酶工程
了解蛋白质改造的基本概念,方法
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在文献调研基础上能独立设计蛋白质改造
的实验技术路线。
酶学知 识复
习
酶工程
王镜岩 《生物化学》 第 3 版 第 8 章 酶通论
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酶是什 么?
有催化活力的蛋白质
酶工程
蛋白质 一般不稳定 , 反应条件温和
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催化能力 高效性 , 专一性
- 化学选择性,区域选择性,立体选择性
The Mechanism of Enzyme Catalysis
酶与过渡态中间物的紧密结合,稳定了底物的过渡态结构,从而降低了底物
形成其过渡态所需克服的能垒,提高了反应的速度
酶学相 关定义
U 酶活力单位
1 分钟内转化 1umol 底物所需酶量
Vmax 最大反应速度
酶工程
酶分子所有的活性部位都被底物占据时的反应速度
Km 米氏常数
反应速度达到 Vmax 一半时的底物浓度
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Kcat 酶转换数
以每分钟每酶分子形成的产物的分子数表示的 Vmax
米氏方程 V max [ S ]
V=
Km + [ S ]
酶的 命名
氧、转、水、裂、异、合 ( 连 )
Oxidoreductases 氧化还原酶
Transferases 转移酶
酶工程
Hydrolases 水解酶
Lyases 裂合酶
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Isomerases 异构酶
Ligases 连接酶 ATP 水解偶
联
国际酶学委 员会 Enzyme Commission (EC)
Oxidoreductases
需解决辅因子问题
Transferases
[1.2]
工业 上用得较少
Hydrolases
工业 上用得较多
Lyases
a-D-glucopyranose a-D-fructofuranose
Ligases
基本无工业应 用
上海生科院实验生物学课程 酶工程
酶知识 复习小结
酶是有催化活力的蛋白质
酶与过渡态中间物的紧密结合,稳定了底物
酶工程
的过渡态结构,从而降低了底物形成其过渡
态所需克服的能垒,提高了反应的速度
酶活力的国际单位定义是 1 分钟内催化
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1umol 底物分子所需的酶量
酶分为 6 大类,酶的命名可以在
http://us.expasy.org/enzyme 上查询
酶工程 发展概况
上海生科院实验生物学课程 酶工程
酶的历史 酶工程 的历史
在麦芽中发现淀粉酶 18 33
在胃中发现消化酶 -- 胃蛋白酶 18 36
18 73 从小 牛胃提 取凝 乳酶用 于制 酪
Enzyme 定名 -- 意为 " 在酵母中 " 18 78
钥匙 - 锁理论提出 18 94 以米曲霉生产淀 粉酶作 为消 化酶
酶工程
中间产物学说 米氏方程 19 13
获得脲酶结晶 酶是蛋白质 19 26
19 49 液体深层发酵生产细菌 α- 淀粉酶
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固定化酶 19 53
操纵子学说 酶生物合成机制 19 60
19 69 固定 化氨基酰化酶生产 L- 氨基酸
19 73 基因工程技术
19 78 定点突变技术
19 84 TyrRS 的蛋白质工程
19 86 重组酶生产
19 93 定向进化
主要酶 制剂生产和 供应商
酶工程
世界 第二大工业 酶制剂公 司
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酶技 术公司 DNA shuffling 专利持 有者
酶的应 用领域 ( 按价值计 )
食品 45%
酶工程
洗涤剂 34%
纺织 11%
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制革 3%
制浆 / 造纸 1%
其它 6%
世界市场 ( 除了医药 ) 数十亿美元
Data from Colin Ratledge ed. Basic Biotechnolgy
生物技术产业化的三个浪潮
医药生物技术
酶工程
1982 年重组人胰岛上市
农业生物技术
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1996 年转基因大豆、玉米、油菜、相继上市
工业生物技术
世纪之交 聚交酯、生物钢、聚乳酸相继上市
三次生物技术浪潮的特点
酶工程
技术 基因工程 细胞工程 酶工程 / 代谢工程
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用途 医药 农业 几乎涉及各行业
工业生物技术( biorefinery ) 用途
燃料
-生物酒精
-生物柴油
-甲醇
- 气
-沼气
电
酶工程
热
产品
-精细化学品
-大宗化学品
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-食品
-塑料
生物质原料 转化过程 -溶
-
- 木 -粘合
-木材加工废弃物 -酸水解 / 发酵
-脂肪酸
-草 -酶 / 发酵
-醋酸
-农作物 -气 / 液发酵
- 黑、 料
-农产废弃物 -热化学加工
-燃料、香料、墨水
-废弃动物 -洗
-城市有机
理想的 生物冶炼厂
太阳能利用工厂
•制造成本最低
•净化空气与清洁环境
•运行成本最低
酶工程
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燃料 酒精发酵技 术
生物柴 油
高效 酶系统
Stephan Herrera. Industrial biotechnology – a chance at redemption. Nature Biotech 2004, 22(6):671-5
《复习 与简介》 小结
酶是有催化活力的蛋白质
酶工程
酶工程将在工业生物技术领域起越来越重要的作用
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基础篇
学习 酶的生 产方 法
重组表达系统
酶工程
酶的分离提取
酶的固定化技术
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酶反应器
酶的生 产
上海生科院实验生物学课程 酶工程
植物来 源
来源 酶 应用
刀豆 脲酶 诊断
木瓜 木瓜蛋白酶 烘焙,制酪,制革,
酶工程
嫩肉粉,啤酒澄清
无花果 无花果蛋白酶 嫩肉粉
菠萝 菠萝蛋白酶 烘焙
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辣根 辣根过氧化物酶 诊断
柠檬 β- 糖苷酶 科研
小麦 酯酶 酯水解与合成
大麦 β- 淀粉酶 烘焙,麦芽糖浆
大豆 β- 淀粉酶 烘焙,麦芽糖浆
动物来 源的工业用 酶
来源 酶 工业用途
酶工程
肝 过氧化氢酶 食品
胰腺 胰凝乳蛋白酶 制革
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胰腺 脂肪酶 食品
皱胃 凝乳酶 制酪
胰腺 胰蛋白酶 皮革
微生物 来源 的工业 用酶
Enzymea EC numberb Source Intra/extra-cellularc Scale of productiond Industrial use
Bacterial enzymes
α-Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starch
β-Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + Starch
Asparaginase 3.5.1.1 Escherichia coli I - Health
Glucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacillus I ++ Fructose syrup
Penicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - Pharmaceutical
Proteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ Detergent
酶工程
Pullulanasej 3.2.1.41 Klebsiella E - Starch
Fungal enzymes
α-Amylase 3.2.1.1 Aspergillus E ++ Baking
Aminoacylase 3.5.1.14 Aspergillus I - Pharmaceutical
Glucoamylasek 3.2.1.3 Aspergillus E +++ Starch
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Catalase 1.11.1.6 Aspergillus I - Food
Cellulase 3.2.1.4 Trichoderma E - Waste
Dextranase 3.2.1.11 Penicillium E - Food
Glucose oxidase 1.1.3.4 Aspergillus I - Food
Lactasel 3.2.1.23 Aspergillus E - Dairy
Lipasee 3.1.1.3 Rhizopus E - Food
Rennetm 3.4.23.6 Mucor miehei E ++ Cheese
Pectinasen 3.2.1.15 Aspergillus E ++ Drinks
Pectin lyase 4.2.2.10 Aspergillus E - Drinks
Proteasem 3.4.23.6 Aspergillus E + Baking
Raffinaseo 3.2.1.22 Mortierella I - Food
Yeast enzymes
Invertasep 3.2.1.26 Saccharomyces I/E - Confectionery
Lactasel 3.2.1.23 Kluyveromyces I/E - Dairy
Lipasee 3.1.1.3 Candida E - Food
Raffinaseo 3.2.1.22 Saccharomyces I - Food
微生物 酶生产率提 高的手段
菌种选育 --诱变育种
发酵工艺优化--发酵工程
酶工程
重组表达 --基因工程
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张惠展 课 进 一步
提高
分子生 物学知识复 习
理论
中心法则
操纵子理论
酶工程
工具
PCR
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限制性内切酶
连接酶
分子生 物学知识复 习
中心法则
酶工程
操纵子理论 重组蛋白质表达载体必需元件
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选择标记
启动子
核糖体结合位点
转录终止信号
复制起点
( 自主复制质粒必需 )
编码 (c)DNA
重组蛋 白质的表达
获取基因
选择表达系统
选择表达载体
酶工程
基因克隆至表达载体
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转化至表达宿主细胞
筛选转化子
生长表达蛋白质
克隆天 然酶基因
酶工程
1. 联配同类酶的已发表序列,根据保守氨基酸序列设计简
并引物扩增基因
2. 纯化酶,测定部分氨基酸序列,设计简并引物扩增基因
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3. 以方法 1 , 2 设计 DNA 探针进行 southern 杂交和 / 或
菌落杂交,筛选文库
4. 建立表达文库
利用能表达酶活性的宿主菌的表型不同进行筛选
纯化酶,制备抗体,用免疫印迹的方法筛选阳性克隆
表达系 统选择
重组表达系统 考虑因素 :
E. coli (T7, tac/trc, T5, ara …)
蛋白质产 量
酶工程
Bacillus 翻译后修 饰加工,
Pichia pastoris (aox1, gap) 折叠 ( 二硫键 ) 和糖基
化
Aspergillus niger
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蛋白质纯 化
…… 经济性
Baculovirus 可用设备
CHO
首选重组 蛋白质表 达系统-- 大肠杆
菌
G- 细菌
酶工程
生长最快
实验操作最方便
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可高密度发酵
遗传背景清楚
容易获得各种载体和宿主
Factors influencing recombinant protein production in E.coli
酶工程
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Mergulhao etal Journal Microbiol Biotechnology 2004
启动子 最关键!
E.coli 表达系统可用启 动子列表
酶工程
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常用大 肠杆菌表达 系统
trc 启动子
pTrcHIS(Invitrogen)
pKK223, pTrc99(Pharmacia)
酶工程
T7 启动子
pET(Novagen)
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pRSET, pCRT7(Invitrogen)
T5 启动子
pQE 系列 (Qiagen)
pET
首选系 统
上海生科院实验生物学课程 酶工程
改善 重组 蛋白 质的可 溶性
温度
IPTG 浓度
融合表 达
酶工程
Maltose binding protein (pMal 系列
NEB)
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Glutathione S-transferase (pGEX-T
系列 Pharmacia)
Nus Tag
Trx Tag
大肠杆 菌表达实验 策略
首选 pET 系统 , 如 pET24/BL21(DE3)
1mM IPTG 诱导
酶工程
无表达 ?Trc, T5 系统
包涵体?
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5. IPTG 浓度 (1uM, 10uM, 100uM) ,降温低至 18℃
6. 融合表达
7. 共表达分子伴侣改善可溶性
摇瓶放大
发酵罐?
大肠杆菌表达系统 小结
优点
最方便,最有效
缺点
酶工程
分泌表达能力弱
二硫键形成困难
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无翻译后修饰
提示:启动子最重要
酵母表 达系统
Saccharomyces
cerevisia http://www.invitrogen.com
Pichia pastoris
Pichia pastoris 简介
无快速碳源
而含有甲醇
,产生醇氧
化酶能占到
酶工程
细胞总蛋白
的 30%
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醇氧化酶的催化场所––
––过氧化物酶体可占到
细胞总体积的 80%
外源基因稳定整合
醇氧化酶基因的启动子强,且可
酶工程
用甲醇严格调控表达
重组蛋白质可以以胞内或胞
外形式表达
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含有真核表达系统共有的翻译后
修饰功能
有商品化宿主 / 载体,操作简便
放大方便,发酵密度极高
Pichia pastoris 表达的蛋白
酶工程
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Typical Pichia pastoris expression
vector
酶工程
MCS: Multiple cloning site
TT: AOX1 terminator
HIS4: histidinol dehydrogenase
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3’AOX1: AOX1 3’ region
Amp: Ampicillin-resistance marker
fi ori: f1 bacteriophage origin.
Sig: signal sequences
SacI, SalI, StuI and BglII cutting site are
used to linearize the vector before
transformation
Promotor
aox1 启动子:
强启动子
甲醇诱导
酶工程
葡萄糖,甘油等快速碳源阻遏
表达调控技术较成熟
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gap 启动子
组成型强启动子
葡萄糖 强启动子
甘油 中等强启动子
甲醇 弱启动子
Pichia pastoris strains
Strain Genotype Application
酶工程
KM71 his4, Selection of HIS4 expression vectors to generate strains
aox1::ARG4;arg4 with MutS phenotype
KM71H aox1::ARG4;arg4 Selection of Zeocin-resistant expression vectors to generate
strains with MutS phenotype
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SMD1165 his4prB1 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains
without protein B activity
SMD1168 his4pep4 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains
without protease A activity
SMD1163 his4pep4prB1 Selection of HIS4 expression vectors to generate strains
without protease A and protease B activity
SMD1168H pep4 Selection of Zeocin-resistant expression vectors to generate
strains without protease A
Pichia pastoris 表达实 验策略
酶工程
电转化 GS115
初筛 (50ml 离心管 ) 有表达 复筛 (250ml 摇瓶 ) 发酵罐
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无表 达
pPIC3.5K
Pichia pastoris 表达系统小
结
优点
有商品化宿主 / 载体,操作简便
酶工程
真核表达系统
重组蛋白质可以以胞内或胞外形式表达
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高密度发酵方便
有翻译后加工
缺点
翻译后加工形式有独特性
重组酶 表达小结
首选文献报道表达系统
次选大肠杆菌
酶工程
大肠杆菌中无活性 选用酵母系统
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根据基因来源定表达系统
Bacillus
Streptomyces
Aspergillus niger
发酵工程
。。。
基因工程菌发酵相对较简单
酶工程
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酶的分 离提取
参见蛋白质纯化手册
酶制备 流程
图
纯度 vs 成本
Cost Cost
Relative Yield Specific Total
Step Per Per
weight (%) activity cost
weight activity
酶工程
1.000 100 1 1.00 1 1.00
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1 0.250 75 3 1.10 4 1.47
2 0.063 56 9 1.20 19 2.13
3 0.016 42 27 1.30 83 3.08
4 0.004 32 81 1.40 358 4.92
5 0.001 24 243 1.50 1536 6.32
工业离 心
真空转 鼓离心机
细胞破 碎手段
超声波 目前只用于实验室或小规模
高压匀浆机 (high pressure homogenizer)
酶工程
珠磨机 (bead mills)
freeze-presses 小规模
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渗透压冲击法
自发分解 (yeast, Bacillus)
酶裂解 ( 溶菌酶 )
细胞破 碎需考虑因 素
All mechanical methods require a large input of energy, generating heat. Cooling is
Heat essential for most enzymes. The presence of substrates, substrate analogues or
polyols may also help stabilise the enzyme.
Shear forces are needed to disrupt cells and may damage enzymes, particularly in the
Shear
presence of heavy metal ions and/or an air interface.]
Disruption of cells will inevitably release degradative enzymes which may cause serious
酶工程
loss of enzyme activity. Such action may be minimised by increased speed of
Proteases processing with as much cooling as possible. This may be improved by the
presence of an excess of alternative substrates (e.g. inexpensive protein) or
inhibitors in the extraction medium.
Buffered solutions may be necessary. The presence of substrates, substrate analogues
pH
or polyols may also help stabilise the enzyme.
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Some enzymes may suffer conformational changes in the presence of detergent and/or
solvents. Polyphenolics derived from plants are potent inhibitors of enzymes. This
Chemical
problem may be overcome by the use of adsorbents, such as polyvinylpyrrolidone,
and by the use of ascorbic acid to reduce polyphenol oxidase action.
Reducing agents (e.g. ascorbic acid, mercaptoethanol and dithiothreitol) may be
Oxidation
necessary.
Foaming The gas-liquid phase interfaces present in foams may disrupt enzyme conformation.
Heavy metal ions (e.g. iron, copper and nickel) may be introduced by leaching from the
Heavy-metal
homogenisation apparatus. Enzymes may be protected from irreversible
toxicity
inactivation by the use of chelating reagents, such as EDTA.
Manton-Gaulin 匀浆机
酶工程
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从澄清 液中提取酶
超滤
硫酸铵沉淀
酶工程
浓缩
有机溶剂沉淀
热处理 去不耐 热的杂蛋白
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双水相
上海生科院实验生物学课程 酶工程
胞内酶 纯化 去除核 酸
非特异性 硫酸铵沉淀
特异性 带正电荷材料
酶工程
( 与核酸带负电的磷酸基团作用形
成复合物 )
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聚乙烯亚胺,阴离子洗涤剂十六烷
基三乙基溴化铵,硫酸链霉素,硫
酸鱼精蛋白
牛胰核酸酶
色谱 (层 析)
离子交换色谱
吸附色谱
酶工程
亲和色谱
疏水色谱
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凝胶排阻色谱 (分子筛)
酶制剂
使用添加剂
酶工程
共价修饰
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固定化
小结
酶的来源很多,但主要来源于微生物发酵
酶的工业化应用取决于他们的效果,成本和安全性
离心一般用于收集含酶固体
酶工程
过滤更多用于液体酶回收
双水相体系将会在酶回收操作中得到更多应用
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制备工业用酶需尽量压缩分离提取步骤
酶制剂必须稳定,使用安全
固定化 酶优点
便于从反应体系中分离
从而易于控制反应时间,减少酶失活
酶工程
可反复使用
降低用酶成本
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提高酶稳定性
缺点
传质限制
动力学性质发生变化
固定化增加额外成本
酶的固定化方法
a. 吸附
b. 共价连接
c. 包埋
d. 膜限制
固定化 酶方法比较
Covalent Membrane
Characteristics Adsorption Entrapment
binding confinement
Preparation Simple Difficult Difficult Simple
酶工程
Cost Low High Moderate High
Binding force Variable Strong Weak Strong
Enzyme leakage Yes No Yes No
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Applicability Wide Selective Wide Very wide
Running Problems High Low High High
Matrix effects Yes Yes Yes No
Large diffusional barriers No No Yes Yes
Microbial protection No No Yes Yes
多点作 用使酶稳定 化
固定化 载体
酶工程
Eupergit C®
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Sepabeads® series
Amberzyme™ Oxirane
Immobilized Penicillin G Acylase
Bacillus megaterium Penicillin G Acylase on Eupergit®C
Cycle number : 1000
Productivity :
800 Kg 6-APA/Kg (wet form )
酶工程
520 Kg 7-ADCA/Kg (wet form )
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Immobilized D-amino acid oxidase and glutaryl acylase
新型固 定化方法 —无载体固 定化
酶工程
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The different approaches to the production of carrier-free immobilised enzymes:
(b) crystallization; (b) aggregation; (c) spray-drying; (d) direct cross-linking.
AGG, aggregates; CRY, crystals; SDE, spray-dried enzyme.
固定化 酶小结
酶的固定化使得他们能高效和连续使用
酶的固定化形式有 4 种
酶工程
酶的固定化影响动力学性质
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酶的固定化一般可提高其使用的经济性
酶的固定化新技术--无载体固定化
酶反应 器图解
基础篇 小结
重组微生物将是酶的最重要来源
工业用酶的分离提取对成本敏感
酶工程
固定化酶是工业用酶制剂的重要形式
酶反应器对于发挥酶的催化作用也很重要
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提高篇
酶的改 造
获得新酶的途径
自然界中获 取
酶工程
有理设计新 酶
随机方法筛 选新酶
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生物多样性与新酶的发现
嗜热菌( Thermophiles)
嗜冷菌( Phyphophiles)
酶工程
嗜酸菌( Acidophiles)
嗜碱菌( Alkaliphiles)
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嗜盐菌( Halophiles)
嗜压菌( Barophiles)
极端微生物的特殊生长环境及代谢产物,使
酶在“恶劣”环境下能够发挥高效催化作用。
上海生科院实验生物学课程 酶工程
酶工程
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目前已经有 158 种微生物的基因组被全测序
Distribution for
penicillin G acylase
S α I β
天然酶
自然进化中 天然酶的结构功能对应于其活细胞的
生理功能而进化的
酶工程
天然酶往往不适用于生物技术应用
•化学 - 转化天然底物
•环境不同
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•物理 - 耐受差
•要求不同
•生物 - 代谢调控和高转换数
生物催化剂应用依赖于天然酶改造或重新设计方法
改造目 的
•高专一 性
酶工程
只催化所需反应 减少甚至没有副产物
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•高活性
高生产率 不易受抑制
•高稳定 性
存放时间长 操作稳定性高
酶的改 造
化学修饰
固定化
酶工程
基因工程,结构生物学和生物信息学
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蛋白质工程--理性设计
通过蛋白质化学、蛋白质晶体学和动力学的研究获取关于
蛋白质物理、化学等方面的信息,在此基础上对编码该蛋
白的基因进行有目的的设计改造,并通过基因工程等手段
将其进行表达和分离纯化,最终将其投入实际应用。
定向进化--非理性设计
Timeline | 20 years of protein engineering
酶工程
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CDR, complementarity-determining regions: TyrRS, tyrosyl-tRNA synthetase
酶工程
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(c)DNA 序列 蛋白质序列 立体结构 功能
蛋白质功能= f( 蛋白质序列 )
改变序列影响 蛋白质功能
b
∑ 20
n
= 20 a + 20 a +1 + ... + 20 b −1 + 20 b
a
蛋白质 序列空间
n 个氨基酸残基组成的线性长链的序列空间为 20n
∑ 20
n a +1 b −1
= 20 + 20 a
+ ... + 20 + 20 b
酶工程
a
a 表示最小蛋白质的氨基酸残基数, b 表示最大蛋白质的氨基酸残基数。
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所有蛋白质都可以表示为这个 b 维空间的唯一一点,比如枯草芽孢杆菌蛋
白酶 BPN’ 坐标为( A,Q,S,V,P,Y,G,V,S,Q,I,K,A,…, A,Q,0,…,0,0,0 )。
酶工程
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有理设 计
根据详尽的结构功能关系知识
结构
一级结构 氨基酸顺序
酶工程
二级结构 - 螺旋 , β- 折叠 , 转角 , 无规卷曲
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功能
活性位点 氨基酸残基和辅因子
催化 机理 , 特异性和动力学
调节 竞争性抑制和变构控制
怎么获得这 些信息?
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序列与 结构分析
多重联配 序列保守性信息
酶工程
结晶 / 同源模建 获得立体结
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构
三维结构分析 分子图像分析
多重联 配
ClustalW
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Glutaryl acylase crystal and structure
酶工程
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Ding Y etal. 1GHD.PDB 2000
Structural studies of D-hydantoinase from Burkholderia pickettii
酶工程
affinity column
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A Ribbon diagram showing the overall structure of
DHase monomer and tetramer viewed from the
Crystals: 18% PEG6K, 0.1 M
catalytic active site.
Bicine, pH 8.5, 0.01 M CdCl2. Xu Z etal Journal of Bacteriology 2003
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有理设 计目标
催化效率
稳定性
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热稳定性
有机溶剂稳定性
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pH 曲线
常用提高稳定性方法
引入二硫键和 / 或盐桥
提高热 稳定性的重 要全局性因素
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•环区长度减少以及随之而来的二级结构增加
•表面电荷相互作用
•敏感氨基酸残基减少
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( 如半胱氨酸,天冬酰胺和谷氨酰胺 )
•芳香环堆积增加
•疏水作用增加
•金属离子结合能力提高
•寡聚增加
Jason K Yano and Thomas L Poulos. New understanding of thermostable and peizostable
enzymes. Current opinion in Biotechnology, 2003, 14:1-6
Index 1 Index 2 Index 3 Index 4 Index 5
酶工程
O O O O O
O O O O O
C C C C C
C C C C C
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0<OSP<0.15 0.15<OSP<0.30 0.30<OSP<0.45 0.45<OSP<0.60 0.60<OSP<0.75
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ILE 高
ARG 高 高
GLU 高 高 显著
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LYS 低
TRP 高
TYR 高
ASN (低) 低 (低)
SER 低 低 低 显著
MET 低
PRO 高
对于热稳定性改造的具体指导
完全 暴露 SER,LYS ILE
暴露 ALA,VAL,ASN,SER ARG,GLU
酶工程
部分 包埋 / 部分 暴露 SER ?
包埋: MET ARG,GLU
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完全包埋: ? ALA,TRP,TYR,PRO
pH 曲线的改变
将蛋白质表面变得更带负电荷将提高酸性基团
的 pKa 值,因为它们在离子化时丢失质子。反
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之,将表面变得更带正电荷则降低所有酸性基
团的 pKa 值。
低离子强度时变化将最大
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如果避免多电荷抗衡离子,当离子强度高至 0.1
M 时会出现明显的变化。
突变设计应避免在活性中心空穴附近聚集抗衡
离子。
Russell and Fersht. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge.
Nature,1987, 328 (6), 496-500
融合蛋 白质--广 义的有理设计
酶工程
(glutathione synthetase, GST)
•麦芽糖结合 蛋白质
(maltose binding protein, MBP)
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•内含肽 (Intein)
•各种信号肽
94kd
66kd
β subunit
43kd
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34kd
α subunit
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20kd
14kd
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目标片 段的指数扩 增
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定向突变 - PCR
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有理设 计小结
工具
酶数据库 Brenda
序列联配 ClustalW
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同源模建 Swissmodel
分子图像 Rasmol
定点突变,序列重组 PCR
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目标
热稳定性, pH 曲线 表面氨基酸替换
催化效率 ?
底物特异性 ?
生物催 化剂的定向 进化
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高频随 机突变导入 方法
DNA 聚合酶 碱基错配率 / 每轮复制
大肠杆菌体内 1 X 10-10-10-8
Replicase 1.03 X 10-4
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Vent(exo-) 1.9 X 10-4
Taq 2.0-21 X 10-5
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KlenTaq 5.1 X 10-5
Vent 2.4-5.7 X 10-5
Pfu, PfuTurbo 1.6 X 10-6
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突变率 0.1 - 1.6% /PCR, 相当于 1 - 7 个碱基突变 /
基因
高频随 机突变导 入方法
以大肠杆菌 XL1-Red 作为基因复制宿
主 endA1 gyrA96 thi-1
XL1-Blue strain: recA1
hsdR17 supE44 relA1 lac [F'proAB lacIq
ZΔM15 Tn10 (Tetr)]
正常菌株
XL1-Red strain: endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17
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supE44 relA1 lac mutD5 mutS mutT Tn10
(Tetr)
DNA 修复缺陷
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Mutants of the P. furiousus Alkaline Phosphatase Gene:
Morphology of clones on LB plates containing BCIP
indictor substrate.
A: Parent Pfu alkaline phosphatase clone.
B: Pfu 5. C: Pfu 5-1. D: Pfu 5-2.
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进化 达尔文进化理论
逐步过程
生命的复杂性是突变,重组和自然选择算法
的结果
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自然进化
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• 自发突变
• 重组
• 自然选择
加速进化 人类的作物,花卉和家禽家畜
快速改变
育种实践有几千年历史
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农业 进化
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• 自发突变
• 育种
• 筛选
革命 实验室进化不同于自然进化在于其明确
极快改变 的进化目标 . 在此意义上它是 “定向”
并且更像育种。此外,它非常快。
酶工程
实验 室进 化
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• 加快突变速度
• 分子育种
• 筛选
进化 加速进化 革命
逐步过程 快速改变 极快改变
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自然 进化 农业 进化 实验 室进 化
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• 自发突变 • 自发突变 • 加快突变速度
• 重组 • 育种 • 分子育种
• 自然选择 • 筛选 • 筛选
Error-prone DNA
PCR shuffling
Homo-duplex formation
PCR
* 5’ *
* 5’
酶工程
* *
* 5’ *
DNaseI * 5’
* Denature & anneal
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* *
5’ **
*
* 5’
PCR
fill in & amplify
* *
5’ * * 3’
*
* * 3’ * * 5’
library screen and select
* *
DNA Shuffling
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DNA shuffling – β-lactamase case
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β-Lactamase TEM-1 W.T.
: hydrolysis of beta-lactam antibiotics MIC = 0.02 ug/ml
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Cefotaxime
periplasm X 16,000
Back cross over - 2 cycle
degrade
X 32,000
β-lactamase
MIC = 640 ug/ml
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Accumulation of mutations by sequential mutagenesis,
pairwise recombination and poolwise recombination
酶工程
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单基 因 Shuffling 和多 基因 Shuffling 获得的 突变库
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DNA Family shuffling
Parental Random
Sequences Fragmentation
Denaturization Annealing Extention Final Library
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Repeated Cycles of Primerless PCR crossover
定向进 化的基本过 程
Single gene Multiple genes
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DNA shuffling DNA family shuffling
Repeated
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as needed
Expression and screen
Comparison of single sequence shuffling versus sequence family shuffling
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Staggered Extension Process(StEP)
DNA DNA
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Denaturation , Extension
Annealing
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Denaturation , Extension
Annealing
RACHITT 示意图
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1. 两种野生型基因 A 和 B 双链 DNA
处理成单链 DNA 。
2. DNaseI 处理单链 DNA ,形成许多
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的随机大小的片段。
3. 随机片段与单链模板杂交。
4. 通过两端引物的 PCR 扩增反应得
到具有目的片段大小的杂合基因。
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Homo-duplex formation Hetero-duplex formation
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
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PCR PCR
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’
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enzymes
(ITCHY)
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对随机挑选的混组酶进行测序证明
ITCHY 比普通混组方法在两个基因
的非同源区发生了更多的交叉。而
且通过 ITCHY 发现的嵌合酶比普
通 DNA 混组方法获得杂合酶的活
性相同或更高。
Sequence
Homology-
Independent
Protein
酶工程
Recombinatio
n (SHIPREC)
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应用于膜结合人细胞色素
P450 和可溶性细菌 P450
亚铁血红素结构域的混组
,将混组基因库和氯霉素
乙酰基转移酶基因融合,
筛选到 2 个在细菌中可溶
性比人 P450 高的 P450 杂
合酶。
实验室进化 - 进化方法比较
• error-prone PCR
2-6 nucleotide mutations / DNA molecule
1-3 amino acid substitutions / protein molecule
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• DNA shuffling
high homology at DNA level (> 60% identity)
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- fragmentation by DNase (multiple
recombination)
- restriction enzymes (multiple recombination)
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selection 选择 screening 筛选
高碘酸 盐介 导的荧 光测 活法
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定向进化的应用
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Gene
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Vaccine Therapy
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1990 ’94. Diversa
DNA shuffling ’94
’97. Maxygen
Family shuffling ’98
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Genome shuffling ’02 ’99.00. IPOs; Maxygen, Diversa, AME,
Genencor
Genetic circuit ’02
’02. Codexis & Verdia spinoff
1st industrial 2000
biotechnololgy & ’03. AME merger to Lilly
bioprocessing ’04
’04. Dupont, aq. Verdia(MaxyAg)
’04. Codexis & Pfizer collaboration
定向进化的局限性
筛选包含所有可能突变体的库不现实:
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含 100 氨基酸的酶 : 有 20100 种可能组
合
• 找到减少所需库容量的方法
选择亲本基因
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• 发展高效快速的筛选方法
发展智能测定
定向进 化小结
定向进化是更有效的蛋白质改造方法
突变 / 重组方法成熟
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筛选能力是成败关键
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有
理
设
计
与
酶工程
定
向
进
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化
的
有
机
结
合
将
小结 蛋白 质工程实验 策略
• 选择起始基因重组表达,建立测活体系和 / 或筛选方法
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• 如果知道结构功能关系,第一步先采用有理设计方法
• 此后,以随机突变技术微调得到的突变体 , 并辅以高效
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的体内或体外筛选
谢谢!
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课后请 多提宝贵意 见
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助我进步 , 再次谢 谢大
家!