重组 DNA 技术与基因工程

1 重组 DNA 技术与基因工程的基本概念
2 重组 DNA 技术与基因工程的基本原理
3 重组 DNA 技术所需的基本条件
4 重组 DNA 技术的操作过
5 程
目的基因的克隆与基因文库的构建
6 外源基因在大肠杆菌中的表达
7 外源基因在酵母菌中的表达
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
 6 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的优势

全基因组测序，共有 4405 个开放型阅读框架

基因克隆表达系统成熟完善

繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定

被美国 FDA 批准为安全的基因工程受体生物

 6 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

大肠杆菌表达外源基因的劣势

缺乏对真核生物蛋白质的复性功能

缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统

内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白

细胞周质内含有种类繁多的内毒素
 6 外源基因在大肠杆菌中的表达

B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理

启动子

终止子

核糖体结合位点

密码子
质粒拷贝数
 启动子 目的基因
E E
启动子最佳距离的探测 A

目的基因 A 酶切
E E
开
启动子
Bal31 酶
解
 启动子
启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的 DNA 片 终止密码子

克隆到启动子探针质粒 pKO1 上
段 Apr
pKO1 galK
受体细胞染色体 DNA 上的 galE 、 galT
粒上报告基因 galk 的表达产物联合作用，
与质
ori
可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质

转化 galE+ 、 galT+ 、 galK- 的大肠杆菌受体

菌株
含有外源启动子活性的重组克隆
 启动子
启动子的构建

启动子 -35 区序列 -10 区序列

PλL T T G A C A G A T A C T
PrecA T T G A T A T A T A A T
PtraA T A G A C A T A A T G T
Ptrp T T G A C A T T A A C T
Plac T T T A C A T A T A A T
Ptac T T G A C A T A T A A T

Ptac = 3 Ptrp = 11 Plac

 启动子
启动子的可控性 基底水平转录

乳糖启动子 Plac 的可控性： 阻遏蛋白

野生型的 Plac 与其控制区 Olac

偶联在一起，在没有诱导物 P O

存在时，整个操纵子处于基 乳糖 异丙基 -β-D-

诱导
硫代半乳糖苷
底水平表达；诱导物可以使
（ IPTG ）
启动子 Plac 介导的转录大幅
高效转录
提高

P O
 启动子
启动子的可控性
乳糖启动子 Plac 的可控性： cAMP 高效转录
野生型的 Plac 上游附近拥有 CAP

代谢激活因子（ CAP ）结合

Plac O
区， cAMP 激活
CAP ， CAP
结合启动子控制区，进而促 葡萄糖代谢 cAMP 浓度降

进 Plac 介导的转录。葡萄糖 低 基底水平转录

代谢使 cAMP 减少，也能阻
遏 Plac 介导的转录。因此， Plac O
基因工程中使用的乳糖启动 高效转录
子均为抗葡萄糖代谢阻遏的
突变型，即 Plac UV5 Plac UV5 O
 启动子
启动子的可控性 色氨酸
基底水平转录
阻遏蛋白
色氨酸启动子 Ptrp 的可控性：

色氨酸启动子 Ptrp 受色氨酸 - 阻 Ptrp Otrp

蛋白复合物的阻遏，转录呈基底
遏 除去色氨酸 或加 3- 吲哚丙烯
状态。在培养系统中去除色氨酸 酸
或者加入 3- 吲哚丙烯酸（ IAA ） （ IAA 高效转录
）
便可有效地解除阻遏抑制作用。
，
在正常的细菌培养体系中，除去 Ptrp Otrp
色氨酸是困难的，因此基因工程
高效转录
中往往添加 IAA 诱导 Ptrp 介导的
基因的表达
目
Ptrp Otrp
 启动子
启动子的可控性
阻遏作用
噬菌体启动子 PλL 的可控性
目的基因
： cI857
噬菌体启动子 PL 受 CI 阻遏蛋白
Ptrp PL
遏，很难直接诱导控制。在基因
阻
A B
工程中常使用温度敏感型的 cI 突
变基因 cI857 控制 PL 。 cI857 阻遏
蛋 42℃ 时失活脱落， PL 便可介
在
色氨酸 表达
目的基因的表达。但在大型细菌
导
培养罐中迅速升温非常困难，因 Ptrp PL
此常使用一个双质粒控制系统， A B
用色氨酸间接控制目的基因表达
 终止子
强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑
过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：
转录产物越长， RNA 聚合酶转录一分子 mRNA 所需的时间就相应增加，外源
基因本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA 功能区域，如选择性标
记基因和复制子结构等，则 RNA 聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生
物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；
过长的 mRNA 往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗；
更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外
源基因编码产物的翻译效率
 终止子
强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的
终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子
上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tcr

Tφ 。对于一些终止作用较弱的终止子
Apr pCP1
，通常可以采用二聚体终止子串联的
特殊结构，以增强其转录终止作用
终止子也可以象启动子那样，通 ori
过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基
筛选 Apr 、 Tcs 的转化
因组 DNA 中克隆筛选
子
 核糖体结合位点

外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动
的频率，而且在很大程度上还与 mRNA 的翻译起始效率密切相关
。大肠杆菌细胞中结构不同的 mRNA 分子具有不同的翻译效率，
它们之间的差别有时可高达数百倍。 mRNA 翻译的起始效率主要
由其 5‘ 端的结构序列所决定，称为核糖体结合位点（ RBS ）
 核糖体结合位点
核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素：
位于翻译起始密码子上游的 6-8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’ ，
即 Shine-Dalgarno （ SD ）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚
基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合，
将 mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译；
翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG 作为阅读框架的起
始位点，但有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子；
SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成；
基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列
 核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD 序列的影响：

一般来说， mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始

效率就越高，而这种结合程度主要取决于 SD 序列与 16S rRNA
的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。对多数基
因而言，上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T ，均会导致翻译效
率大幅度降低
 核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD 序列与起始密码子之间的序列的影响：
SD 序列下游的碱基若为 AAAA 或 UUUU ，翻译效率最高；
而 CCCC 或 GGGG 的翻译效率则分别是最高值的 50% 和
25% 。紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于
大肠杆菌 - 半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在这个位置上最佳的碱
基组合是 UAU 或 CUU ，如果用 UUC 、 UCA 或 AGG 取代之，
则酶的表达水平低 20 倍
 核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
SD 序列与起始密码子之间的距离的影响：

SD 序列与起始密码子之间的精确距离保证了 mRNA 在核糖

体上定位后，翻译起始密码子 AUG 正好处于核糖体复合物结构中
的 P 位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下， SD 序列位
于 AUG 之前大约七个碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱
基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低
 核糖体结合位点
核糖体结合位点对外源基因表达的影响
起始密码子及其后续若干密码子的影响：
大肠杆菌中的起始 tRNA 分子可以同时识别 AUG 、 GUG 和
UUG 三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常 GUG 为 AUG
的 50% 而 UUG 只及 AUG 的 25% 。除此之外，从 AUG 开始的前
几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与 mRNA 的 5’
端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰 mRNA 在核糖体上的准
确定位
目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有
与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的
 密码子
生物体对密码子的偏爱性
不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码
子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：
生物基因组中的碱基含量 在富含 AT 的生物（如单链 DNA 噬
φX174
菌体 ）基因组中，密码子第三位上的 U 和 A 出现的频率较高；而在
丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有
GC G 或 C 的简并密码
子 90% 以上的绝对优势
占
密码子与反密码子相互作用的自由能 性中等强度规律
如 GGG 、 CCC 、 GCG 、 GGC 、 AAA 、 UUU 、 AUA 、 UAU 等
如 GUG 、 CAC 、 UCG 、 AGC 、 ACA 、 UGU 、 AUC 、 UUG 等
使用少；
细胞内 tRNA 的含量
使用多；
 密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响

由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较
大程
大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高

效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略

可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：

外源基因全合成

同步表达相关 tRNA 编码基因

 密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
外源基因全合成

按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适
宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在
大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法
 密码子
密码子偏爱性对外源基因表达的影响
同步表达相关 tRNA 编码基
因对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分
子量又较大的外源基因而言，则选择相关 tRNA 编码基因同步克隆表
达的策略较为有利。例如，在人尿激酶原 cDNA 的 412 个密码子中，
共含有 22 个精氨酸密码子，其中 7 个 AGG 、 2 个 AGA ，而大肠杆
菌受体细胞中 tRNAAGG 和 tRNAAGA 的丰度较低。为了提高人尿激酶原
cDNA 在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个 tRNA 编码基
因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有
效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用
 质粒拷贝数
质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响

目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达
数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生
长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。质粒分子的过度增
殖以及其后目的基因的高效表达势必会影响受体细胞的生长代谢，进
而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降

解决上述难题的一种有效策略是将重组质粒的扩增纳入可控制的
轨道
 质粒拷贝数
质粒扩增时序的控制

pCP3 拥有一个温度可诱导型的复制子 MCS

PL
在 28℃ 时，每个细胞的质粒拷贝数为 60
在 42℃ 时，拷贝数迅速增至 300 - 600
在此温度下，受体细胞染色体上的 CI 基 pCP3
因表达的温度敏感型阻遏蛋白 Apr ori
失活 因此，用一种手段同时控制质
粒拷 贝数和基因的表达
6 外源基因在大肠杆菌中的表达
C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略

包涵体型异源蛋白的表达
分泌型异源蛋白的表达
融合型异源蛋白的表达
寡聚型异源蛋白的表达
整合型异源蛋白的表达
蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体及其性质
在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它
们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不
溶性的结构称为包涵体（ Inclusion Bodies ， IB ）。富含蛋白质的包
涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这
些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，
从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合
成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形
式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的
DNA 、 RNA 和脂多糖等非蛋白分子
 包涵体型异源蛋白的表达
以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的优点：

能简化外源基因表达产物的分离操作

包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体
经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂
解物中分离出来
能在一定程度上保持表达产物的结构稳定

在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组
蛋白的稳定性已构不成威胁
 包涵体型异源蛋白的表达
以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点
包涵体表达形式的缺点：

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须
通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而
具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标
产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋
白分子中的 Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当
低，一般不超过 30%
 包涵体型异源蛋白的表达
以包涵体形式表达目的蛋白的操作

如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源
基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量 20% 以上时，表达
产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操
作的关键就是选择高表达的载体。事实上，这种高表达率也是包涵
体法的长处所在
 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作 C1 C2 Cn C

蛋白质变性复性的动力学原理：
U I1 In N
N 天然状态的蛋白质
U 变性状态的蛋白质
C 共价修饰的蛋白质 X1 X2 Xn X
A 集聚状态的蛋白质
I 有效变复性过程中的中间状态
Ag Ag Ag Ag
X 脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态

在细菌细胞内，集聚状态和共价修饰的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为
无活性的蛋白质。包涵体中的蛋白质就属于这两种状态，因此需要在体外进行人
工变性（解除共价修饰和驱散集聚体）复性操作
 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的溶解与变性：
包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次
在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。能有效促进
级键
包涵体溶解变性的试剂和条件包括：
清洗剂 SDS 、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响
促溶剂
复性和纯化 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但
常被自发 形成的氰酸盐污染，后者能与多肽
混合溶剂
链中的氨基反应 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解
力增强 极端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端 pH 条件下发生
修饰反应
 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作

包涵体的复性与重折叠（ refolding ）
：
包涵体的复性与重折叠的主要任务
是：
将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠

通过次级键的形成使蛋白质复性
 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的复性与重折叠（ refolding ）：复性操作

包涵体复性操作的方法包
括： 一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大

分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生

试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、 PEG 、 Ca2+

蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚

产物隔离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞

分子伴侣法， GroEL 、 GroES 、 DnaK ，固定化，共表达

 包涵体型异源蛋白的表达
包涵体的变性与复性操作
包涵体的复性与重折叠（ refolding ）：二硫键形成
在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防
止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新
配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：
化学氧化法（ A ）需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成
是 随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折
二硫键交换（ B ）需要还原型和氧化型谷胱甘肽（ GSH 和 GSSG ），二硫
叠
键 形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好
S
HS A S HS B S-S-R
+ 2e + 2H+ + R-S-S-R S
HS S HS HS 2R-SH
 分泌型异源蛋白的表达

在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形
式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过
运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白
产物 N 端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件
 分泌型异源蛋白的表达
以分泌形式表达目的蛋白的优缺点
分泌表达形式的优点：

目的蛋白稳定性高 重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳
稳定性大约是在细胞质中的 10 倍
目的蛋白易于分离
目的蛋白末端完整 相当多的真核生物成熟蛋白 N 端并不含
有
甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质
N 端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠
杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其
N 端 的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去
 分泌型异源蛋白的表达
以分泌形式表达目的蛋白的优缺点
分泌表达形式的缺点：

相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不
健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，
少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方
式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆
菌尽管有，但并不普遍
分泌型异源蛋白的表达 Ä¿±êµ°°×

蛋白质的分泌机制 ÐźÅëÄ

原核细菌周质中含有多
ÄÚĤ
种分子伴侣可阻止分泌 °ûÄÚ ++++

蛋白的随机折叠，分泌
在细胞周质或培养基中
ÖÜÖÊ
的重组蛋白很少形成分
ÐźÅëļôÇÐÃ¸Ï µ ++++
子间的二硫键交联，因
此与包涵体相比，分泌 Í âĤ

型重组蛋白具有较高比
例的正确构象，生物活
性的回收率增加，且对
°ûÍ â
蛋白酶不敏感 °û±Ú
 分泌型异源蛋白的表达
分泌型目的蛋白表达系统的构建
包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接
泌
分到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌
到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内
上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。
因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒
即
上可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号
肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并
使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重
组大肠杆菌中的完全分泌。
 融合型异源蛋白的表达

除了直接表达异源蛋白外，还可将外源基因与受体菌自身的蛋白
质编码基因拼接在一起，并作为一个开放型阅读框架进行表达。由这
种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。在这种融合蛋白结构中，
通常受体细菌的蛋白部分位于 N 端，异源蛋白位于 C 端。通过在
DNA 水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位
点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白
 融合型异源蛋白的表达
以融合形式表达目的蛋白的优缺点

目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳
目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗体、配体、底物进
行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白
目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件
目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在
胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性
目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获
目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段
 融合型异源蛋白的表达
融合型目的蛋白表达系统的构建
融合蛋白表达质粒的构建原则：
受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和
层析进行特异性简单纯化
外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终
止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目
的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，
为目的蛋白分离回收创造条件
两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着
融合蛋白的裂解工艺
两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架
 融合型异源蛋白的表达
融合型目的蛋白表达系统的构建
用于融合蛋白构建的受体蛋白：

谷胱甘肽转移酶（ GST ） 维持良好空间构象

麦芽糖结合蛋白（ MBP ） 促进分
金黄色葡萄球菌蛋白 A （ SAPA ）
泌 免疫亲和层析
pRIT2T
硫氧化还原蛋白（ TrxA ） 维持良好空间构象
pTrxFus
外膜蛋白（ OmpF ） 促进分泌
β- 半乳糖苷酶（ LacZ ） 免疫亲和层析
泛素蛋白（ Ubi ） 维持良好空间构象
 融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收

融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白
的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应
，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋
白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断
裂方法有两种：

化学断裂法

酶促裂解法
 融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收
化学断裂法：
用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为溴化氰（ CNBr ）
它与多肽链中的甲硫氨酸残基侧链的硫醚基反应，生成溴化亚氨内
酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段
其中上游肽段的甲硫氨酸残基转化为高丝氨酸残基，而下游肽段 N
端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可
达到 85% 以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的 N 端不含
甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。然而，如
果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法
 融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收 蛋白内切酶 切割位点
酶促裂解法：单残基位点
梭菌蛋白酶
蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，
Arg-C
葡萄球菌蛋白酶 Glu-
同时每种蛋白酶均具有相应的断裂位点决定
C
假单孢菌蛋白酶
簇，因此可供选择的专一性断裂位点范围较
广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白 Lys-C
猪胰蛋白酶

酶分别在多肽链中的精氨酸、谷氨酸、赖氨 Arg-C Lys-C

酸残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的
下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。 受体蛋白 目的蛋白
用上述蛋白酶裂解融合蛋白的前提条件是外 N Arg C N C
源蛋白分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸或
赖氨酸残基，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但
大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的
 融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收
酶促裂解法：多残基位点
为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性
，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一
段编码寡肽序列（ Ile-Glu-Gly-Arg ）的人工接头片段，该寡肽为具
有蛋白酶活性的凝血因子 Xa 的识别和作用序列，其断裂位点在
Arg 的 C 末端。纯化后的融合蛋白用 Xa 处理，即可获得不含上述
寡肽序列的目的蛋白。由于 Xa 的识别作用序列由四个氨基酸残基
组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方
法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物
 融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收
酶促裂解法：多残基位点 亲和层析

启动子 受体基因 接头 目的基因 表达

Met Arg Stop

Lys
Glu Ile-Glu-gly-Arg
Arg
Ile-Glu-gly-Arg 酶解回收
Lys
Glu
 融合型异源蛋白的表达
目的蛋白的回收
酶促裂解法：多残基位点 T7 tac

生物素结合肽编码序列
ori
Pinpoint Xa
Xa 因子识别位点编码序列
Xa 因子切割位
点 MCS
Apr SP6
Ile G lu Gl y A rg Gl u

Xa-1 ATC G AA GG T C GC GA A GCT T CA GC T G GG AT C CGG T AC CG A T AT CA G ATC T CC CG G

GGC G GC CG C
Xa-2 ATC G AA GG T C GC GA A AGC T TC AG C T GG GA T CCG G TA CC G A TA TC A GAT C TC CC G
GGG C GG CC G C
Xa-3 ATC G AA GG T C GC GA A AAG C TT CA G C TG GG A TCC G GT AC C G AT AT C AGA T CT CC C
GGG G CG GC C GC
NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI
 寡聚型异源蛋白的表达
从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷
贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，
还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随
着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用
于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不
济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量
往往不能获得满意的效果。

另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是
构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一
个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略
 寡聚型异源蛋白的表达
以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点
目的蛋白高效表达
在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以
在一定程度上改善表达量
稳定表达小分子短肽
短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。
串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶
降解的能力大幅度提高
目的产物回收困难
寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但裂解后
的短肽分子容易出现序列不均一性
 寡聚型异源蛋白的表达
寡聚型目的蛋白表达系统的构建
基本战略：
P SD gene gene gene gene T1 T2

mRNA

Met Met Met Met

H2N COOH

CNBr
 寡聚型异源蛋白的表达
寡聚型目的蛋白表达系统的构建
EcoRI Bgl II BamHI
构建举例：
EcoRI BamHI AATTCAGATCT G
P SD T1 T2 GTCTAGA CCTAG

EcoRI + BamHI Bgl II

EcoRI BamHI
Bgl II
EcoRI BamHI BamHI
Bgl II

Bgl II + BamHI EcoRI BamHI

GATCT G
A CCTAG
 整合型异源蛋白的表达
以整合形式表达目的蛋白的优缺点
目的基因稳定表达
整合型的目的基因随受体细胞染色体 DNA 的复制而复制，在大
多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续
培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目
的的基因工程案例特别有意义
目的基因表达率低
单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达
元件而加以补偿
 整合型异源蛋白的表达

DNA 体内重组的基本原理

在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着
DNA 的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种
群的进化。细胞内的遗传重组可分为两大类：

转位因子依赖型

同源序列依赖型
 整合型异源蛋白的表达

DNA 体内重组的基本原理
转位因子依赖型的体内重组：转位因子家族

转位因子是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的 DNA
可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如：

噬菌体 G 片段（ G-Fragment ）

原核细菌 插入顺序
（ IS ）
真核细菌 转座子
（ Tn 、 Ty ）
高等植物 可移动因子
（ Ac 、 Ds ）
高等动物 跳跃基因（ mobil
 整合型异源蛋白的表达
DNA 体内重组的基本原理
转位因子依赖型的体内重组：转位因子的结构

ACCATGGTT TTGGTACCA

IR 抗药性基因 IR
IS （ 1 kb ）
IR 转位酶基因 IR

Ty （ 5 kb ）
IS 识别位点 阻遏基因 IS
Tn （ 2 - 20
kb ）
 整合型异源蛋白的表达
DNA 体内重组的基本原理
转位因子依赖型的体内重组：整合形式
 整合型异源蛋白的表达

DNA 体内重组的基本原理
同源序列依赖型的体内重组：基本形式

在很多原核细菌细胞中，染色体 DNA 链上的两个同源区之间

可发生所谓的同源重组，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距
离同源区的长度、同源程度密切相关。一般地说，距离越远、长度
越长、同源性越高，重组的频率也就越高，反之亦然。

同源重组有整合和交换两种形式，前者只需要一个断裂位点，
而后者涉及两个断裂位点
 整合型异源蛋白的表达
ori
DNA 体内重组的基本原理
同源序列依赖型的体内重组：同源整合
标记基因 目的基因
整合位点

同源区域

染色体
DNA
 整合型异源蛋白的表达
ori
DNA 体内重组的基本原理
标记基因
同源序列依赖型的体内重组：同源交换

目的基因
ori 同源区域

标记基因 交换区域

染色体
DNA

+
 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建

无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白
表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期
较短的受体细胞内源性蛋白质。

在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为
对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明
，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的
人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。
 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
蛋白酶缺陷型受体细胞的改造
lon 基因缺陷的大肠杆菌受体（ lon - ）
： 实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆
菌中的蛋白酶 La 和 Ti 降解的，两者分别由 lon 和 clp 基因编码
，其蛋白水解活性依赖于 ATP 。 lon 基因由热休克等环境压力
激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种
环境压力诱导 lon 基因的表达。 lon- 的大肠杆菌突变株可使原来
半衰期较短的细菌调控蛋白（如 SulA 、 RscA 、 N ）稳定性
大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。
 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
蛋白酶缺陷型受体细胞的改造
htpR 基因缺陷的大肠杆菌受体（ htpR - ）
： 大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降
解也有重要作用，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白
酶识别和降解较有利的空间构象，从而提高异常或异源蛋白对蛋
白酶的敏感性。热休克基因 dnaK 、 dnaJ 、 groEL 、 grpE 以及
环境压力特异性 因子编码基因 htpR 的突变株均呈现出对异源
蛋白降解作用的严重缺陷，特别是 lon-htpR- 的双缺陷株，非常
适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。
 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计
多肽链 C 末端氨基酸序列对稳定性的影响
： 大量的实验结果表明，在所有的极性氨基酸中，天门冬氨
酸（ Asp ）的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且 Asp
残基离 C 末端越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，
在多种结构和功能相互独立的蛋白质 C 末端引入 Asp 残基，都
能显著地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义。
 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建
抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计
多肽链 N 末端氨基酸序列对稳定性的影响
：
大量的实验结果同时表明，如果多肽链的 N 末端序列中含
有较高比例的 Ala 、 Asn 、 Cys 、 Gln 、 His ，则蛋白质的稳定
性显著改善。
相反， N 末端含有 Pro 、 Glu 、 Ser 、 Thr 的真核生物
蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其 Pro-Glu-
Ser-Thr 序列（ PEST 序列），是胞内蛋白酶的超敏感区。
6 外源基因在大肠杆菌中的表达
D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制

改善基因工程菌不稳定性的策略
 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制
工程菌遗传不稳定性的表现形式

基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性，

这种不稳定性具有下列两种表现形式：
结构不稳定性

重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导
致
其表观生物学功能的丧失
分配不稳定性

整个重组 DNA 分子从受体细胞中逃逸

（ curing ）
 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制
工程菌遗传不稳定性的产生机制

受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解

外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢
能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞
产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序
重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配
这是重组质粒逃逸的基本原因
受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排
 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制
重组质粒的逃逸率

当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系
统中
一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为
称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有：

高温培养、表面活性剂（ SDS ）、药物（利福平）

、染料（ 吖啶）促使重组质粒渗漏
受体细胞中的核酸酶降解重组质粒
重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含
重组质粒 拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧
 改善基因工程菌不稳定性的策略
改进载体受体系统

以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括：

将 R1 质粒上的 parB 基因引入表达型载体中，其表达产物可

以
选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞

正确设置载体上的多克隆位点，禁止 DNA 片段插在稳定区

内
将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死

性的相应受体系统，如大肠杆菌的 ssb 基因（ DNA 单链结

合
蛋白编码基因
 改善基因工程菌不稳定性的策略
施加选择压力

根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素

药物和食品生产时禁止使用抗生素

根据载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营

养组份

培养基复杂，成本较高
 改善基因工程菌不稳定性的策略

控制目的基因的过量表达

使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度

使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数

优化基因工程菌的培养工艺

培养基组成：限制培养基比丰富培养基更有利于稳定

培养温度： 较低的培养温度有利于重组质粒的稳
定
6 外源基因在大肠杆菌中的表达

E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素

胰岛素的结构及其生物合成

人胰岛素的生产方法

重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
 胰岛素的结构及其生物合成
N C
信号肽 B 肽 C 肽 A 肽
信号肽酶

C 肽（ 31 ） R
K S S R
R
C
A 肽 S S
S S
（ 21 ）
N B 肽
（ 30 ）
高尔基体内的特异性肽酶
S S
N C
S S
S S
N C
 人胰岛素的生产方法
迄今为止，有四种大规模生产人胰岛素的方法：

直接提取法制人胰岛素

早期人的胰岛素是从人的胰脏中直接分离纯化的，由于原料

供应的限制，其产量远远不能满足日益增多的糖尿病人的临

床需求。
 人胰岛素的生产方法

化学合成法制人胰岛素

根据人胰岛素 A 链和 B 链的序列，由单个氨基酸从头合成。
这
条化学全合成的路线从技术上来说是能够做到的，但其生产

成本奇高，从而也限制了产品的广泛应用。
 人胰岛素的生产方法
化学转型法制人胰岛素
猪的胰岛素可从原料丰富的猪胰脏中提取获得，而且猪胰
与人胰岛素只在 B 链的 C 末端有一个氨基酸的差异，猪的为
岛素
的为 Thr ，因此将猪胰岛素在体外酶促转化为人胰岛素不失为一种
Ala ，人
选择。
上述思路的技术路线是：在 pH 为 6-7 的有机相中使胰蛋
化其逆反应，该酶在过量的苏氨酸叔丁酯的存在下，将猪胰岛素 B
白酶催
链 C 末端的丙氨酸交换下来，所形成的人胰岛素叔丁酯再用三氯
酸脱去叔丁酯基团，最终获得人胰岛素。该过程的总转化率为
乙
但工艺路线耗时，分离纯化操作复杂，产品的价格不菲。
60%
 人胰岛素的生产方法
基因工程法制人胰岛素

1982 年，美国 Ely LiLi 公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛

素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 1987 年， Novo 公
司
又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。
上述由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体
结合
性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代
动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别，而且还具有无免疫
原性、注射吸收迅速等优点，充分展示了基因工程在生物医药领域
中的巨大潜力。
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A 链和 B 链分别表达
基因工程菌的构建战略：
法 tac Met tac Met

β-Gal β-Gal
化学合成 A
Apr Met Apr Met
和 B 链的编
链
A peptide B peptide
序列
码
ori ori

M M M M
N C N C
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A 链和 B 链分别表达
法 表达产物的后处理路线：
β-Gal A β-Gal B
M M M M
N C N C

CNBr 处理

N C N C N C N C

分离纯化 Cys 体外氧化和重折叠

S S
N C
S S
S S
N C
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A 链和 B 链分别表达
法 生产技术的评价：
由于 A 链和 B 链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫
键的正
确配对率较低，通常只有 10% - 20% ，因此采用这条工艺路线
生
产的重组人胰岛素每克成本高达 100 美元以上。

为了进一步降低生产成本，美国 Ely LiLi 公司随后又建立

了第
二条生产重组人胰岛素的工艺路线。
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
基因工程菌的构建战略：
tac
Met
转化
β-Gal
Apr
Met
B peptide
C peptide 分离纯化
A peptide
ori M M
N C

人胰岛素原的 cDNA 重组人胰岛素原

 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法 C peptide

表达产物的后处理路线： R
R
R S S
B 链中第 22 位上的 Arg 和第 K
C
位上的 Lys 由于良好折叠的原
29 S A peptide S
因，对胰蛋白酶不敏感 M S S
N
B peptide R

CNBr 胰蛋白酶
S S
N C
S S
羧肽酶 B S S R
N C
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
人胰岛素原表达法
生产技术的评价：

在人胰岛素原表达工艺中，由于 C 肽的存在，胰岛素原能
形成
良好的空间构象，三对二硫键的正确配对率也相应提高，折叠率高

达 80% 以上。虽然这条工艺路线并不比 AB 链分别表达法更为简捷

，
而且还要使用两种高纯度的酶制剂，但理想的折叠率在很大程度上

弥补了工艺繁琐的缺陷，使得每克最终产品的成本仅 50 美元。

目前美国 Ely LiLi 公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛

素。
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
A 链和 B 链同时表达
法 tac
Met 转化

β-Gal 分离纯化
Apr
Met M M
N C
B peptide
A peptide CNBr 处理

ori 化学合成 AB 链编码序

列 体外折叠 特异性裂解

重组人胰岛素
 重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建
分泌型重组人胰岛素表达法
上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素
原编码序列与大肠杆菌 - 半乳糖苷酶基因拼接的方法，所产生的
融合型重组蛋白表达率高、稳定性强，但不能分泌，只能以包涵体
的形式存在于胞质中。一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略
是将胰岛素或胰岛素原编码序列与 - 內酰胺酶基因拼接， -內
酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。由此获得的工程菌同时具备
了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性，为胰岛素的后续分
离纯化工序减轻了负担。
 6 外源基因在大肠杆菌中的表达

A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征

B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原
理
C 大肠杆菌基因工程菌的构建策略

D 基因工程菌的遗传不稳定性及其对策

E 利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
重组 DNA 技术与基因工程
1 重组 DNA 技术与基因工程的基本概念
2 重组 DNA 技术与基因工程的基本原理
3 重组 DNA 技术所需的基本条件
4 重组 DNA 技术的操作过
5 程
目的基因的克隆与基因文库的构建
6 外源基因在大肠杆菌中的表达
7 外源基因在酵母菌中的表达
8 外源基因在哺乳动物细胞中的表达
9 外源基因表达产物的分离纯化
 7 外源基因在酵母菌中的表达
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征

酵母菌的分类学特征

酵母菌（ Yeast ）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单

胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母
细
菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由 56 个属和 500 多个种组成。
如
果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最

成熟的真核生物表达系统。
 7 外源基因在酵母菌中的表达
A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征

酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便
具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统
大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国 FDA 认定为安全
的 基因工程受体系统（ Generally Recognized As Safe GRAS ）
酵母菌是最简单的真核模式生物
7 外源基因在酵母菌中的表达

B 酵母菌的宿主系统

广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌

提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌

抑制超糖基化作用的突变宿主菌

减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括：

酵母属 如酿酒酵母（ Saccharomyces

cerevisiae
克鲁维酵母属 ） 如乳酸克鲁维酵母（ Kluyveromyces
lactis
毕赤酵母属 ） 如巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris ）

裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（ Schizosaccharomyces

pombe
汉逊酵母属 ） 如多态汉逊酵母（ Hansenula
polymorpha ）
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母
表达外源基因最理想。
 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌
能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型

突变类型 生物效应 作用位点

ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的

ATP
ssc2酶 提高重组蛋白表达 转录后加工

rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平

ose1 提高重组蛋白表达 转录水平

ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶 Y

rho- 提高重组蛋白表达 转录水平

 抑制超糖基化作用的突变宿主菌

许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基
它们常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心和外侧糖
团，
链两部分组成。
能抑制超糖基化的突变类型
酵母菌普遍拥有
质的糖基化系统，但野生
蛋白 突变类型 生物效应

型酿酒酵母对异源蛋白的
mnn 甘露糖生物合成缺陷型
糖基化反应很难控制，呈
alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷
超糖基化倾向，因此超糖
型
och 外侧糖链添加缺陷型
基化缺陷株非常重要。
 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用

靶蛋白 Lys HOOC Ubiquitin 76 aa

ubiquitin ligase E3

靶蛋白 Lys

ubiquitin ligase E3

靶蛋白 Lys 蛋白酶体

 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
酵母菌泛素依赖型蛋白降解系统的编码基因
酵母菌共有四个泛素编码基因：

UBI 1 编码泛素 - 羧基延伸蛋白 52 （ CEP52 ） 对数生长期表达 稳定期

关闭
UBI 2 编码泛素 - 羧基延伸蛋白 52 （ CEP52 ） 对数生长期表达 稳定期
关闭
UBI 3 编码泛素 - 羧基延伸蛋白 76 （ CEP76 ） 对数生长期表达 稳定
期关闭
UBI 4 编码泛素五聚体 对数生长
期关闭 稳定期表达
酵母菌共有七个泛素连接酶基因：
UBC 1 、 UBC 2 、 UBC 3 、 UBC 4 、 UBC 5 、 UBC
6 、 UBC 7
 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI 4 缺陷型：

在酿酒酵母菌中，泛素主要由 UBI 4 基因表达， UBI 4- 突变株

正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要低得多，
能
因此 UBI 4 缺陷突变株是外源基因表达理想的受体
UBA 1 缺陷型：
UBA1 编码泛素激活酶 E1 ， UBA1 突变株是致死性的，但其等
基
位因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导的蛋白降解
Ubc4 - ubc5 双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效
7 外源基因在酵母菌中的表达

C 酵母菌的载体系统

酵母菌中的野生型质粒

酵母菌克隆表达质粒的构建
 酵母菌中的野生型质粒
酿酒酵母中的 2µ 环状质粒
REP1 FLP
几乎所有的酿酒酵母中都含有 2µ 双
IR
链
环状质粒，拷贝数达 50 至 100 个。
RAF A
IRs 反向重复序列， 600 bp ，重
ori IR
组
FLP 编码产物驱动 IRs 的同源重组 STB
REP2
REP 编码产物控制质粒的稳定性 同源重组
STB REP 的结合位点

接合酵母属中的 pSR1 和 pSB1 ，以

及
克鲁维酵母属中的 pKD1 等均与 2µ B

质
粒类似。
 酵母菌中的野生型质粒
乳酸克鲁维酵母中的线状质粒

乳酸克鲁维酵母中含有两种不同
DNA 聚合酶 毒素蛋白 免疫蛋白 
的双链线状质粒 pGKL1 和 亚基
pGKL1
拷贝数为 50-100 个，分别携带
反向重复序列 pGKL1 8.9 kb
K1
K2 两种能使多种酵母菌致死的
毒
素蛋白编码基因（   ），同时含有毒素蛋白抗性基因。
 酵母菌克隆表达质粒的构建

含有 ARS 的 YRp 质粒的构

建 ARS 为酵母菌中的自主复制序列， 0.8-1.5kb ，染色体上每 30-
40kb
就有一个 ARS 元件。酵母菌自主复制型质粒的构建组成包括复制子、
标
记基因、提供克隆位点的大肠杆菌质粒 DNA 。
以 ARS 为复制子的质粒称为 YRp
以 2µ 质粒上的复制元件为复制子的质粒称为 YEp
上述两类质粒在酿酒酵母中的拷贝数最高可达 200 个，但培养
几代
后，质粒的丢失率高达 50%-70% ，主要是由于分配不均匀所致。
 酵母菌克隆表达质粒的构建

含有 CEN 的 YCp 质粒的构

建
CEN 为酵母菌染色体 DNA 上与染色体均匀分配有关的序列

将 CEN DNA 插入含 ARS 的质粒中，获得的新载体称为

YCp
YCp 质粒具有较高的有丝分裂稳定性，但拷贝数只有 1 - 5 个

含有 TEL 的 YAC 质粒的构

建
 酵母菌克隆表达质粒的构建

含有酵母菌染色体 DNA 同源序列的 YIp 质粒的构

建
在大肠杆菌质粒上组装酵母菌染色体 DNA 特定序列和标记基
因，
构建出来的质粒称为 YIp 。目的基因表达盒通常插在染色体 DNA 特
定
序列中，这样目的基因就能高效整合入酵母菌特定的染色体 DNA 区
域
7 外源基因在酵母菌中的表达

D 酵母菌的转化系统

酵母菌的转化程序

转化质粒在酵母细胞中的命运

用于转化子筛选的标记基因
 酵母菌的转化程序

酵母菌原生质体转化法

早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体
转化
法，在 Ca2+ 和 PEG 的存在下，转化细胞可达原生质体总数的 1-
2% 。
但该程序操作周期长，而且转化效率受到原生质再生率的严重制约

原生质体转化法的一个显著特点是，一个受体细胞可同时
接纳
多个质粒分子，而且这种共转化的原生质体占转化子总数的 25-
33%
 酵母菌的转化程序

碱金属离子介导的酵母菌完整细胞的转化

酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如 Li+ 等）、 PEG 、

热休克
处理后，也可高效吸收质粒 DNA ，而且具有下列特性：

吸收线型 DNA 的能力明显大于环状 DNA ，两者相差 80

倍
共转化现象极为罕见
 酵母菌的转化程序

酵母菌电击转化法

酵母菌原生质体和完整细胞均可在电击条件下吸收质粒
DNA ，
但在此过程中应避免使用 PEG ，它对受电击的细胞具有较很大的负

作用。电击转化的优点是不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件

适用范围广，而且转化率可高达 105 / µg DNA 。

 转化质粒在酵母细胞中的命运

单双链 DNA 均可转化酵母菌，但单链的转化率是双链的 10-30

倍
含有复制子的单链质粒进入细胞后，能准确地转化为双链并复制

不含复制子的单链质粒进入细胞后，能高效地同源整合入染色体

这对于体内定点突变酵母基因组极为有利

克隆在 YIp 整合型质粒上的外源基因，如果含有受体细胞的染色

体 DNA 的同源序列，会发生高频同源整合，整合子占转化子总

数的 50-80%
 用于转化子筛选的标记基因
营养缺陷型的互补基因

用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基
因和
显性基因两大类

营养缺陷型互补基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，
如：
LEU 、 TRP 、 HIS 、 LYS 、 URA 、 ADE

但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难
 用于转化子筛选的标记基因
显性标记基因
显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性
蛋白
标记基因 编码产物 遗传表型

aph 氨基糖苷转移酶 抗 G418

cat 氯霉素乙酰转移酶 抗氯霉素

dhfr 二氢叶酸还原酶 抗氨甲喋

呤和磺胺
cup1 铜离子螯合物 耐受
铜离子
suc2 蔗糖转化酶 耐
受高浓度蔗糖
ilv2 乙酰乳糖合成酶 抗硫酰
脲除草剂
7 外源基因在酵母菌中的表达

E 酵母菌的表达系统

酵母菌启动子的可控性

外源基因在酵母菌中表达的限制因素

酵母菌表达系统的选择
 酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子

pho4TS-PHO5 启动子：

酿酒酵母 PHO5 启动子在培养基中游离磷酸盐耗尽时才能打

开
PHO4 基因编码产物是 PHO5 启动子的正调控因
子
PHO4 温度敏感型突变基因 pho4TS 的编码产物在 35℃ 时失
活
因此，装在 pho4TS-PHO5 启动子下游的外源基因在 35℃ 时关闭
23℃ 诱导表达
 酵母菌启动子的可控性
温度控制型启动子  受体细胞基因组重组质粒


a – α 型启动子： 25℃ Sir3-8TS a1

酿酒酵母有 a 和 两种单倍 a 型启动
体，分别由 MATa 和 MATα 子
两个等位基因决定。 hmlα2-102 MATa
型启动
α1 因子决定 细胞特征表 子
35℃ Sir3-8 TS

达 2 因子阻遏 a 细胞特征
表达 a1-a2 阻遏 细胞特征 α2 a1 a 型启动
表达 子
编码 2 因子的基因突变型
hmlα2-102 MATa 型启动
hmlα2-102 能产生 2 变体
α1 子
，它能灭活 a1 ，同时阻遏
 酵母菌启动子的可控性
超诱导型启动子
半乳糖诱导效果不明显，基因基底水平表达
酿酒酵母

的半乳糖

利用酶系

由 GAL1 GAL80 GAL4 UAS GAL1 GAL7 GAL10

GAL7 和
半乳糖诱导时， GAL4 高效表达， GAL1 、 GAL1 、 GAL10 超高效
GAL10
表达
基因编码 GAL10
Promoter

GAL80 GAL4 UAS GAL1 GAL7 GAL10

 外源基因在酵母菌中表达的限制因素

外源基因稳态 mRNA 的浓
度
外源基因 mRNA 的翻译活性

酵母菌对密码子的偏爱性

在酿酒酵母中，高丰度的蛋白质（如甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶

GAPDH 、磷酸甘油激酶 PKG 、乙醇脱氢酶 ADH ）中

96%
以上的氨基酸是由 25 个密码子编码的
 酵母菌表达系统的选择
酿酒酵母表达系统

酿酒酵母的基因表达系统最为成熟，包括转录活性较高的
甘油
醛 -3- 磷酸脱氢酶基因 GAPDH 、磷酸甘油激酶基因 PKG 、乙醇
脱氢
酶基因 ADH 所属的启动子，多种重组外源蛋白获得成功表达
。 酿酒酵母表达系统的最大问题在于其超糖基化能力，往往
使得
有些重组蛋白（如人血清白蛋白等）与受体细胞紧密结合，而不能

大量分泌。这一缺陷可用非酿酒酵母型的表达系统来弥补。
 酵母菌表达系统的选择
乳酸克鲁维酵母表达系统

乳酸克鲁维酵母的双链环状质粒 pKD1 已被广泛用作重组

异源
蛋白生产的高效表达稳定性载体，即便在无选择压力的条件下，也

能稳定遗传 40 代以上。

乳酸克鲁维酵母表达分泌型和非分泌型的重组蛋白，性能
均优
于酿酒酵母表达系统。
 酵母菌表达系统的选择
巴斯德毕赤酵母表达系统
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基
中生
长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长
迅速、乙醇氧化酶基因 AOX1 所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯
德毕赤酵母表达系统的三大优势。

由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源
基因
的表达序列一般整合入受体的染色体 DNA 上。在此情况下，外源基
因
的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有 20 余
种
具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。
 酵母菌表达系统的选择
多型汉逊酵母表达系统

多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列 HARS
已被
克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载
体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是， HARS 质
粒
能高频自发地整合在受体的染色体 DNA 上，甚至可以连续整合 100
多
个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。
目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统
中获
得成功表达。
 7 外源基因在酵母菌中的表达

F 利用重组酵母生产乙肝疫苗

由乙型肝炎病毒（ HBV ）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种

严重
的传染病，每年约有 200 万病人死亡，并有 3 亿人成为 HBV 携带者
，其
中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒
还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒
感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其
广泛应用提供了可靠的保证。
7 外源基因在酵母菌中的表达

F 利用重组酵母生产乙肝疫苗

乙型肝炎病毒的结构与性质

产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母

产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
 乙型肝炎病毒的结构与性质
乙型肝炎病毒的结构
乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链 DNA 病毒，具有感染力
的病毒
颗粒呈球面状，直径为 42 nm ，基因组仅为 3.2 kb 。病毒颗粒的主
结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（ HBsAg ）或 S 多肽，它具有糖基
要
和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）
化
、 DNA 聚合酶、微量病毒蛋白。
病毒

除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量
的 22
nm 的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的
1000 倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白： S 、 M 、 L 多肽。
 乙型肝炎病毒的结构与性质
乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因

108 aa 55 aa 226 aa
ATG ATG ATG TAA

preS1 preS2 S

226 aa S 多肽

281 aa M 多肽

399 aa L 多肽
 乙型肝炎病毒的结构与性质
传统乙肝疫苗的制备

乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙
肝疫
苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的

疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。
 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母
20 世纪 80 年代开始选择酿酒酵母表达重组 HBsAg ，主要工作
将
包括S 多肽的编码置于 ADH1 启动子控制下，转化子能表达出具有免疫
性
活的重组蛋白，它在细胞提取物中以球形脂蛋白颗粒的形式存在，平
均颗粒直径为 22 nm ，其结构和形态均与慢性乙肝病毒携带者血清
的
中病毒颗粒相同。
目前，由酿酒酵母生产的重组 HBsAg 颗粒已作为乙肝疫苗商
重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的
品化 1%-2% 。
进一步的研究表明， M 多肽和 L 多肽对 S 型疫苗具有显著的
用，由三者（或两者）构成的复合型乙肝疫苗还可以诱导那些对
增效作 S抗
原缺乏响应的人群的免疫反应。
 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建
Bgl II
PARS2
Bgl II Bgl II
5’ AOX1 3’ AOX1
pBSAG151 转化 his- 的受体细
HBsAg 11 kb 胞
重组分子

PHIS4
染色体 DNA

his+ 的转化子

5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1

 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母

重组巴斯德毕赤酵母的性能

由于巴斯德毕赤酵母染色体 DNA 上还拥有第二个乙醇氧化酶

AOX2 ，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。
基因
重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加
醇诱导 HBsAg 表达，最终 S 蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的
入甲
在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个 240L 的发酵
3%
中培养，最终可获得 90 克 22nm 的 HBsAg 颗粒，足够制成 900 万份
罐
疫苗。
乙肝
 7 外源基因在酵母菌中的表达

A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特
征
B 酵母菌的宿主系统
C 酵母菌的载体系统
D 酵母菌的转化系统
E 酵母菌的表达系统
F 利用重组酵母生产乙肝疫苗