INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZNIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM GENTICA, CONSERVAO E BIOLOGIA EVOLUTIVA

Citogentica comparativa das variedades selvagens de acar-disco (Symphysodon spp., Cichlidae, Perciformes) endmicos da Amaznia: uma abordagem clssica e molecular dos cromossomos mitticos e meiticos

MARIA CLAUDIA GROSS

MANAUS-AM 2009

MARIA CLAUDIA GROSS

Citogentica comparativa das variedades selvagens de acar-disco (Symphysodon spp., Cichlidae, Perciformes) endmicos da Amaznia: uma abordagem clssica e molecular dos cromossomos mitticos e meiticos

ORIENTADOR (A): Dra Eliana Feldberg CO-ORIENTADOR: Dr Cesar Martins

Tese apresentada ao Programa de Psgraduao do INPA como parte dos requisitos para obteno do ttulo de Doutor em Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva.

MANAUS-AM 2009

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FICHA CATALOGRFICA

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Gross, Maria Claudia Citogentica comparativa das variedades selvagens de acar-disco (Symphysodon spp. , Cichlidae, Perciformes) endmicos da Amaznia: uma abordagem clssica e molecular dos cromossomos mitticos e meiticos / Maria Claudia Gross.--- Manaus : [s.n.], 2009. xxiii, 137f. : il. color. Tese (doutorado)-- INPA, Manaus, 2009 Orientador : Eliana Feldberg Co-orientador : Cesar Martins rea de concentrao : Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva 1. Acar-disco (peixe) Citogentica. 2. Symphysodon aequifasciatus. 3. Symphysodon discus. 4. Symphysodon haraldi. 5. FISH (tcnica) 6. Complexo sinaptonmico. I. Ttulo. CDD 19. ed. 597.50415

Sinopse: As trs espcies do peixe ornamental acar-disco (Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi), endmicas da bacia amaznica, foram estudadas mediante anlise de citogentica clssica (colorao convencional, deteco da heterocromatina e regies organizadoras de nuclolo) e molecular (hibridizao fluorescente in situ com sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e retrotransposon Rex3) e anlise do complexo sinaptonmico. As anlises evidenciam a ocorrncia de rearranjos cromossmicos na evoluo das espcies, bem como mostram que elementos transponveis podem estar envolvidos com a formao da cadeia cromossmica meitica. Palavras-chave: Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus, Symphysodon haraldi, FISH, complexo sinaptonmico

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Dedico esta Tese aos meus pais Lineu e Marilda, ao meu irmo Joo Henrique e especialmente ao meu esposo Carlos Henrique Schneider.

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O homem que deseja ser cientista e cincia dedicar seu tempo e amor tem pelo menos trs certezas: a de que morrer um dia (como todo mundo), a de que no ficar rico (como quase todo mundo) e a de que se divertir muito (como pouca gente). Prof. Newton Freire-Maia

Se fosse fcil achar o caminho das pedras, tantas pedras no caminho no seria ruim. Humberto Gessinger

A realizao deste projeto foi possvel devido: Ao Programa de Ps-graduao em Gentica, Conservao e Biologia Evolutiva, do INPA. Ao laboratrio de Gentica Animal do INPA, coordenao de Pesquisas em Biologia Aqutica (CPBA), onde a maior parte deste trabalho foi desenvolvido, com financiamento proporcionado pelos Projetos de Pesquisas Institucionais (PPIs), Fundao de Amparo Pesquisa do Amazonas (PIPT/FAPEAM N 1749/08) e convnios entre estas agncias e o Ministrio de Cincias e Tecnologia/Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (INCT ADAPTA, FAPEAM/CNPq Proc. N 573976/2008-2 e MCT/CNPq/CT-Amaznia/CT-Energ 554057/2006-9). Aos laboratrios de Genmica Integrativa e de Microscopia Eletrnica, ambos sediados na Universidade Estadual Paulista Jlio de Mesquita Filho Botucatu, onde anlises da FISH e do complexo sinaptonmico foram realizadas, com financiamento proporcionado pela Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de So Paulo (FAPESP 04/14766-6), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq 501119/2005-1) e Coordenadoria de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES, PROEQUI 1752/2008). Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq) pela concesso da bolsa de estudo e pela taxa de bancada (processo. 141868/2006-6) durante a realizao deste trabalho.

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Agradecimentos Agradeo a todas as pessoas, colegas e amigos que, direta ou indiretamente possibilitaram a realizao deste trabalho. minha eterna orientadora Dra. Eliana Feldberg, pelo exemplo de como age uma excelente profissional. Alm de conhecer como ningum os cicldeos neotropicais e querer compartilhar este conhecimento, ela acolhe a todos de braos abertos. Muito obrigada pelos inmeros ensinamentos, apoio, conselhos, ateno, crticas, sugestes, incentivo e amizade. Obrigada tambm por me ensinar como se comporta um orientador, sempre pronta a sanar dvidas, ensinar, ler e reler rapidamente tudo que necesssrio para o bom andamento do trabalho, sabendo dosar bom-humor e pulso-firme. Sem dvida, muito do meu crescimento profissional e pessoal devo minha me cientfica. Ao meu co-orientador Dr. Cesar Martins, que me proporcionou todo o ensinamento acerca da FISH, pela amizade, discusses, crticas, sugestes e tambm pelos momentos de descontrao. Ao Dr. Jorge Ivan Rebelo Porto por sua amizade, conselhos e incentivo, mas principalmente por seus questionamentos incessantes, que me fizeram buscar respostas a perguntas que eu nem imaginava que existissem! Aos amigos do Laboratrio de Gentica Animal do INPA: Brenda, Cac, Carlos, Eduardo, rica, Fernanda, Heidi, Leandra, Leila, Luciana, Natlia, Rodrigo, Valentim e todos os outros que j passaram por l. Obrigada pelo bate-papo (cientfico ou no), pelas crticas e sugestes, bem como pelo convvio dirio e festas. Vocs confirmaram a hiptese de que um ambiente de trabalho produtivo nada tem a ver com a competitividade interna. Sem dvida, vocs sempre faro muita falta. Um obrigado especial aos amigos Leandra, Carlos, Edu e Leilinha, que apesar de no serem admiradores natos da meiose, sempre me ajudaram na interpretao de resultados e leitura de manuscritos. Polacada, vocs so muito especiais. Aos amigos do Laboratrio de Genmica Integrativa, da UNESPBotucatu, especialmente ao Guilherme Targino Valente. Obrigada pelo acolhimento e por todos os ensinamentos. Aos meus amigos Leandra e Igor; Eduardo, Tahisa, Isabelle e Otto simplesmente por fazerem parte da minha vida e tornarem o meu dia-a-dia muito mais alegre. Resumindo, vocs fazem parte da minha famlia. Um
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obrigado especial polaca (Leandra), que alm de amiga e cumadre, compartilhou todos os meus fracassos e conquistas cientficas desde a poca da UEPG (2000), sabendo a hora de rir ou chorar junto e sempre buscando a parte boa das situaes at nas horas ruins. Ao nico membro da equipe Caf com Leite (BADPI- mestrado 20042006) que permaneceu em Manaus. Rodrigo, meu amigo, obrigada por no ter abandonado o barco. Hercilia, Alessandra e Elci, secretrias da ps-graduao e do GCBEV. Sem vocs a nossa vida seria muito mais difcil. Agradeo tambm aos meus novos colegas da UFAM, do Instituto de Cincias Biolgicas, Departamento de Biologia, onde pretendo permanecer por uma longa data. minha sogra Edite Schneider e minhas cunhadas Silvia e Marielle. Um obrigado especial Marielle por ter me ensinado a dar os meus primeiros passos no mundo da meiose. Ao meu av, tios, tias, primos e cunhada. Especialmente tia Leila (minha segunda me), que apesar de achar que um dia eu deveria voltar para o Paran, sempre apoiou e incentivou as minhas decises, alm de fornecer muitas milhas da Varig e Tam para eu rever a famlia. Adoro vocs. Ao MSc. Carlos Henrique Schneider, pelo exemplo profissional, por ser extremamente crtico na reviso dos meus trabalhos, pela ajuda, apoio e sugestes. E ao meu esposo Carlinho, obrigada por conseguir conviver pacificamente com este clima de laboratrio-casa, por acordar bem humorado de madrugada para discutir dados que eu acho que vou esquecer at amanhecer, por aguentar meus perodos de estresse (que no so poucos), pelo companheirismo, amizade e amor incondicional. Voc imprescindvel na minha vida. Aos meus pais Lineu e Marilda Delfrate Gross e ao meu irmo Joo Henrique, que so meus exemplos de vida e me fizeram entender desde cedo o sentido da palavra Famlia. Passei os melhores dias da minha vida com vocs e, depois que vim morar longe de casa, valorizo muito mais cada momento que passamos juntos. Pai, Me e Ike, sem o apoio e incentivo de vocs eu no teria crescido pessoal e profissionalmente. Por isso esta conquista nossa! Amo vocs!

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A Deus, por s ter motivos para agradecer! Tudo valeu a pena! Como disse o cientista Louis Pasteur: "Um pouco de cincia nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima".

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RESUMO O gnero Symphysodon compreende trs espcies endmicas da bacia amaznica, conhecidas popularmente como acars-disco e muito apreciadas na aquariofilia. Dentro da famlia Cichlidae, essas espcies apresentam o maior nmero diploide j descrito, e para compreender os aspectos carioevolutivos das mesmas, anlises citogenticas clssica e molecular (utilizando sondas de DNAr 5S, DNAr 18S e retrotransposon Rex3) foram realizadas, assim como anlise do complexo sinaptonmico. Foram utilizados 22 S. aequifasciatus (14 , oito ), 37 S. discus (15 , 22 ) e 49 S. haraldi (21 , 28 ). Symphysodon aequifasciatus apresentou 50m-sm+6st-a+4mi, S. discus 50msm+10st-a e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi. Uma cadeia cromossmica multivalente, com nmero varivel de elementos e at 20 bivalentes, foi observada no diplteno/diacinese de espermatcitos e ocitos de S. aequifasciatus e S. haraldi. Em S. discus, 30 bivalentes foram detectados. Anlise do complexo sinaptonmico sugere homologia entre elementos formadores da cadeia, sendo verificada a presena de quiasmas ao longo de sua extenso. As trs espcies possuem regio organizadora de nuclolo mltipla, que variaram inter e intraespecficamente, porm nunca mais que duas marcaes foram evidenciadas por clula metafsica. Variabilidade, intra e interespecfica, tambm foi evidenciada nos stios de DNAr 18S, sendo observados de 2 a 5 por metfase: Symphysodon aequifasciatus apresentou trs padres de distribuio, enquanto S. discus e S. haraldi mostraram quatro padres. Stios de DNAr 18S tambm estiveram presentes, algumas vezes, na cadeia meitica das duas espcies portadoras. O DNAr 5S foi identificado no par 10 de S. aequifasciatus, enquanto em S. discus e S. haraldi este stio foi evidenciado no par 18. Nos cromossomos meiticos das trs espcies, os stios de DNAr 5S foram localizados em bivalentes tpicos. Com relao localizao do elemento Rex3, as trs espcies apresentaram um padro de distribuio compartimentalizada em alguns cromossomos e com sinais tnues de hibridizao na regio centromrica da maioria dos cromossomos. Tais sinais foram coincidentes com a heterocromatina na maioria das vezes. A somatria destes dados indica a ocorrncia de inmeros rearranjos cromossmicos, acmulo e movimentao de elementos repetitivos, bem como heterocromatinizao na carioevoluo do gnero Symphysodon. A
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variabilidade dos stios de DNAr 18S pode refletir a existncia de translocaes envolvendo regies heterocromticas ricas em elementos transponveis, que teriam ocorrido independentemente em populaes/espcies ancestrais de Symphysodon. Em um dado momento estas populaes/espcies teriam formado hbridos, que formaram a cadeia cromossmica meitica para que o ajustamento sinptico entre os segmentos cromossmicos homlogos das espcies parentais ocorresse. Estes hbridos seriam o que hoje reconhecemos como S. aequifasciatus e S. haraldi, enquanto S. discus seria uma espcie pura.

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ABSTRACT The genus Symphysodon comprises three endemic species of the Amazon basin, commonly known as discus and highly prized by the aquarium trade. Within the family Cichlidae, these species have the highest diploid number described thus far. To understand the karyoevolutionary aspects of these species, classic and molecular (5S rDNA, 18S rDNA and retrotransposon Rex3) cytogenetic analyses were carried out, along with an analysis of the synaptonemal complex. Sixteen specimens of S. aequifasciatus (eight , eight ), 37 specimens of S. discus (15 , 22 ) and 43 specimens of S. haraldi (15 , 28 ) were analyzed. Symphysodon aequifasciatus had 50m-sm+6st-a+4mi, S. discus 50m-sm+10st-a and S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi. A multivalent chromosomal chain with a variable number of elements and up to 10 bivalents was found in the diplotene/diakinesis of sperm and oocyte cells in S. aequifasciatus and S. haraldi. Analysis of synaptonemal complex suggests homology among the elements that make up the chain, with the presence of chiasms throughout its length. In S. discus thirty bivalents were detected in the diplotene/diakinesis of sperm and oocyte cells. The three species have multiple nucleolus organizer regions that vary in both inter-species and intra-species terms. However, no more than two NOR sites were found per metaphasic cell. Inter-species and intra-species variability was also found for the 18S rDNA sites, with two to five sites per metaphase: Symphysodon aequifasciatus exhibited two distribution patterns, whereas S. discus and S. haraldi exhibited four patterns. 18S rDNA sites were also sometimes found in the meiotic chain of the two species. 5S rDNA was identified in pair 10 in S. aequifasciatus, whereas this site was identified in pair 18 in S. discus and S. haraldi. In the meiotic chromosomes of the three species, 5S rDNA sites were located in typical bivalents. Regarding the localization of Rex3, the three species exhibited a compartmentalized distribution pattern in some chromosomes and tenuous sites of hybridization in the centromeric region of the majority of chromosomes. Such sites most often coincided with the heterochromatin. These data indicates the occurrence of innumerous chromosome rearrangements, the accumulation and displacement of repetitive elements and heterochromatinization in the karyoevolution of the genus Symphysodon. The variability in 18S rDNA sites may reflect the existence of translocations involving heterochromatin regions rich in
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transposable elements, which may have occurred independently in ancestral populations/species of Symphysodon. At some point, these populations/species may have formed hybrids, which formed a meiotic chromosome chain so that synaptic adjustment could occur between the homologous chromosome segments of the parent species. These hybrids may be what we recognize today as S. aequifasciatus and S. haraldi, whereas S. discus may be a pure species.

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Sumrio I. Introduo Geral ............................................................................................ 1 I.1 Consideraes sobre os acars-disco ....................................................... 1 I.2 Aspectos citogenticos dos acars-disco .................................................. 5 I.3 Complexo sinaptonmico em peixes neotropicais ..................................... 8 I.4 Citogentica molecular .............................................................................. 9 I.5 Objetivos .................................................................................................. 12 I.5.1 Geral ................................................................................................. 12 I.5.2 Especficos ........................................................................................ 12 II. Material e mtodos ..................................................................................... 13 II.1 Material ................................................................................................... 13 II.2 Mtodos .................................................................................................. 13 II.2.1 Induo de mitoses .......................................................................... 13 II.2.2 Obteno de cromossomos mitticos .............................................. 14 II.2.3 Preparao das lminas com cromossomos mitticos..................... 15 II.2.4 Obteno de cromossomos meiticos ............................................. 15 II.2.5 Deteco das regies organizadoras de nuclolos nos cromossomos mitticos e meiticos ................................................................................. 16 II.2.6 Deteco da heterocromatina constitutiva nos cromossomos mitticos e meiticos ................................................................................. 16 II.2.7 Hibridizao fluorescente in situ (FISH) ........................................... 17 II.2.8 Microespalhamento para visualizao do complexo sinaptonmico 23 II.2.9 Anlises cromossmicas .................................................................. 25 III. Resultados e discusso............................................................................ 27 III.1.Artigo 1: Intrigante evidncia de translocaes em acars-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossmica meitica em vertebrados ............................................................................................. 28 III.1.1. Introduo ...................................................................................... 30 III.1.2. Material e mtodos ......................................................................... 31 III.1.3. Resultados ..................................................................................... 33
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III.1.4. Discusso ....................................................................................... 40 III.2.Artigo 2: Anlise citogentica comparativa das espcies do gnero Symphysodon (Cichlidae): caractersticas cromossmicas de

retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal.......................... 46 III.2.1. Introduo ...................................................................................... 47 III. 2.2. Material e mtodos ........................................................................ 48 III.2.3. Resultados ..................................................................................... 51 III.2.4. Discusso ....................................................................................... 59 III.3.Captulo 3: Variabilidade intra e interespecfica do locus do DNAr 18S entre acars-disco Symphysodon: rearranjos cromossmicos ..................... 67 III.3.1. Introduo ...................................................................................... 68 III.3.2. Material e mtodos ......................................................................... 69 III.3.3. Resultados ..................................................................................... 72 III.3.4. Discusso ....................................................................................... 79 III.4.Captulo 4: Complexo sinaptonmico em acars-disco: cadeia

cromossmica meitica ................................................................................ 84 III.4.1 Introduo ....................................................................................... 85 III.4.2. Material e Mtodos ......................................................................... 86 III.4.3. Resultados ..................................................................................... 86 III.4.4. Discusso ....................................................................................... 90 IV. Concluses Gerais ................................................................................... 94 V. Perspectivas futuras .................................................................................. 96 V. Perspectivas futuras .................................................................................. 96 VI. Referncia bibliogrfica ........................................................................... 97

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Lista de figuras

Introduo Figura 1: Classificaes taxonmicas atualmente propostas para o gnero Symphysodon. Note que a nica espcie onde existe consenso na nomenclatura Symphysodon discus, conhecido na aquarifilia como disco Heckel. ............................................................................................................................. 3 Figura 2: Mapa de distribuio dos acars-disco na Amaznia. As cores no mapa referem-se colorao dos discos (marrom, azul e verde), com exceo do vermelho, que se trata do disco heckel. O tringulo em preto representa a cidade de Manaus, Amazonas (Modificado de Bleher, 2006). ............................... 4 Captulo 1 Figura 1 Espcies selvagens de Symphysodon analisadas, suas distribuies geogrficas na bacia Amaznica (modificado de Bleher, 2006) e os paleoarcos de Caravari e Purus. a) Symphysodon aequifasciatus; b) S. discus; c) S. haraldi; d) Mapa geogrfico mostrando os locais de amostragem dos discos: a, Tef; b, Novo Airo; c, Manacapuru. ........................................................................ 32 Figura 2 Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g, j, m), S. haraldi (b, e, h, k, n) e S. discus (c, f, i, l, o) submetidas colorao convencional. (a-c) Leptteno/Zigteno. (d, e) Diplteno mostrando uma cadeia cromossmica em anel (cabea de seta) e 20 bivalentes. A maioria dos bivalentes apresenta dois quiasmas terminais (setas). (f) Diplteno com 30 bivalentes, a maioria exibindo quiasmas terminais (seta). (g, h) Diacinese mostrando uma cadeia cromossmica linear (cabea de seta) e vrios bivalentes e univalentes. (i) Diacinese mostrando a separao precoce de elementos de um bivalente (seta). (j, k) Metfase I revelando a orientao em zigzag dos cromossomos dentro da cadeia (cabea de seta). (l) Metfase I com bivalentes alinhados na placa equatorial. (m-o) Metfase II com n=30 cromossomos (barra: 10 m)..................................................................................... 36 Figura 3 Frequncia das frmulas meiticas nas clulas em diplteno e diacinese analisadas em Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi, mostrando
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a barra de desvio padro e nmeros variveis de bivalentes, elementos formadores da cadeia e univalentes, provavelmente devido a uma terminalizao precoce de quiasmas. II = bivalente; C XX = cadeia cromossmica com 20 elementos; C XIX = cadeia cromossmica com 19 elementos; C XVIII = cadeia cromossmica com 18 elementos; C XVII = cadeia cromossmica com 17 elementos; C XVI = cadeia cromossmica com 16 elementos; C XV = cadeia cromossmica com 15 elementos; U = univalentes. ........................................................................................................................................ 37 Figura 4 - Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. haraldi (b, e, h) e S. discus (c, f, i) aps bandamento C (a-c) e impregnao por on Prata. (a-b) Diplteno mostrando blocos heterocromticos (cabea de seta) nos elementos cromossmicos formadores da cadeia e em quase todos os bivalentes (seta). (c) Diplteno com banda C positiva (seta) na maioria dos bivalentes. (d-f) Ncleos interfsicos, revelando cinco, seis e quatro nuclolos (cabea de seta), respectivamente. (g) Diacinese com uma RON em um grande bivalente. (h) Diacinese mostrando RONs (cabeas de seta) em um elemento da cadeia cromossmica e em um bivalente de tamanho mediano (seta). (i) Diacinese com uma RON em um bivalente de tamanho pequeno (barra: 10 m)............................................................................................................... 38 Figura 5 - Representao esquemtica da possvel origem da cadeia cromossmica das clulas meiticas de Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi (n representa os outros pares cromossmicos envolvidos na meiose mltipla). (a) Translocaes simples e heterozigotas envolvendo pequenos segmentos de alguns pares cromossmicos. (b) Elementos cromossmicos derivados de translocaes. (c) Configurao meitica da cadeia cromossmica, causada por translocaes mltiplas e seriadas. ....................... 39 Captulo 2 Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe (1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers Rex3 (a) e DNAr 5S (b) para as trs espcies de Symphysodon (1 S. aequifasciatus; 2 S. discus; 3 S. haraldi). ......................................................... 53

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Figura 2 Caritipos de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b) e S. haraldi (c) submetidos a bandeamento C (barra de escala: 10 m). .................. 54 Figura 3 Localizao fsica cromossmica do retrotransposon Rex3 (stios amarelos) nos caritipos e clulas meiticas testiculares de Symphysodon aequifasciatus (a, d, e), S. discus (b, f) e S. haraldi (c, g). a-c) Caritipos. d) Metfase espermatogonial revelando marcaes pericentromricas de Rex3 em todos os cromossomos (seta); e-g) Diplteno revelando sequncias de Rex3 na cadeia cromossmica (seta) e em bivalentes (cabea de seta) (barra 10 m)............................................................................................................................ 56 Figura 4 Localizao fsica cromossmica do DNAr 5S (srios amarelos) nos caritipos e clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. discus (b, e) e S. haraldi (c, f). a-c) Caritipos. d-f) Diplteno revelando stios de DNAr 5S em bivalentes (seta). g) Metfase de Symphysodon aequifasciatus mostrando as sequncias de Rex3 (stios rseos) flanqueando os genes RNAr 5S (stios verdes). O mesmo padro foi encontrado em S. discus e S. haraldi (barra: 10 m). ............................................................................ 58 Figura 5 Idiograma comparativo de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b), S. haraldi (c); em preto a heterocromatina centromrica/pericentromrica com tnues marcaes fluorescentes de Rex3, claramente visualizada na maioria dos cromossomos; em amarelo, marcaes conspcuas mais acentuadas de Rex 3; em vermelho, os genes RNAr 5S colocalizados com heterocromatina; em rosa, sequncias desconhecidas de heterocromatina. .......................................................................................................... 63 Captulo 3 Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe (1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers DNAr 18S para as trs espcies de Symphysodon (1 S. aequifasciatus; 2 S. discus; 3 S. haraldi).................................................................................................. 73

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Figura 2 Caritipos em colorao convencional (a, b, c) e regies organizadoras de nuclolo reveladas por impregnao com nitrato de Prata, indicando todos os pares envolvidos (d, e, f) nas espcies Symphysodon aequifasciatus (a, d), Symphysodon discus (b, e) and Symphysodon haraldi (c, f). Somente um dos homlogos est representado porque todas as combinaes de Ag-RON envolvendo estes pares cromossmicos foram encontradas (barra = 10 m). .................................................................................... 75 Figura 3 Padres de distribuio dos stios de DNAr 18S (sinais amarelos) em cromossomos mitticos de Symphysodon aequifasciatus (a-c); S. discus (dg); S. haraldi (h-k). Caritipos (a, d, h) e em destaque (b, c, e, f, g, i, j, k) os padres variantes dos stios ribossomais DNAr 18S para cada espcie (barra = 10 m)............................................................................................................................ 77 Captulo 4 Figura 1: Prfase I obtida por processo de microespalhamento de S. aequifasciatus impregnada com nitrato de Prata, em microscopia ptica. a) Clula paquitnica tardia; b) seu esquema evidenciando a cadeia cromossmica multivalente (seta e esquema em vermelho), 16 bivalentes em emparelhamento completo (esquema em azul), 1 bivalente com assinapse na regio terminal (cabea de seta e esquema em roxo) e bivalentes em associao centromrica temporria (estrela e esquema em verde); c) Diplteno incompleto, evidenciando quiasmas na cadeia cromossmica em anel (seta). Note que apesar do complexo sinaptonmico estar se desintegrando, os elementos laterais tambm podem ser evidenciados em algumas pores (cabea de seta). Para S. haraldi as mesmas configuraes meiticas foram encontradas (barra: 10 m). ......................................................... 88 Figura 2: Prfase I obtida por processo de microespalhamento de S. haraldi impregnada com nitrato de Prata, em microscopia eletrnica de transmisso. a) Paquteno (1000x de aumento) com nmero de bivalentes e elementos formadores da cadeia cromossmica no determinado. Os cinetocoros (cabea de seta) e regies eletrodensas, provavelmente regies de ancoragem na membrana nuclear (seta), preservados em bivalentes tpicos, com complexo

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sinaptonmico distribudo ao longo de todo o comprimento. A regio nucleolar est evidenciada (nu). Note que ao longo de alguns elementos cromossmicos o complexo sinaptonmico apresenta colorao mais conspcua e podem estar indicando regies de heterocromatina diferenciada; b) Detalhe dos elementos laterais do complexo sinaptonmico e ndulos de recombinao (seta) ao longo da cadeia cromossmica (5750 x de aumento). Para S. aequifasciatus as mesmas configuraes meiticas foram encontradas. ......................................... 89

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Lista de tabelas

Introduo Tabela 1- Variao cariotpica descrita para as espcies de Symphysodon. ..... 6

Artigo 2 Tabela 1 Padro de disperso cromossmica dos elementos Rex3 em diferentes espcies de peixes. ......................................................................... 62 Tabela 2: Parmetros fsico-qumicos medidos nos hbitats dos acars-disco, a 1,5m de profundidade (Bleher, 2006). .............................................................. 62 Artigo 3 Tabela 1 Pares cromossmicos de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi mostrando os diferentes padres (coluna) de distribuio do DNAr 18S (A, B homlogos) e a frequncia de cada padro por espcie. ............. 78

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Lista de abreviaturas 2n Ag-RON AoRex3 Banda C BLAST Nmero diploide Regio organizadora de nuclolo argenteoflica Retroelemento da famlia Rex3 isolado de Astronotus ocellatus Tcnica de deteco da heterocromatina constitutiva Ferramenta de busca e alinhamento de sequncias (basic local

alignment research tool) C CS DNA dNTP EDTA FISH FITC II mi m-sm n NCBI NTS PBD PCR DNAr pb Cadeia cromossmica meitica Complexo sinaptonmico cido desoxirribonuclico Desoxirribonucleotdeo cido etilenodiaminotetractico Hibridizao fluorescente in situ Fluoresceina isotiocianato (fluorescein isothiocyanate) Bivalente Microcromossomo Cromossomo meta-submetacntrico Nmero haplide National Centre for Biotechnology Information Espaador no transcrito (non-transcribed spacer) Tampo fosfato dextrano (phosphate-buffered dextran) Reao em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction) DNA ribossomal Pares de bases

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Rex RNA RNAr RON SDS SSC st-a Tampo C U

Retroelemento isolado primariamente de Xiphophorus cido ribonuclico RNA ribossomal Regio organizadora de nuclolo Dodecil sulfato de sdio Soluo salina de citrato padro Cromossomo subtelo-acrocntrico Tampo de acoplamento (coupling) Univalente

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I. Introduo Geral I.1 Consideraes sobre os acars-disco A bacia amaznica considerada a maior bacia hidrogrfica do mundo e abriga uma das maiores ictiofaunas continentais, sendo estimada a presena de aproximadamente 3.000 espcies de peixes, dentre as quais muitas so comercializadas como peixes ornamentais (Chao, 1993; Santos & Ferreira, 1999; Chao, 2001). Um dos peixes de maior destaque na aquariofilia o acar-disco, facilmente reconhecido por sua forma discide e por seu corpo comprimido lateralmente, que apresenta um padro de barras verticais distribudas ao longo do mesmo, sendo estes peixes endmicos da bacia amaznica (Axelrod, 1978; Silva & Kotlar, 1980; Kullander, 1996). Alm disso, os indivduos possuem apenas um orifcio nasal de cada lado do focinho, boca prottil, lbios grossos, raios anteriores das nadadeiras dorsal e anal e os primeiros raios da ventral transformados em espinhos e linha lateral interrompida, caractersticas morfolgicas peculiares da famlia Cichlidae qual pertence (Paxton & Eschmeyer, 1995). Os discos so peixes onvoros, que consomem preferencialmente perifiton, detritos orgnicos, material vegetal e invertebrados aquticos pequenos. Estes peixes habitam preferencialmente lagos, florestas alagadas e igaraps de guas calmas, repletos de galhos, troncos e razes submersas. Apresentam em mdia, na idade adulta, 20 cm de comprimento e no possuem dimorfismo sexual evidente. Na natureza podem viver por aproximadamente trs anos e alcanam a maturidade reprodutiva em um ano. Os discos so monogmicos e despendem grande cuidado parental com ovos e alevinos, sendo estes alimentados por uma secreo mucosa da pele dos pais. Alm disso, so os nicos cicldeos neotropicais que formam agregaes sociais de mais de cem (100) indivduos durante os perodos de guas baixas, o que pode amenizar a predao, porm facilita o aumento da transmisso de doenas e parasitas (Ferreira et al., 1998; Bleher, 2006; Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007; Crampton, 2008).
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Os acars-discos pertencem ao gnero Symphysodon (Cichlidae, Perciformes), porm divergncias quanto taxonomia so comuns para este grupo. Este txon j foi considerado monoespecfico com subespcies, diespecfico com subespcies e atualmente compreende trs espcies, mas no existe consenso com relao nomenclatura dos grupos Figura 1 (Silva & Kotlar, 1980; Burgess, 1991; Mazerolli & Weiss, 1995; Kullander, 1996; 2003; Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Ready et al. (2006) propuseram S. discus para os indivduos conhecidos como Heckel na aquariofilia, S. aequifasciatus para os discos com colorao azul ou marrom e S. tarzoo para os indivduos verdes e provenientes da regio oeste da Amaznia. Em contrapartida, Bleher et al. (2007) propuseram que os indivduos verdes com pontos avermelhados pelo corpo, os quais so encontrados a oeste do arco do Purus, sejam chamados de S. aequifasciatus; os azuis e marrons, distribudos da foz do Amazonas at o baixo rio Ia, de S. haraldi; e os discos Heckel, encontrados nos rios Negro e Abacaxis, continuam sendo denominados de S. discus (Figura 1). Apesar da nomenclatura divergente, a distino entre as trs espcies sempre se baseia na colorao, no padro de barras verticais e pontos vermelhos ao longo do corpo, na distruio geogrfica (Figura 2) e em estudos moleculares envolvendo sequncias de DNA mitocondrial e nucleares (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Na aquariofilia, cruzamentos entre diferentes espcies/coloraes so utilizados para obteno de diferentes padres de tonalidades, cores, padro de listras e manchas ao longo do corpo. Estes indivduos hbridos alcanam valores exorbitantes na aquariofilia e, quando possvel, alguns continuam sendo utilizados como matrizes para a obteno de novos variantes (Bleher, 2006). Contudo, a reproduo dos acars-disco em cativeiro obtida com base em tentativas-erros, no considerando informaes genticas como ferramentas para seleo dos indivduos.

Bleher et al., 2007

S. haraldi

S. aequifasciatus

Heckel S. discus

Azul

Marrom

Verde

S. aequifasciatus

S. tarzoo

Ready et al., 2006

Figura 1: Classificaes taxonmicas atualmente propostas para o gnero Symphysodon. Note que a nica espcie onde existe consenso na nomenclatura Symphysodon discus, conhecido na aquarifilia como disco Heckel.
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Figura 2: Mapa de distribuio dos acars-disco na Amaznia. As cores no mapa referem-se colorao dos discos (marrom, azul e verde), com exceo do vermelho, que se trata do disco heckel. O tringulo em preto representa a cidade de Manaus, Amazonas (Modificado de Bleher, 2006).

I.2 Aspectos citogenticos dos acars-disco Alm de serem bastante apreciadas por aquaristas, as espcies do gnero Symphysodon tambm despertam o interesse de citogeneticistas, uma vez que as mesmas apresentam nmero diploide igual a 60 cromossomos (maior nmero diploide j encontrado para a famlia Cichlidae), sendo a maioria deles do tipo meta-submetacntricos. Estas caractersticas corroboram a posio derivada de Symphysodon nas rvores filogenticas propostas at o momento (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; Smith et al., 2008). So consideradas caractersticas citogenticas basais para Cichlidae, e tambm para a ordem Perciformes, a presena de 2n=48 cromossomos acrocntricos, regies organizadoras de nuclolo (RON) simples e presentes nos maiores pares cromossmicos e blocos de heterocromatina (banda C) evidenciados na regio pericentromrica de todos os cromossomos (Thompson, 1979; Kornfield, 1984; Feldberg & Bertollo, 1985; Brum & Galetti Jr., 1997; Feldberg et al., 2003). Diferentes frmulas cariotpicas j foram descritas para as espcies de Symphysodon (tabela 1), sendo grande parte desta variabilidade cromossmica intraespecfica creditada a divergncias na conceituais em relao a microcromossomos, subjetividade medida cromossmica, padres

diferenciados de condensao de cromossomos e braos cromossmicos com constries secundrias que no se coravam com Giemsa em algumas metfases mitticas (Gross, 2006). Quanto s regies organizadoras de nuclolo, variao intra e interespecfica encontrada em Symphysodon. Nascimento (2005) descreveu que S. haraldi (originalmente descrita na publicao como S. aequifasciatus, considerando nomenclatura vigente da poca) do igarap Croata (PA) apresentava RON simples, mas no mostrou quais eram os pares portadores desta regio. Regies organizadoras de nuclolo mltiplas foram evidenciadas em S. haraldi (pares 3, 5, 10, 11, 21 e 22) do rio Manacapuru (AM), S. discus (pares 18 e 24) da regio de Barcelos (AM) e S. aequifasciatus (pares 5, 10, 11, 15, 21, 22) do lago Bauna, proximidades de Tef (Amazonas) (Mesquita et al., 2008).
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Tabela 1- Variao cariotpica descrita para as espcies de Symphysodon. Espcies S. aequifasciatus S. aequifasciatus S. aequifasciatus S. aequifasciatus S. aequifasciatus1 S. discus S. discus S. haraldi 2 S. haraldi Frmula cariotpica 48m-sm + 8st-a + 4mi 50m-sm + 6st-a + 4mi 44m-sm + 16st-a 58m-sm + 2st-a 52m-sm + 8st-a 54m-sm + 6st-a 50m-sm + 10st-a 56m-sm + 4st-a 52m-sm + 4st-a + 4mi Local de coleta Tef, Amazonas, Brasil Tef, Amazonas, Brasil ------Aquarista Aquarista Barcelos, Amazonas, Brasil Barcelos, Amazonas, Brasil Igarap Croata, Par, Brasil Manacapuru, Amazonas, Brasil Referncia Mesquita et al. (2008) Mesquita et al. (2008) Ohno & Atkin (1966) Thompson (1979) Takai et al. (2002) Mesquita et al. (2008) Mesquita et al. (2008) Nascimento (2005) Mesquita et al. (2008)

Abreviaturas: a, acrocntrico; m, metacntrico; mi, microcromossomo; sm, submetacntrico; st, subtelocntrico. Classificao das espcies de acordo com Bleher et al. (2007). 1Espcie descrita originalmente como Symphysodon aequifasciata axelrodi; 2espcie descrita originalmente como S. aequifasciatus.

Com relao heterocromatina, esta sempre foi observada na regio pericentromrica de quase todos os cromossomos mitticos das trs espcies de Symphysodon, alm de blocos heterocromticos nas regies proximais de ambos os braos, ou mesmo ocupando braos cromossmicos inteiros, e muitas vezes intercalando as RONs, o que sugere um processo de heterocromatinizao e/ou acmulo de heterocromatina gradual no gnero (Takai et al., 2002; Nascimento, 2005; Gross, 2006; Mesquita et al., 2008). Numa anlise meitica efetuada nas espcies Symphysodon discus e Symphysodon haraldi (originalmente descrita na publicao como S. aequifasciatus, devido nomenclatura vigente), Gross (2006) encontrou durante a prfase I, a existncia de uma cadeia cromossmica multivalente apenas em S. haraldi, enquanto S. discus no apresentou a cadeia cromossmica, estando seus cromossomos organizados em 30 bivalentes. Cadeia cromossmica, tal como a observada nas clulas profsicas I de S. haraldi, um fato inusitado para peixes, principalmente os neotropicais, sendo descrita apenas em algumas espcies de plantas, de invertebrados, como Heteropternis obscurella e de outros vertebrados, como anuros e ornitorrincos. Vrias explicaes tem sido propostas para esclarecer a origem desta configurao meitica multivalente, de acordo com o observado para cada organismo. Em gafanhotos Heteropternis obscurella parece ocorrer uma associao terminal de cromossomos no homlogos na meiose I por meio de interaes entre grandes regies terminais banda-C positivas (John & King, 1982). No mamfero ornitorrinco as cadeias cromossmicas foram evidenciadas apenas em machos, sendo formadas, provavelmente, por meio de rearranjos entre cromossomos sexuais ancestrais e autossomos (Carrel, 2004). J nos anuros Physalaemus petersi e Eleutherodactylus binotatus, a configurao multivalente observada durante a meiose I foi resultante de heterozigosidade para mltiplas translocaes recprocas (Loureno et al., 2000; Siqueira-Jr et al., 2004). A origem da cadeia cromossmica meitica de S. haraldi no foi totalmente elucidada, requerendo uma anlise de mais as detalhada espcies do de comportamento cromossmico meitico todas

Symphysodon, incluindo S. aequifasciatus cujos dados meiticos ainda no foram descritos. I.3 Meiose e complexo sinaptonmico em peixes neotropicais Anlises meiticas mais refinadas, como a anlise do complexo sinaptonmico, tambm podem ajudar a compreender a diversidade dos organismos. O complexo sinaptonmico uma estrutura especializada e responsvel pela sinapse ou emparelhamento dos cromossomos homlogos durante a meiose, e ocorre na maioria dos organismos diploides durante o processo de formao dos gametas. Esta estrutura auxilia na compreenso dos eventos evolutivos que ocorreram na especiao dos txons, como identificao de nveis de ploidia observados pela formao de bivalente, trivalente, tetravalente, etc.; fuses cntricas e translocaes com a formao de figuras meiticas mltiplas; inverses e duplicaes com a visualizao de alas de inverso nas fases mais iniciais da prfase I (Moses et al., 1982; Zhang et al., 1992; Siqueira Jr et al., 2004). Em peixes neotropicais, o complexo sinaptonmico tem sido utilizado na anlise de cromossomos sexuais, do comportamento de cromossomos supranumerrios na meiose e na piscicultura, para se verificar os efeitos meiticos da formao de hbridos. Os primeiros resultados utilizando esta tcnica foram os de Dias (1995) e Dias et al. (1998), que analisando Astyanax scabripinnis e Prochilodus lineatus (ambos Characiformes), constataram que o nico cromossomo supranumerrio de Astyanax scabripinnis comportava-se como um univalente na meiose, enquanto os supranumerrios (zero a sete cromossomos) de Prochilodus lineatus associavam-se como bivalentes, trivalentes e tetravalentes, evidenciando uma possvel homologia entre eles. Para compreender o comportamento cromossmico de Hoplias malabaricus, que apresenta sistema sexual mltiplo (2n=36+X1X1X2X2 em fmeas e 2n=36+X1X2Y em machos), Bertollo & Mestriner (1998) analisaram a meiose e o complexo sinaptonmico dessa espcie. Por meio destas anlises, confirmou-se que nos machos os autossomos emparelhavam-se perfeitamente e que os cromossomos sexuais formavam um trivalente na meiose I e tinham uma segregao regular na anfase I e anfase II.
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O comportamento de cromossomos supranumerrios em meiose tambm foi estudado por Portela-Castro et al. (2001). Estes autores encontraram de um a dois supranumerrios em clulas somticas de machos de Moenkhausia sanctaefilomenae (Characidae), os quais nunca foram observados nas fmeas. Ao analisar o complexo sinaptonmico, verificou-se que durante a prfase I estes cromossomos apresentavam-se, na maioria das vezes, como pequenos bivalentes, o que poderia favorecer a sua transmisso e manuteno durante a evoluo cromossmica da espcie. Alm disso, a anlise do complexo sinaptonmico apresentou-se como uma boa ferramenta na piscicultura neotropical. Santos et al. (2002) utilizaram esta tcnica para demonstrar que o peixe tambacu, hbrido artificial de pacu (Piaractus mesopotamicus - macho) com tambaqui (Colossoma macropomum fmea) (Characiformes), possui uma meiose atpica, o que garante que a produo artificial destes hbridos no ocasione um processo de introgresso em relao s espcies parentais, no havendo assim o risco de extino dessas espcies. I.4 Citogentica molecular A anlise dos cromossomos mitticos e meiticos, condensados ou distendidos fundamental para a avaliao da diversidade gentica e evoluo cariotpica de um grupo, porm alguns rearranjos podem passar despercebidos quando empregadas apenas tcnicas clssicas. Para sanar este problema, a citogentica molecular surgiu para complementar os estudos por meio da identificao de sequncias de DNA especficas no cromossomo, consistindo basicamente no pareamento de determinado segmento de DNA ou RNA com uma seqncia de nucleotdeos complementar, situado na clula alvo (Artoni et al., 2000; Guerra, 2004). Na citogentica de peixes, a hibridizao fluorescente in situ (FISH) tem se revelado como importante ferramenta por permitir novas interpretaes da diversidade cariotpica, em particular sobre a origem de cromossomos sexuais e de supranumerrios, bem como sobre a organizao genmica de segmentos cromossmicos (Galetti Jr. & Martins, 2004).
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Com relao organizao genmica, tem sido constatado que genes de cpia nica ou de poucas cpias correspondem a uma pequena parte do genoma dos vertebrados (2-10%), quando comparado s regies repetitivas (Horvath et al., 2001). Eucariotos tem dois tipos de DNA altamente repetitivos: sequncias de DNA repetitivo dispersas e sequncias de DNA repetidas em tandem. As sequncias de DNA repetidas em tandem incluem os DNAs satlites e os DNAs ribossomais, enquanto as sequncias repetitivas dispersas englobam os elementos transponveis (Phillips & Reed, 1996; Martins, 2007). Estudos recentes em peixes neotropicais, como em Leporinus spp., Pimelodus spp., Serrasalmus spp., Triportheus spp. entre outros, tem utilizado a tcnica da hibridizao fluorescente in situ (FISH) com sondas de DNA ribossmico 18S para compreender a organizao das regies organizadoras de nuclolo (Martins & Galetti Jr., 1999; Garcia & Moreira-Filho, 2008; Nakayama et al., 2008; Diniz et al., 2009). Este mtodo considerado mais sensvel que a impregnao por nitrato de Prata e que a Cromomicina A3 porque localiza as sequncias de DNA ribossmico nos cromossomos, ao invs de marcar as protenas nucleolares envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais como ocorre com a impregnao com nitrato de Prata (Miller et al., 1976; Pends et al., 1993a,b; Phillips & Reed, 1996). Anlise da localizao fsica cromossmica do DNAr 5S tambm tem sido utilizada em estudos evolutivos de peixes (Martins & Galetti Jr., 1999; 2000; Martins, 2007). Outra classe importante de elementos repetitivos so os elementos transponveis, que so sequncias capazes de se integrar em novas localizaes do genoma e mobilizar sequncias no-autnomas, sendo que todos os tipos conhecidos destes elementos so encontrados nos genomas dos peixes (Volff et al., 2003; Ozouf-Costaz et al., 2004). Apesar de existirem poucos estudos, envolvendo a distribuio de elementos transponveis em caritipos de peixes neotropicais at o momento, a utilizao destas sequncias no mapeamento fsico cromossmico pode proporcionar maior esclarecimento acerca do genoma das espcies, de como este genoma est organizado e como ocorreu a sua evoluo. Alm disso, este conjunto de
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informaes pode ser empregado em estudos de gentica aplicada (Martins, 2007). Anlises citogenticas sequenciais j efetuadas em Symphysodon (colorao convencional com Giemsa, bandamento C e impregnao com nitrato de Prata), tanto para cromossomos mitticos quanto meiticos, vm mostrando uma grande variabilidade intra e interespecfica tanto em relao estrutura cromossmica como em relao aos marcadores RONs e banda C (Mesquita, 2002; Gross, 2006; Mesquita et al., 2008). Alm disso, a ocorrncia de uma cadeia cromossmica em clulas meiticas tem se mostrado uma caracterstica mpar entre os peixes neotropicais (Gross, 2006). Desse modo, o emprego de tcnicas de citogentica molecular como FISH, utilizando sondas de DNA ribossmico 5S e 18S e elementos retrotransponveis Rex3, so teis para auxiliar na compreenso da complexa organizao dos cromossomos nas espcies de Symphysodon. Alm disso, anlises meiticas, principalmente envolvendo complexo sinaptonmico, podem trazer informaes adicionais sobre os eventos que propiciaram a formao desta cadeia e como os cromossomos esto se emparelhando durante a meiose.

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I.5 Objetivos I.5.1 Geral Analisar os cromossomos mitticos e compreender o comportamento cromossmico meitico em populaes selvagens de Symphysodon aequifasciatus, Symphysodon discus e Symphysodon haraldi, procurando verificar a existncia de diferenas citogenticas entre os indivduos das coloraes selvagens, ou seja, disco verde, disco azul/marrom e disco heckel, encontrados na bacia amaznica e inferir sobre eventos que propiciaram a formao da cadeia cromossmica.

I.5.2 Especficos a) Determinar o caritipo dos acars-disco selvagens, de coloraes verde, azul/marrom e heckel, para verificar se existem diferenas citogenticas entre eles. b) Caracterizar o comportamento dos cromossomos nos diversos estgios da meiose de machos e fmeas destas espcies, para cada padro de colorao. c) Estabelecer o padro de distribuio da heterocromatina constitutiva e das regies organizadoras de nuclolo (com a impregnao por Prata e FISH) nos cromossomos mitticos e meiticos. d) Analisar o complexo sinaptonmico dos cromossomos formadores da cadeia cromossmica.

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II. Material e mtodos II.1 Material Foram estudados, citogeneticamente, 22 exemplares de acars-disco verde coletados (Symphysodon aequifasciatus - 14 machos e oito fmeas), 37 discos heckel (S. discus- 15 machos e 22 fmeas) e 49 marrom/azuis d(S. haraldi - 21 machos e 28 fmeas), adotando o mais recente esquema de classificao proposto por Bleher et al. (2007). Os indivduos foram coletados no estado do Amazonas, nas proximidades de Tef, Novo Airo e Manacapuru, respectivamente. Estes peixes foram mantidos vivos no Laboratrio de Gentica Animal do Instituto Nacional de Pesquisa da Amaznia INPA, Coordenao de Pesquisas em Biologia Aqutica, onde foram realizadas as anlises. Para a obteno de preparaes cromossmicas foi extrado o rgo hematopoitico de todos os indivduos e as gnadas dos machos e fmeas imaturas, sendo estes exemplares numerados, registrados, fixados em formol 10% durante 24h e acondicionados posteriormente em recipientes contendo lcool 70%. Dez espcimes de cada espcie foram depositados na coleo de peixes do INPA (INPA 28582, INPA 28583, INPA 28584) e os outros indivduos esto depositados na coleo de peixes do Laboratrio de Gentica Animal do INPA. Todo este estudo foi efetuado com permisso do IBAMA (Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e Recursos Naturais Renovveis, licena 011/2005 e licena permanente de Eliana Feldberg).

II.2 Mtodos II.2.1 Induo de mitoses Para se obter um maior nmero de clulas em metfase foi utilizada a tcnica para induo de mitoses descrita por Molina (2001), na qual o composto farmaceutico Munolan (Allergan Frumtost) foi dissolvido em gua (1 comprimido por mL de gua destilada), sendo esta soluo posteriormente injetada intraperitonialmente na regio dorso-lateral do peixe, na proporo de
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1mL para cada 100g de peso do animal. Os peixes submetidos ao tratamento foram colocados em aqurios bem aerados por 24 horas.

II.2.2 Obteno de cromossomos mitticos Para a obteno das preparaes cromossmicas mitticas foi utilizada a poro anterior e/ou posterior do rim, que o rgo hematopoitico dos peixes, segundo a tcnica alternativa para peixes descrita por Moreira-Filho & Bertollo (1990). Os acars-disco foram anestesiados em gua contendo gelo e sacrificados em seguida. O rim foi retirado e lavado em pequenos recipientes de vidro contendo soluo hipotnica de KCl a 0,075M, sendo transferido imediatamente para outro recipiente de vidro com cerca de 10mL da soluo hipotnica, onde foi dissociado com pinas de disseco e seringa desprovida de agulha, que serviu para aspirar e expirar suavemente a suspenso para dissociao do tecido renal e consequente separao das celulas. Uma soluo aquosa de colchicina a 0,0125% foi adicionada in vitro, na proporo de 0,5mL para 15mL de KCl. A suspenso celular obtida foi mantida em estufa a 37 C por 30 minutos. Aps este tempo, o material foi ressuspendido cuidadosamente com o auxlio de uma seringa sem agulha e transferido para um tubo de centrfuga, utilizando-se uma pipeta Pasteur. O fixador Carnoy foi preparado na proporo 3:1 (metanol: cido actico) e 0,3mL foram adicionados suspenso celular, que foi centrifugada durante 10 minutos a 900 rpm, sendo posteriormente descartado o sobrenadante. Novamente o material foi ressuspendido com o auxlio de uma pipeta Pasteur, 8mL de fixador Carnoy foram adicionados e a suspenso foi novamente centrifugada durante 10 minutos a 900 rpm, sendo este procedimento repetido por mais duas vezes. Aps a ltima centrifugao e a eliminao do sobrenadante, 1,5mL de fixador foram adicionados e o material ressuspendido com cuidado. Essa suspenso celular foi estocada em tubo de 1,5 ml e mantida em freezer para posterior utilizao.

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II.2.3 Preparao das lminas com cromossomos mitticos Para a preparao das lminas com cromossomos mitticos, as mesmas foram lavadas, secas ao ar e posteriormente imersas em gua destilada a 50 C, em banho-maria. Aps cinco minutos, as lminas foram retiradas da gua de forma a manter uma pelcula de gua sobre a sua superfcie, na qual foi gotejada a suspenso celular em diferentes regies. II.2.4 Obteno de cromossomos meiticos Para a obteno das preparaes cromossmicas meiticas foram utilizadas gnadas masculinas e femininas (imaturas), empregando-se a tcnica descrita por Bertollo et al. (1978), com algumas modificaes propostas por Gross (2006). Para caracterizao das diferentes fases meiticas, as gnadas no foram tratadas com soluo de colchicina. Aps o sacrifcio do peixe, os testculos e ovrios imaturos foram seccionados em fragmentos bem pequenos e colocados em soluo hipotnica de KCl a 0,075M por 30 minutos. Logo aps, o material foi transferido para uma cubeta contendo fixador Carnoy (3 partes de metanol: 1 parte de cido actico) recm-preparado, por 20 minutos. Aps este perodo, o fixador foi descartado, sendo este processo de fixao repetido por mais duas vezes. Em seguida, o material foi guardado em refrigerador a 4 C, em tubos de 1,5 ml com fixador Carnoy para ser processado posteriormente, ou ento fragmentos foram retirados do fixador e secos em papel de filtro para a continuao da tcnica. Aps o fragmento gonadal estar seco, este foi colocado sobre uma lmina limpa e macerado em 1mL de cido actico 50%, com o auxlio de um basto de vidro. O material foi seco sobre a lmina em uma placa aquecedora a 40 C, sendo posteriormente corado com Giemsa 5% em tampo fosfato 0,06M e pH 6,8 por 10 minutos e lavado em gua de torneira e a lmina seca diretamente ao ar.

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II.2.5

Deteco

das

regies

organizadoras

de

nuclolos

nos

cromossomos mitticos e meiticos Para a caracterizao das regies organizadoras de nuclolos (RON) foi utilizada a tcnica descrita por Howell & Black (1980), que consistiu em pingar sobre a preparao cromossmica 1mL de uma soluo coloidal, obtida com 1g de gelatina comercial sem sabor dissolvida em 50mL de gua destilada e acrescida de 0,5mL de cido frmico. Em seguida, foram adicionados sobre a soluo coloidal 2mL de soluo aquosa de AgNO3 (nitrato de Prata) a 50%, agitando levemente a lmina, que foi coberta com uma lamnula. A lmina foi colocada em cmara mida, em banho-maria a 60 C, por um perodo varivel de 3 a 8 minutos, at atingir uma colorao marrom dourada, sendo ento lavada em gua destilada, permitindo que a lamnula fosse retirada naturalmente pela prpria gua. As lminas secaram diretamente ao ar, sendo posteriormente coradas com Giemsa 5% em tampo fosfato 0,06M e pH 6,8 por 1 minuto, lavadas em gua de torneira e secas novamente ao ar. II.2.6 Deteco da heterocromatina constitutiva nos cromossomos mitticos e meiticos Para a caracterizao da heterocromatina constitutiva foi utilizada a tcnica de banda C descrita por Sumner (1972), com algumas modificaes. As lminas contendo as preparaes cromossmicas foram tratadas durante 2 minutos com HCl 0,2N a 46 C, lavadas em gua destilada temperatura ambiente e secas ao ar. Em seguida, as preparaes cromossmicas mitticas foram incubadas a 46 C, em soluo de hidrxido de brio a 5%, filtrada e recm preparada, por 1minuto e 30 seguntos e as meiticas por 4 minutos e 30 segundos. A ao do hidrxido de brio foi interrompida imergindo-se rapidamente a lmina em soluo de HCl 0,2N (46 C), sendo posteriormente lavada em gua destilada. Aps secas, as lminas foram incubadas em soluo 2xSSC (cloreto de sdio 0,3M e citrato trisdico 0,03M, pH 6,8), em banho-maria a 60 C, por um perodo de 15 minutos, sendo posteriormente secas ao ar, coradas com Giemsa 5% em tampo fosfato 0,06M e pH 6,8 por 20 minutos, lavadas em gua de torneira e secas novamente ao ar.
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II.2.7 Hibridizao fluorescente in situ (FISH)

Para a hibridizao fluorescente in situ foi utilizada a tcnica descrita por Pinkel et al. (1986), com algumas modificaes. II.2.7.1. Extrao do DNA Para extrao do DNA foi utilizado tecido muscular de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, seguindo o protocolo de Sambrook & Russell (2001), com algumas modificaes. Para tanto, foi utilizado o tampo de lise (Tris-HCl 10 mM em pH 8,0 , NaCl 0,3 M, EDTA 10 mM, Urea 4 M, SDS 1%) de Estoup et al. (1993) e Asahida et al. (1996). Posteriormente foram acrescentados: 15 L de proteinase K (10 mg/mL) e 6 L de RNAse (10 mg/mL). As amostras foram incubadas para que o tecido fosse totalmente digerido. A seguir foram feitas lavagens sucessivas com fenol, fenol e clorofrmio, lcool isoamlico e clorofrmio hidratado (500 L de cada um destes reagentes). Aps a lise, o DNA foi separado das protenas por precipitao salina juntamente com centrifugao a 14.000 rpm. A fase aquosa (sobrenadante) que contm o DNA foi separada em um novo tubo e o DNA precipitado com volume de isopropanol 100% igual ao volume da fase aquosa obtida. Em seguida a amostra foi submetida a centrifugao, o sobrenadante descartado e o tubo contendo pellet de DNA colocado para secar. Ao final, o DNA foi hidratado com aproximadamente 100 L de gua milli-Q, dependendo da quantidade do pellet de DNA formado. Para possibilitar a anlise da quantidade e integridade do material, o DNA extrado foi quantificado por comparao com marcador de concentrao conhecida, em eletroforese padro (com tampo Tris-Borato-EDTA 0,5X e corrida a 70 V por 40 minutos) em gel de agarose 1,5% e corado com Sybr Safe (1:10.000). A visualizao e anlise do DNA no gel foram feitas no fotodocumentador Easy Doc 100 (BioAgency), o qual possui acoplado um transluminador de luz ultravioleta (260 nM).

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II.2.7.2. Obteno das sondas via PCR e marcao por kit nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) Para a obteno das sondas do elemento retrotransponvel Rex 3 e de DNAr 5S e DNAr 18S foi utilizado o DNA genmico extrado do msculo de Symphysodon spp. A sondas foram obtidas por amplificao por Reao em Cadeia da Polimerase (PCR - Saiki et al., 1988) utilizando os primers: - Rex3 (RTX3-F3 5` CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG e RTX3-R3 5` TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT) (Volff et al., 1999; 2001); DNAr DNAr 5S 18S (A 5-TACGCCCGATCTCGTCCGATC-3 (IpF 5CCGCTTTGGTGACTCTTGAT e e B 5IpR CAGGCTGGTATGGCCGTAAGC-3) (Komiya & Takemura, 1979); 5CCGAGGACCTCACTAAACCA) desenhados a partir da sequncia completa do gene RNAr 18S de Ictalurus punctatus disponvel nos bancos de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (cdigo identificador da sequncia AF021880). Os ciclos de amplificao seguiram as seguintes etapas: a) Rex3: 2 minutos a 95 C (desnaturao); 35 ciclos de um minuto a 95 C, 40 segundos a 55 C, 2 minutos a 72 C (amplificao); 5 minutos a 72 C (extenso); b) 5S: 5 minutos a 94 C (desnaturao); 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 61 C e 45 segundos a 72 C; 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 59 C e 45 segundos a 72 C; 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 57 C e 45 segundos a 72 C; 25 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 61 C e 45 segundos a 72 C (amplificao); 7 minutos a 72 C (extenso); c) 18S: 2 minutos a 94 C (desnaturao); 35 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 55 C, 1 minuto e 40 segundos a 72 C (amplificao); 7 minutos a 72 C (extenso). As reaes de PCR foram feitas em um termociclador Eppendorf Mastercycler Gradient, para volume final de 25 L (1 L de DNA genmico; 2,5 L de Tampo 10X com cloreto de magnsio; 0,25 L de Taq DNA polimerase;

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1,5 L de dNTP (1 mM); 1,5 L de cada primer (5 mM); gua milli-Q para completar o volume). As sondas foram marcadas por biotina 14-dATP por nick translation, seguindo protocolo do fabricante (Bionick labeling system-Invitrogen). Para tanto, em um tubo de eppendorf de 1,5 mL, mantido no gelo, foi preparado uma soluo contendo 1 L de Mix dNTP 10x; 1 L de sonda de DNA (200 ng/ L); 1 L de Mix de enzima 10x; 6 L de gua milli-Q, totalizando 9 L, para cada lmina a ser hibridizada. Esta soluo foi homogeneizada, centrifugada brevemente e incubada a 16 C por 45 minutos no termociclador. Em seguida, para interromper a reao, foi adicionado 1 L de stop buffer contendo 1 L de acetato de sdio 3M. Para a precipitao da sonda marcada foram adicionados 22 L de etanol 100% gelado e deixado precipitar em freezer -70 C por duas horas. Decorrido este tempo, a sonda foi centrifugada por 15 minutos a 15.000 rpm a 4 C, o sobrenadante foi descartado com cuidado e o tubo contendo a sonda seco a temperatura ambiente. Aps seca, a sonda foi ressuspendida com 6 L de gua milli-Q. Adicionalmente, as sondas de Rex3 foram marcadas por nick translation usando digoxigenina (Roche) e usadas em hibridizaes duplas com o DNAr 5S, sendo os cromossomos contra-corados com DAPI.

II.2.7.3. Hibridizao cromossmica mittica e meitica II.2.7.3.1. Desnaturao dos cromossomos e tratamento com RNAse Lminas recm-preparadas com cromossomos foram desidratadas em lcool 70, 85 e 100% gelado, por cinco minutos cada. O DNA cromossmico das preparaes mitticas foi desnaturado por 10 segundos em formamida 70% (70 mL de formamida e 30 mL de 2xSSC), pH 7,0 a 67 C e o das preparaes meiticas por 15 segundos. Aps a desnaturao, as lminas foram novamente desidratadas em srie alcolica gelada (70, 80 e 100%, cinco minutos cada). Em seguida, as lminas foram lavadas em tampo PBS 1x (7,58 g de cloreto de sdio 1,36M; 0,993 de fosfato de sdio dibsico Na2HPO4; 0,414g de fosfato de sdio monobsico- NaH2PO4; completar para volume de 1000 mL com gua milli-Q) durante cinco minutos, em temperatura ambiente. Em seguida as
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lminas foram desidratadas em srie alcolica gelada (70, 80 e 100%, cinco minutos cada) e incubadas em 90g de RNase (3,2 L de Rnase 10 mg/mL e 796,8 L de 2xSSC), sob lamnula, a 37 C por 1 hora em cmara mida. Para interromper a degradao do RNA as lminas foram lavadas trs vezes por cinco minutos cada com 2xSSC (removendo as lamnulas antes da primeira lavagem) e uma vez em PBS 1x durante 5 minutos.

II.2.7.3.2. Desnaturao da sonda e hibridizao Para cada lmina a ser hibridizada foi adicionado, em um tubo eppendorf, 6 L da sonda, 15 L de formamida (concentrao final de 50%), 6 L de sulfato de dextrano 50% (concentrao final de 10%) e 3 L (1/10) de 20xSSC (concentrao final de 2xSSC), totalizando um volume de 30 L. A sonda foi desnaturada a 95 C por cinco minutos em termociclador e em seguida colocada imediatamente no gelo. A soluo de hibridizao foi colocada sobre uma lminula e a lmina desnaturada invertida foi colocada sobre a lamnula. Para a hibridizao as lminas permaneceram com o material voltado para baixo em cmara mida (2xSSC), a 37 C, por cerca de 12 horas. Decorrido este tempo, a lamnula foi removida e a lavagem ps-hibridizao ocorreu a 72 C em 2xSSC, pH 7,0 por 5 minutos. Em seguida as lminas foram imersas em tampo PBD, pH 7,0 (20 mL de 20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em p desnatado; gua destilada). Para a deteco das sondas foi aplicado em uma lamnula 4 L de FITC-Avidina conjugada 0,07% (Sigma) e 26 L de Tampo C (0,1M de bicarbonato de sdio pH 8,5 e 0,15M cloreto de sdio), sendo a lmina colocada invertida sobre a lamnula e incubada durante 30 minutos em cmara mida a 37 C. Aps isso a lamnula foi removida e as lminas lavadas trs vezes em tampo PBD a 45 C, por dois minutos cada. Em seguida, duas sries de amplificao de sinal foram efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em tampo PBD (1 l de antiavidina estoque em 19 l 1xPBD por lmina), sendo as lminas incubadas 10 minutos em cmara mida a 37 C. Cada tratamento com antiavidina-biotina conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em Tampo C (4 L FITC-Avidina 0,07% e 26 L de Tampo C), com incubao por 10 minutos
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em cmara mida a 37 C. Depois de cada passo de amplificao, as lminas foram lavadas trs vezes em tampo 1xPBD a 45 C por 2 minutos cada. Os cromossomos foram contracorados com iodeto de propdeo 0,2% diludo em antifade Vector (20 L de antifade e 0,7 L de iodeto de propdeo 50 g/mL) e cobertos com lamnula para proceder a anlise imediata. As anlises foram efetuadas em Microscpio Olympus Bx-51 e as metfases capturadas atravs do Programa Image PRO MC60. II.2.7.4. Caracterizao das sondas de DNA II.2.7.4.1. Construo de vetores plasmidiais recombinantes contendo fragmentos de DNA obtidos por PCR A construo de vetores plasmidiais recombinatnes contendo

fragmentos de DNA (produtos de PCR) foi realizada para a caracterizao destes segmentos de DNA, no Laboratrio Temtico de Biologia MolecularINPA. O kit de ligao pGEM-T Easy Vector System I (Promega) foi utilizado para ligao dos fragmentos de interesse ao plasmdeo pGEM-T, seguindo as especificaes do fabricante. Para tanto, para cada amostra foi adicionado em um eppendorf de 1,5 mL: 1,5 L de gua milli-Q, 5 L de Tampo, 1 L de plasmdeo, 1,5 L de produto de amplificao, 1 L de T4 DNA ligase, sendo esta soluo incubada a 4 C overnight (cerca de 12 horas).

II.2.7.4.2. Transformao As construes recombinantes obtidas foram utilizadas para a transformao de clulas competentes de Escherichia coli DH5 (cedidas pelo Dr. Spartaco Astolfi Filho - UFAM). As clulas competentes foram retiradas do freezer -70 oC e colocadas em recipiente com gelo mantido dentro do fluxo laminar para descongelar. Em um tubo de 1,5 ml contendo 50 L de bactrias competentes foram adicionados 5 L de plasmdios recombinantes, seguido de leve agitao. A mistura foi deixada no gelo por 30 minutos. Transcorrido este tempo, a amostra de transformao foi colocada em banho-maria a 37 C por um minuto e, em
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seguida, voltou ao gelo por dois minutos o que possibilitou o choque trmico e permitiu que os poros da membrana se abrissem mais e internalizassem o DNA plasmidial. Posteriormente foram adicionados e misturados com muito cuidado 950 L de meio lquido LB (peptona 1%; cloreto de sdio 0,17M; extrato de levedura 0,5%, pH 7,5), sendo a mistura incubada em um agitador (shaker) 225 rpm por uma hora para que as bactrias comeassem a recuperar a parede celular. Faltando 15 minutos para acabar a incubao, as placas com meio LB slido (peptona 1%; cloreto de sdio 0,17M; extrato de levedura 0,5%, gar 1,5%, pH 7,5) contendo 2 L de amplicilina foram retiradas da geladeira e foi adicionado 35 L de X-Gal, deixando-as semi-abertas. Ao trmino da incubao os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm e o sobrenadante foi descartado por inverso do tubo. O meio de cultura lquido restante no tubo foi utilizado ressuspender com cuidado as bactrias recombinantes que foram posteriormente adicionadas placa e espalhadas com ala de vidro flambada e frio. Aps secas, as placas foram incubadas viradas para baixo em uma estufa a 37 C overnight (cerca de 12 horas), at haver o crescimento das colnias. As colnias recombinantes apresentaram colorao branca e foram selecionadas. Cada colnia foi retirada com uma ponteira e colocada em uma soluo de PCR padro (11,7 L de gua, 5 L de dNTP, 1 L de cada primer, 2,5 L de tampo, 0,19 L de Taq), utilizando os primers universais M13 (F 5-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3; R 5CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'). Os clones recombinantes resultantes foram estocados em glicerol 70% e armazenados em freezer a -80 C.

II.2.7.4.3. Sequenciamento das sondas de DNA Para verificar se o fragmento amplificado por PCR correspondia s regies de interesse, o sequenciamento do DNA foi realizado pelo mtodo de Sanger et al. (1977), com terminadores marcados com fluorescncia. Para a realizao das reaes de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (GE HealthCare), no qual cada dideoxinucleotdeo (terminador) marcado com fluorescena (responsvel pela
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ativao do segundo elemento) e um dos quatro tipos de rodamina, cuja fluorescncia captada pelo sequenciador automtico de DNA. As reaes de sequenciamento foram realizadas em placas de 96 poos, utilizando-se entre 150 e 300 ng do produto de PCR purificado; 5 pmol de cada primer em reaes separadas; 4 L do premix (kit) e gua mili-Q para completar o volume de 10 L. Essas reaes foram feitas em um termociclador Eppendorf - Mastercycler Gradient, em 30 ciclos sendo: desnaturao a 95 C por 20 segundos, anelamento a 50 C por 15 segundos e extenso a 72 C por 1 minuto e 30 segundos. Os primers utilizados no sequenciamento foram os mesmos utilizados para o PCR. Depois de sequenciado, os fragmentos foram submetidos a um tratamento de precipitao para a eliminao de produto no incorporado durante a reao de sequenciamento. Logo aps foi realizada a leitura automtica do fragmento no sequenciador automtico de DNA MegaBACE 1000 (GE HealthCare), nas condies de injeo e corrida recomendadas pelo fabricante. As amostras sequenciadas foram salvas (formato abd) e transferidas do sequenciador para outro computador. As sequncias geradas foram comparadas com sequncias depositadas no banco de dados pblico na Internet, GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), por uma procura realizada com o programa BLAST. Este procedimento foi realizado para determinar se o fragmento sequenciado realmente correspondia ao gene de interesse. Depois de conferidas, todas as sequncias foram alinhadas utilizando-se o programa de alinhamento mltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que est incluso no BioEdit v. 5,0,6 (Hall, 1999). O alinhamento gerado foi manualmente conferido e editado no mesmo programa.

II.2.8 Microespalhamento para visualizao do complexo sinaptonmico Para obteno do complexo sinaptonmico a partir de gnadas masculinas foi utilizada a tcnica descrita por Moses (1977), Dresser & Moses (1980), colorao por Howell & Black (1980), com algumas modificaes.

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Para tanto, as gnadas masculinas foram retiradas e lavadas em soluo de Hanks, sendo posteriormente colocadas numa placa escavada contendo a mesma soluo. Com o auxlio de duas pinas, o material foi dissociado, sendo os pedaos maiores descartados. Em seguida, o material foi macerado em uma placa escavada e ressuspedido vrias vezes com o auxlio de uma seringa sem agulha, sendo ento transferido para um tubo de centrfuga, onde foram adicionados 6 mL de soluo de Hanks. Com o auxlio de uma pipeta Pasteur o material foi ressuspendido e, logo aps, centrifugado por 4-5 minutos a 800 rpm. A maior parte do sobrenadante foi descartada, deixando-se cerca de 1-1,5 vezes o volume do pellet celular. O pellet foi ressuspendido com o que restou do sobrenadante, sendo esta suspenso mantida em gelo durante o preparo das lminas. Em um suporte cncavo com parafilme aderido superfcie, foi colocado 1,5 mL de soluo de NaCl 0,5% formando uma gota arredondada, onde foi colocada 0,3 mL da suspenso celular, com o auxlio de uma pipeta Pasteur de ponta bem fina, cuidando para que esta no afundasse. Em seguida, uma lmina plastificada preparada anteriormente (utilizando soluo de plstico a 0,6% (peso/volume) diluda em clorofrmio) foi encostada sobre a superfcie da gota de NaCl 0,5% contendo a suspenso celular, sendo esta levantada paralelamente gota. A lmina foi ento imersa numa soluo fixadora de paraformaldedo 4% acrescida de 1,5 mL de dodecilsulfato de sdio (SDS) 0,3%, por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida a lmina foi transferida para numa soluo fixadora de paraformaldedo 4%, pH 8,2, por 5 minutos em temperatura ambiente. Aps seca, a lmina foi imersa na soluo de photo-floo (Kodak) 0,4%, pH 9,0, por 15 segundos em temperatura ambiente. Por ltimo, a lmina foi retirada da soluo de photo-floo, teve sua parte de trs limpa com leno de papel e deixada secar naturalmente, em ambiente livre de poeira. Aps secarem, as lminas foram impregnadas com nitrato de Prata. Para tanto, foi colocada sobre a lmina 1 mL de uma soluo coloidal reveladora (1g de gelatina em 50 mL de gua destilada com 0,5 mL de cido frmico) e 2 mL de soluo de nitrato de Prata (AgNO3) a 50%, sendo a lmina coberta com lamnula e incubada em cmara mida, a 60 C, at atingir colorao marrom-dourada
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(geralmente 2-3 minutos), quando foi lavada em gua destilada, permitindo que a lamnula fosse retirada naturalmente pela prpria gua. As lminas secaram diretamente ao ar. Normalmente duas lminas por indivduo foram feitas, sendo uma destinada para anlise em microscopia ptica, objetiva de 100x e outra para a microscopia eletrnica. Para a observao em microscopia eletrnica, o plstico que recobria as lminas foi cortado com um estilete e a lmina mergulhada lentamente numa coluna de gua, com uma inclinao de 60, para o descolamento do plstico, o qual permanecia na superfcie. Com uma pina delicada, as telinhas metlicas (grids) Mash 50 foram colocadas sobre o plstico flutuante. Em seguida este plstico com as telas foi capturado com um retngulo de parafilme, o qual secou naturalmente. As telinhas contendo o material a ser analisado foram guardadas em pequenas caixas prprias, para posterior anlise em microscpio eletrnico, a qual foi feita no microscpio eletrnico Philips, do departamento de microscopia da Universidade Estadual Paulista, UNESP-Botucatu.

II.2.9 Anlises cromossmicas As preparaes mitticas e meiticas (anlises convencionais e FISH) foram analisadas em microscpio ptico e/ou fotomicroscpio de epifluorescncia Olympus Bx-51 do Laboratrio de Gentica Animal-CPBA, INPA e Olympus Bx-61 do Laboratrio de Genmica Integrativa UNESPBotucatu, em objetiva de imerso. As melhores preparaes cromossmicas foram selecionadas e tiveram sua imagem capturada. A montagem dos caritipos foi feita a partir de cromossomos metafsicos mitticos, os quais foram recortados, tentativamente emparelhados, medidos e colocados em ordem decrescente de tamanho. A relao de braos dos cromossomos mitticos foi determinada de acordo com a proposta de Levan et al. (1964). Devido dificuldade de emparelhamento cromossmico, o qual peculiar nos cicldeos, uma vez que estes apresentam tamanhos e morfologia cromossmica similar, os cromossomos foram agrupados segundo Thompson (1979) e Mesquita et al. (2008), sendo consideradas trs categorias: metasubmetacntricos, subtelo-acrocntricos e microcromossomos. Foram
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considerados microcromossomos os cromossomos com tamanho pequeno (de 0,5 a 1,5 m) e que aparecem na maioria das metfases como pontos. Como os centrmeros destes cromossomos no so evidentes na maioria das metfases difcil estabelecer a morfologia cromossmica (para reviso sobre microcromossomos ver Mesquita et al., 2008). Para interpretao da meiose foram consideradas as seguintes fases: leptteno/zigteno, paquteno, diplteno, diacinese, metfase I e metfase II, dando maior nfase ao diplteno, diacinese, metfase I e metfase II. Para a anlise do complexo sinaptonmico as clulas paquitnicas e diplotnicas que apresentaram boas condies de extenso do segmento emparelhado tiveram sua imagem capturada em fotomicroscpio de epifluorescncia Olympus Bx-51 do Laboratrio de Gentica Animal-CPBA, INPA ou foram fotografadas no microscpio eletrnico Philips (Centro de Microscopia Eletrnica- UNESP-Botucatu, SP), em filme 35mm, com exposio de 2,04 segundos. Os negativos foram revelados em revelador Dektol (Kodak) diludo em gua, na proporo de 4:1, em temperatura ambiente, por 7 minutos, e fixao em fixador Kodak durante 13 minutos. As imagens foram ampliadas e reveladas em papel Kodabrome Print RC F3 (Kodak).

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III. Resultados e discusso Os resultados obtidos com a anlise citogentica das trs espcies do gnero Symphysodon e a discusso destes dados so apresentados na forma de quatro artigos cientficos, mencionado a seguir: III.1.Artigo 1 - Intrigante evidncia de translocaes em acars-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossmica meitica em vertebrados. Publicado no peridico Heredity 102: 435-441. III.2.Artigo 2: Anlise citogentica comparativa das espcies do gnero Symphysodon (Cichlidae): caractersticas cromossmicas de retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal. Enviado para publicao no peridico Cytogenetic and Genome Research, em 13/07/2009. Aceito para publicao em 24/08/09. Primeira reviso efetuada em 25/08/09. III.3.Artigo 3: Variabilidade intra e interespecfica do locus do DNAr 18S entre acars-disco Symphysodon: rearranjos cromossmicos. Enviado para publicao no peridico Journal of Fish Biology, em 09/06/2009. Aceito para publicao em 10/08/2009. Primeira reviso efetuada em 20/08/2009. III.4.Captulo 4: Complexo sinaptonmico em acars-disco: cadeia

cromossmica meitica. A ser enviado para publicao no peridico Micron.

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III.1.Artigo 1: Intrigante evidncia de translocaes em acars-disco (Symphysodon, Cichlidae) e relato da maior cadeia cromossmica meitica em vertebrados

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III.1.1. Introduo Os acars-disco, gnero Symphysodon Heckel, 1840, formam o grupo mais intrigante e distinto entre os cicldeos sulamericanos devido morfologia de seu corpo, aos padres de colorao e caractersticas cromossmicas (Kullander, 1996; Feldberg et al., 2003; Ready et al., 2006). Nos ltimos quarenta anos algumas publicaes tem indicado que Symphysodon tem o maior nmero diploide de todos os cicldeos, sendo a maioria das informaes referentes Symphysodon aequifasciatus (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et al., 2002). Recentemente, Mesquita et al. (2008) demonstraram que S. discus e S. haraldi tambm apresentam um caritipo derivado. Todas as espcies do gnero Symphysodon possuem um elevado nmero diploide (2n=60), com predominncia de cromossomos meta-submetacntricos, variao morfolgica inter e intraespecfica e microcromossomos (ver Tabela 1 Introduo Geral, pgina 20). O alto nmero diploide detectado em Symphysodon j foi explicado de duas formas: como uma consequncia de poliploidizao (Thompson, 1976) e por meio de rearranjos cromossmicos, como inverses pericntricas, translocaes e fisses/fuses (Mesquita et al., 2008). As diferentes frmulas cariotpicas descritas para as diferentes espcies de acars-disco podem ter sido ocasionadas por enganos na classificao dos cromossomos, uma vez que o nvel de condensao dos cromossomos pode interferir nas anlises e a maioria dos autores no empregou a terminologia microcromossomo. Alm disso, a falta de consenso na classificao taxonmica das espcies pode tambm ter gerado erros. O caritipo das trs espcies apresenta blocos heterocromticos localizados principalmente na regio pericentromrica de todos os cromossomos e na regio proximal de braos curtos e longos de alguns pares (Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008). Com relao regio organizadora de nuclolo (RON), Takai et al. (2002) detectaram um sistema de RON simples em S. aequifasciatus, usando impregnao por nitrato de Prata. Entretanto, Mesquita et al. (2008) descreveram um sistema de RONs mltiplas em S.

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aequifasciatus (cromossomos dos pares 5, 10, 11, 15, 21 e 22), S. discus (18 e 24) e S. haraldi (3, 5, 10, 11, 21 e 22). A anlise de configuraes meiticas tem sido utilizada para confirmar a ocorrncia de poliploidizao, eventos de duplicao e rearranjos cromossmicos que ocorreram durante a evoluo de mamferos e outros grupos de vertebrados (Villena & Sapienza, 2001; Dumas & Britton-Davidian, 2002; Siqueira-Jr et al., 2004; Gallardo et al., 2006). Se poliploidizao ou rearranjos cromossmicos tiverem ocorrido, o pareamento cromossmico meitico pode ser complexo e resultar em gametas balanceados ou desbalanceados (Sharp & Rowell, 2007). Assim como em outros telesteos, o estudo de cromossomos meiticos em cicldeos neotropicais tem sido negligenciado. Os poucos relatos encontrados na literatura descrevem caractersticas notveis, como discordncia entre nmero cromossmico de clulas somticas e gonadais em Gymnogeophagus balzanii (Feldberg & Bertollo, 1984). Neste estudo foram investigados os cromossomos meiticos de espcies selvagens de Symphysodon, enfatizando a configurao da complexa cadeia cromossmica meitica que nunca havia sido encontrada em peixes. Esta informao poder contribuir para o entendimento dos rearranjos cromossmicos envolvidos na carioevoluo deste grupo de peixe.

III.1.2. Material e mtodos Os acars-disco foram coletados em seus habitats naturais na bacia Amaznica, estado do Amazonas, Brasil. Os peixes foram identificados de acordo com a taxonomia de Bleher et al. (2007), isto , S. aequifasciatus (disco verde), S. discus (discos Heckel) e S. haraldi (disco azul/marrom). Trinta e cinco machos e nove fmeas de Symphysodon spp. foram analisados neste estudo, com licena do IBAMA (11/2005): oito machos e trs fmeas de S. aequifasciatus do rio Tef; 15 machos e trs fmeas de S. discus do rio Negro (proximidades de Novo Airo) e 15 machos e trs fmeas de S. haraldi do rio Manacapuru (Figura 1). Espcimes testemunhos foram depositados na Coleo de Peixes do Instituto Nacional de Pesquisas da
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Amaznia (INPA), Manaus, Amazonas, Brasil (INPA 28582, INPA 28583, INPA 25498).

Figura 1 Espcies selvagens de Symphysodon analisadas, suas distribuies geogrficas na bacia Amaznica (modificado de Bleher, 2006) e os paleoarcos de Caravari e Purus. a) Symphysodon aequifasciatus; b) S. discus; c) S. haraldi; d) Mapa geogrfico mostrando os locais de amostragem dos discos: a, Tef; b, Novo Airo; c, Manacapuru.

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Preparaes cromossmicas meiticas foram obtidas utilizando clulas gonadais, segundo protocolo descrito por Bertollo et al. (1978), com modificaes. Testculos e ovrios imaturos de indivduos no submetidos colchicinizao foram colocados em soluo hipotnica (KCl 0,075M) por 30 minutos e fixados em Carnoy (3 metanol : 1 cido actico) por 20 minutos; este ltimo tratamento foi repetido por trs vezes. A seguir, as gnadas foram maceradas em cido actico 50% sobre uma lmina e secas sobre uma placa de metal aquecida temperatura de 45 C. Todas as preparaes cromossmicas foram coradas com soluo de Giemsa 5% por 10 minutos. A heterocromatina constitutiva foi detectada pela tcnica de Sumner (1972) e as regies organizadoras de nuclolo foram impregnadas pelo on Prata de acordo com a tcnica de Howell & Black (1980).

III.1.3. Resultados Poucas fmeas foram analisadas devido presena de grande quantidade de vitelo nas fmeas maduras, sendo que este fator interfere na tcnica utilizada, tornando-a impraticvel. As clulas gonadais em intrfase e prfase I de machos e fmeas de S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi no apresentaram regies heteropicnticas positivas que indicassem a presena de cromatina sexual (Figura 2 a, b, c). O comportamento cromossmico de algumas fases meiticas de S. aequifasciatus e S. haraldi foi similar, mas diferenas foram detectadas em S. aequifasciatus/S. haraldi e S. discus. Uma cadeia cromossmica multivalente e 20 bivalentes foram observados no diplteno de espermatcitos e ocitos de S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura 2 d, e) e 30 bivalentes foram detectados em S. discus (Figura 2 f). Nas trs espcies, a maioria dos bivalentes apresentou dois quiasmas terminais. A cadeia cromossmica (C) observada em clulas diplotnicas de S. aequifasciatus e S. haraldi provavelmente composta por 20 elementos, porque at 20 bivalentes (II) foram encontrados nesta fase. Embora 2n=20II+CXX (onde CXX significa cadeia cromossmica meitica composta de 20 elementos) represente o maior grau de pareamento cromossmico observado em dipltenos de S. aequifasciatus e S. haraldi, somente 2% das
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clulas analisadas apresentaram esta configurao. Nas duas espcies, a configurao mais frequente foi uma cadeia cromossmica linear com nmero varivel de elementos, assim como o nmero de bivalentes e univalentes (Figura 3). Esta variao pode ser explicada pela dinmica do ciclo de diviso celular (diplteno precoce, intermedirio e tardio). Assim, quando o nmero de elementos da cadeia e/ou bivalentes diminui, o nmero de univalentes aumenta e uma cadeia cromossmica linear pode ser detectada. Desta forma, durante a diacinese de S. aequifasciatus e S. haraldi uma cadeia cromossmica em anel e um nmero varivel de bi- e univalentes foram visveis (Figura 2 g, h). Em S. discus esta fase foi caracterizada pela ocorrncia de 30 bivalentes, alguns dos quais exibem uma separao precoce dos cromossomos (Figura 2 i). Clulas em metfase I de S. aequifasciatus e S. haraldi apresentaram a cadeia cromossmica com disposio em zigzag, indicando uma orientao alternada dos centrmeros dos cromossomos homlogos (Figura 2 j, k). Clulas em metfase I de S. discus mostraram bivalentes tpicos alinhados na placa equatorial (Figura 2 l). Clulas em metfase II das trs espcies apresentaram n=30 cromossomos, confirmando que a segregao dos cromossomos ocorreu corretamente na anfase I precedente (Figura 2 m, n, o). Clulas diplotnicas de S. aequifasciatus e S. haraldi, submetidas tcnica de banda C, mostraram a maioria dos bivalentes com dois blocos heterocromticos conspcuos, indicando que, provavelmente, estejam localizados na regio pericentromrica, enquanto que a cadeia cromossmica apresentou um nmero varivel de marcaes heterocromticas (Figuras 4 a, b). Banda C positiva foi detectada em quase todos os bivalentes diplotnicos de S. discus machos e fmeas, sendo o padro similar ao encontrado em bivalentes de S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura 4 c). Os ncleos interfsicos de clulas gonadais masculinas e femininas das trs espcies de Symphysodon, assim como clulas da prfase I, foram impregnados com on Prata. O ncleo interfsico, nas trs espcies, apresentou um nmero varivel de nuclolos marcados com nitrato de Prata, sendo encontradas at seis marcas em S. aequifasciatus e S. haraldi, e at quatro em S. discus (Figura 4 d, e, f). Em S. aequifasciatus e S. haraldi at
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duas RONs foram observadas em diplteno e diacinese. Em S. aequifasciatus os stios estavam em bivalentes (Figura 4 g) e em S. haraldi, um estava em um bivalente e outro na cadeia cromossmica (Figura 4 h). Clulas da prfase I tardia de S. discus apresentaram um ou dois bivalentes portando a RON (Figura 4 i).

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Figura 2 Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g, j, m), S. haraldi (b, e, h, k, n) e S. discus (c, f, i, l, o) submetidas colorao convencional. (a-c) Leptteno/Zigteno. (d, e) Diplteno mostrando uma cadeia cromossmica em anel (cabea de seta) e 20 bivalentes. A maioria dos bivalentes apresenta dois quiasmas terminais (setas). (f) Diplteno com 30 bivalentes, a maioria exibindo quiasmas terminais (seta). (g, h) Diacinese mostrando uma cadeia cromossmica linear (cabea de seta) e vrios bivalentes e univalentes. (i) Diacinese mostrando a separao precoce de elementos de um bivalente (seta). (j, k) Metfase I revelando a orientao em zigzag dos cromossomos dentro da cadeia (cabea de seta). (l) Metfase I com bivalentes alinhados na placa equatorial. (m-o) Metfase II com n=30 cromossomos (barra: 10 m).

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Figura 3 Frequncia das frmulas meiticas nas clulas em diplteno e diacinese analisadas em Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi, mostrando a barra de desvio padro e nmeros variveis de bivalentes, elementos formadores da cadeia e univalentes, provavelmente devido a uma terminalizao precoce de quiasmas. II = bivalente; C XX = cadeia cromossmica com 20 elementos; C XIX = cadeia cromossmica com 19 elementos; C XVIII = cadeia cromossmica com 18 elementos; C XVII = cadeia cromossmica com 17 elementos; C XVI = cadeia cromossmica com 16 elementos; C XV = cadeia cromossmica com 15 elementos; U = univalentes.

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Figura 4 - Clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. haraldi (b, e, h) e S. discus (c, f, i) aps bandamento C (a-c) e impregnao por on Prata. (a-b) Diplteno mostrando blocos heterocromticos (cabea de seta) nos elementos cromossmicos formadores da cadeia e em quase todos os bivalentes (seta). (c) Diplteno com banda C positiva (seta) na maioria dos bivalentes. (d-f) Ncleos interfsicos, revelando cinco, seis e quatro nuclolos (cabea de seta), respectivamente. (g) Diacinese com uma RON em um grande bivalente. (h) Diacinese mostrando RONs (cabeas de seta) em um elemento da cadeia cromossmica e em um bivalente de tamanho mediano (seta). (i) Diacinese com uma RON em um bivalente de tamanho pequeno (barra: 10 m).

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Figura 5 - Representao esquemtica da possvel origem da cadeia cromossmica das clulas meiticas de Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi (n representa os outros pares cromossmicos envolvidos na meiose mltipla). (a) Translocaes simples e heterozigotas envolvendo pequenos segmentos de alguns pares cromossmicos. (b) Elementos cromossmicos derivados de translocaes. (c) Configurao meitica da cadeia cromossmica, causada por translocaes mltiplas e seriadas.
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III.1.4. Discusso Apesar da falta de consenso na nomenclatura taxonmica, atualmente aceita-se a presena de trs espcies distintas de Symphysodon, baseando-se na colorao, morfologia, caractersticas moleculares e padres de distribuio geogrfica pela bacia Amaznica (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Estudos citogenticos tem indicado que o nmero diploide igual a 60 cromossomos encontrado, invariavelmente, em S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi. Entretanto, distintas frmulas cariotpicas, nmero de RONs e localizao da heterocromatina constitutiva sugerem que os caritipos so espcie-especficos e refletem a existncia de trs espcies (Mesquita et al., 2008). Tanto Ready et al. (2006) quanto Bleher et al. (2007), analisando sequncias mitocondriais do Citocromo B e D-loop, respectivamente, sugerem que discos heckel e os discos marrons/azuis no so geneticamente distintos, provavelmente devido a eventos de introgresso, mas ambas as espcies so diferentes dos discos verdes. Em contraste, Koh et al. (1999) demonstraram que h uma clara diferenciao gentica entre todas as espcies, baseados em anlises de RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao acaso) e que S. discus a mais divergente das espcies de acars-disco. Em um trabalho mais recente Farias & Hrbek (2008), analisando molecularmente a regio controle do DNA mitocondrial e o gene nuclear RAG1, sugerem a existncia de quatro grupos de discos na regio amaznica, sendo que as coloraes fenotpicas dos animais representam unidades geogrficas, onde os discos verdes ocorreriam acima da cidade de Coari (AM), os discos azuis de Coari at o encontro das guas dos rios Negro e Solimes (prximo cidade de Manaus) e o grupo marrom nas guas do rio Amazonas (aps a juno do rio Negro com o Solimes). Adicionalmente, um quarto grupo foi evidenciado na regio do rio Xingu. A anlise do comportamento cromossmico meitico das espcies de discos corroborou os dados mitticos com relao ao nmero de espcies, assim como nmero diploide, distribuio da heterocromatina e RONs, mas revelou uma surpreendente caracterstica meitica. Em S. aequifasciatus e S.
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haraldi 20 bivalentes e uma grande cadeia cromossmica (composta de at 20 elementos) foram observados, enquanto que em S. discus 30 bivalentes tpicos foram evidenciados. No foi posssvel afirmar quais cromossomos formam a cadeia cromossmica usando apenas mtodos citogenticos clssicos. Certamente a cadeia cromossmica no composta apenas pelos microcromossomos, uma vez que apenas dois pares foram detectados nas anlises mitticas. Alm disso, um stio ribossomal esteve presente na cadeia cromossmica de S. haraldi e em cromossomos mitticos desta espcie os pares cromossmicos portadores de Ag-RONs foram 3, 5, 10, 11, 21 e 22 e, nenhum destes foi considerado microcromossomo (Figura 4 h). Figuras meiticas mltiplas envolvendo mais de quatro cromossomos so raras e a maioria dos casos est confinada a plantas e invertebrados, no tendo ainda sido descrita para peixes (para reviso ver Grtzner et al., 2006). At este estudo, a maior cadeia cromossmica detectada em vertebrados havia sido encontrada em machos de ornitorrinco (Ornithorhynchus anatinus), os quais apresentam cinco cromossomos X e cinco Y. Estes 10 cromossomos formam uma cadeia meitica multivalente complexa na meiose destes indivduos (Grtzner et al., 2004). Ao contrrio do que foi visto em ornitorrinco, a cadeia cromossmica encontrada nas espcies de acar-disco, S. aequifasciatus e S. haraldi, no formada por cromossomos sexuais, uma vez que encontrada tanto em machos quanto em fmeas. Entre os peixes, multivalentes meiticos no envolvendo cromossomos sexuais foram evidenciados em poucas espcies, os salmondeos Salvelinus namaycush e Salvelinus fontinalis (Lee & Wright, 1981; Disney & Wright-Jr, 1990), e o gobdeo Gobius fallax (Thode et al., 1988). A origem do emparelhamento mltiplo para estas espcies foi relacionada hibridizao entre as mesmas e rearranjos Robertsonianos, respectivamente. Em S. aequifasciatus e S. haraldi, a cadeia cromossmica meitica provavelmente seja resultado de mltiplas translocaes de pequenos segmentos de pares cromossmicos (Figura 5). Mecanismo similar foi proposto para explicar a configurao multivalente de clulas meiticas dos anfbios anuros

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Physalaemus petersi e Eleutherodactylus binotatus (Loureno et al., 2000; Siqueira-Jr et al., 2004). Em geral, a hibridizao e a presena de translocaes heterozigotas reduzem a adaptabilidade devido formao de gametas desbalanceados. Entretanto, alguns relatos tem mostrado translocaes, as quais podem ser conservadas em populaes que apresentam mecanismos que favorecem uma orientao alternada nos cromossomos durante a metfase I, levando segregao dos cromossomos translocados para o mesmo plo celular (Eichenlaub-Ritter & Winking, 1990; Mirol & Bidau, 1994). Como a cadeia cromossmica meitica est presente em ambos os sexos de S. aequifasciatus e S. haraldi, a translocao autossmica pode estar fixada nas populaes de Tef e Manacapuru, analisadas no presente trabalho. A orientao em zigzag da cadeia cromossmica durante a metfase I em S. aequifasciatus e S. haraldi pode ser caracterstica de um processo que tenha favorecido a formao de gametas balanceados e a fixao destes rearranjos dentro da populao. Outros animais, como ovelhas e aranhas, apresentam zonas de hibridao entre raas. Estas raas apresentam homologia monobranquial e quando se intercruzam carregam rearranjos Robertsonianos mltiplos, envolvendo cromossomos homelogos, o que resulta em cadeias multivalentes e indivduos totalmente frteis (Rowell, 1990; Narain & Fredga, 1997; Sharp & Rowell, 2007). Entretanto, o envolvimento de regies heterocromticas terminais na cadeia cromossmica de S. aequifasciatus e S. haraldi deve ser considerada. A associao heterocromtica de cromossomos no homlogos j foi verificada por John & King (1982) no gafanhoto Heteropternis obscurella (Orthoptera). Embora no tenhamos encontrado nenhuma evidncia de variao heterocromtica intraespecfica em S. aequifasciatus e S. haraldi, blocos de banda C terminais podem afetar os quiasmas terminais. Isto poderia levar variao no nmero de univalentes e bivalentes nas diferentes subfases do diplteno e diacinese, como mostrado na figura 3. Porm, como apenas 12 braos totalmente heterocromticos esto presentes nos caritipo destas espcies, a associao entre blocos de heterocromatina somente poderia
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resultar numa cadeia com 12 elementos. Esta evidncia sugere que este tipo de associao no o nico mecanismo responsvel pela formao da cadeia cromossmica, sendo necessria a existncia de mltiplas translocaes para originar a figura meitica verificada nas duas espcies. Heterocromatina, em peixes, rica em sequncias repetitivas, sendo a maioria destas, elementos transponveis (para reviso ver Martins, 2007; Ferreira & Martins, 2008). Os elementos transponveis so considerados os maiores promotores da diversidade genmica e biolgica dos vertebrados, possivelmente desempenham um papel importante na especiao e grandes mudanas evolutivas (Bohne et al., 2008). A carioevoluo de Symphysodon provavelmente no tenha ocorrido somente por poliploidia ou rearranjos cromossmicos, como previamente sugerido por Thompson (1976) e Mesquita et al. (2008), respectivamente, mas tambm pode ter sido mediada pelo acmulo de elementos transponveis em heterocromatinas terminais e translocaes envolvendo estas regies. O movimento destes elementos mveis pode ter ocorrido aps hibridao entre espcies de acars-disco sem cadeia cromossmica (por exemplo S. discus e um ancestral de S. aequifasciatus e S. haraldi) e resultou em indivduos com cadeia cromossmica meitica em machos e fmeas. Desde a dcada de 1960, acars-disco selvagens tem sido exportados para o Japo, Alemanha e Estados Unidos com o objetivo de criar novas variedades e para suprir o mercado do peixe ornamental. Programas de reproduo do tipo tentativa e erro, utilizando diferentes populaes selvagens tem produzido discos com novas caractersticas, existindo mais de 600 diferentes variantes, sendo que pelo menos 1,5 milhes de discos so criados por ms no mundo inteiro (Chan, 1991; Bleher, 2006). Alm disso, processos de seleo artificial de acars-disco tambm tem sido empregados nos ltimos 50 anos para a reproduo, sendo que a seleo de cores fortes, da forma corporal e da colorao das nadadeiras resultou em vrias formas cultivadas que no existem na natureza (Bleher & Gbel, 1992). Segundo os criadores, a maioria das cores variantes resultado de endogamia e cruzamentos entre as espcies S. aequifasciatus e S. haraldi. Os dados
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genticos revelados por marcadores RAPD para os acars-discos selvagens e cultivados corroboram estes dados (Koh et al., 1999). Symphysodon discus normalmente no usado em reprodues cruzadas e isto provavelmente ocorre porque o cruzamento entre variedades de discos que apresentam cadeia cromossmica (originados de S. aequifasciatus e S. haraldi) com as que no apresentam cadeia (descendentes de S. discus) resultem em inviabilidade dos hbridos ou prole infrtil. Do ponto de vista evolutivo, a cadeia cromossmica observada em S. aequifasciatus e S. haraldi parece ser uma caracterstica derivada, e a presena desta cadeia em ambas as espcies indica que elas provavelmente sejam espcies irms, tendo S. discus como grupo irmo deste clado ou como parental. Entretanto, a partir de anlises moleculares baseadas na sequncia parcial do D-loop e Citocromo C no foi possvel afirmar se S. discus basal dentro de Symphysodon (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). As diferenas cromossmicas meiticas entre estas espcies relacionadas sugerem que estas caractersticas podem estar relacionadas com a especiao das mesmas. As tribos Heroine, que inclui os acars-discos, e Cichlasomine so as linhagens mais recentes da radiao Neotropical e a idade estimada para o surgimento destes grupos de 12 milhes de anos, com base na anlise de sequncias do gene mitocondrial 16S. A subsequente diversificao dos heroneos estimada como ocorrida em 5,5 milhes de anos, no Mioceno tardio (Farias et al., 1998). provvel que neste tempo, um ancestral dos discos tenha sofrido um aumento no nmero diploide (de 48 para 60), que pode ter ocorrido por poliploidia (Thompson, 1976) ou por rearranjos cromossmicos (Mesquita et al., 2008). Contrariando a hiptese de Ready et al. (2006), acreditamos que Symphysodon discus (discos heckel) seria a espcie mais antiga na bacia amaznica. S. discus poderia ter hibridizado com um ancestral das outras espcies de discos, o qual j estaria extinto ou ainda no foi amostrado, e isto teria ocasionado a movimentao de elementos transponveis, causando rearranjos cromossmicos mltiplos (como as translocaes) que levaram origem da cadeia cromossmica meitica em
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indivduos de uma populao que seria ancestral de S. aequifasciatus e S. haraldi. A diversificao de S. aequifascistus e S. haraldi pode ter ocorrido a 5 ou 3 milhes de anos, quando os arcos do Caravari e Purus se formaram, respectivamente (Lundberg et al., 1998; Hoorn et al., 1995; Irion et al., 1995) (Figura 1). Os arcos (Purus ou Caravari), que atualmente encontram-se subterrneos, podem ter atuado temporariamente como uma barreira para as populaes ancestrais de indivduos portadores de cadeia cromossmica meitica, o que poderia ter levado a uma diferenciao das espcies, seguida por uma fragmentao da sua zona de distribuio. Ento, posteriormente, S. aequifasciatus e S. haraldi poderiam ter entrado em contato secundrio. A seleo pode ter favorecido indivduos que apresentavam a capacidade de segregar balanceadamente os cromossomos mltiplos, resultando em formas cariotpicas estveis. Os mecanismos que tem atuado durante a evoluo cromossmica de Symphysodon parecem ser complexos e novos estudos, incluindo mapeamento cromossmico de sequncias repetitivas, anlises do complexo sinaptonmico e amostragem de novas populaes so necessrias. Estas informaes podero contribuir para um melhor entendimento dos mecanismos cromossmicos envolvidos no processo de especiao, bem como podero ser aplicados em programas de reproduo destes animais com interesse comercial.

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III.2.Artigo 2: Anlise citogentica comparativa das espcies do gnero Symphysodon (Cichlidae): caractersticas cromossmicas de

retrotransposons e subunidade menor do DNA ribossomal

Comparative cytogenetic analysis of the genus Symphysodon (discus fishes, Cichlidae): chromosomal characteristics of retrotransposons and minor ribosomal DNA. Cytogenetic and Genome Research. Enviado em 13/07/2009. Aceito para publicao em 24/08/09. Primeira reviso efetuada em 25/08/09.

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III.2.1. Introduo A heterocromatina em peixes rica em sequncias repetitivas e estas tem merecido ateno especial em estudos relativos estrutura centromrica e telomrica (Lanfredi et al., 2001; Vicente et al., 2001), origem e evoluo de cromossomos sexuais (Devlin et al., 1998; Stein et al.; 2001; Venere et al., 2004), cromossomos supranumerrios (Mestriner et al., 2000; Jesus et al., 2003) e evoluo dos genomas (Dasilva et al., 2002). Dentre as sequncias repetitivas destacam-se os elementos transponveis e genes ribossomais. Os elementos transponveis so sequncias capazes de se integrar em novas localizaes do genoma e mobilizar sequncias no-autnomas, sendo que todos os tipos de transposons e retrotransposons conhecidos so encontrados em genomas de peixes (Volff et al., 2003; Ozouf-Costaz et al., 2004). Em contraste com o genoma dos mamferos, o genoma dos peixes telesteos contm mltiplas famlias ativas de elementos mveis, os quais tem atuado na especiao e viabilidade dos indivduos (Volff, 2005; Feschotte & Prithman, 2007). De todos os elementos retrotransponves, Rex abriga vrias famlias abundantes em telesteos, sendo que o elemento Rex3 tem a maior distribuio neste grupo, com diferentes padres de organizao no genoma de cada espcie (Tabela 1). Neste grupo, algumas cpias de Rex3 esto associadas com regies codificantes, o que poderia ser um importante fator para a evoluo (Volff et al., 1999; 2001). Outras sequncias repetitivas importantes so os DNAs codificadores de RNAs ribossomais, que podem ser divididos em duas famlias multignicas, repetidas em tandem: a primeira classe, representada pelo DNAr 45S, que compreende as regies que transcrevem os genes RNAs 28S, 18S e 5,8S, alm de espaadores intergnicos; e a segunda classe, DNAr 5S, consiste de uma sequncia altamente conservada de 120 pares de base e espaadores no transcritos (NTS) de tamanho varivel (Martins, 2007). Estudos que identificam regies repetitivas vm sendo realizados em cicldeos africanos, principalmente com diferentes espcies de tilpia (Oliveira & Wright, 1998; Martins & Wasko, 2004; Ferreira & Martins, 2008). Para os
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cicldeos neotropicais este tipo de estudo est apenas comeando (Mazzuchelli & Martins, 2009), frente grande riqueza de espcies desta famlia. Os acars-disco constituem um excelente modelo para a realizao de estudos evolutivos. Endmicas da bacia amaznica, as trs espcies atualmente reconhecidas do gnero Symphysodon (S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, Cichlidae, Perciformes) apresentam alto nvel de variabilidade gentica associada a diferentes tipos de bitopos. H muito tempo, essas espcies so tema de estudos taxonmicos e filogenticos, tanto em nvel morfolgico quanto molecular, principalmente por tratarem-se de espcies amplamente exploradas como peixes ornamentais (Kullander, 1996; Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007; Amado et al., 2008; Farias & Hrbek, 2008; Silva et al., 2008). Anlises citogenticas clssicas revelaram que as trs espcies de Symphysodon apresentam o maior nmero diploide encontrado na famlia (2n=60), com a maioria dos cromossomos do tipo meta-submetacntricos, ausncia de cromossomos sexuais diferenciados e presena de grandes blocos de heterocromatina constitutiva (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008). Todas estas caractersticas so consideradas derivadas para a famlia Cichlidae (Feldberg et al., 2003). Alm disso, S. aequifasciatus e S. haraldi apresentam a maior cadeia cromossmica meitica descrita para vertebrados, a qual compreende at 20 elementos, em machos e fmeas, cuja origem pode estar baseada em uma srie de translocaes que envolveram regies heterocromticas (Gross et al., 2009). Visando um melhor entendimento da organizao cromossmica e carioevoluo, o presente estudo apresenta o mapeamento fsico cromossmico das sequncias repetitivas do retrotransoposon Rex3 e do DNAr 5S nas trs espcies selvagens do gnero Symphysodon.

III. 2.2. Material e mtodos Os indivduos de acars-disco foram coletados no estado do Amazonas, Brasil, sob licena do IBAMA (011/2005) e identificados de acordo com as caractersticas propostas mais recentemente para o gnero (Bleher et al.,
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2007). Foram coletados oito machos e trs fmeas de disco verde (S. aequifasciatus) provenientes do rio Tef; 15 machos e trs fmeas de disco heckel (S. discus) do rio Negro (proximidades de Novo Airo) e 15 machos e trs fmeas de disco azul/marrom (S. haraldi) do rio Manacapuru. Espcimes testemunhos foram depositados na coleo de peixes do INPA (INPA 28582, INPA 28583, INPA 28584) e outros indivduos esto depositados na coleo de peixes do Laboratrio de Gentica Animal do INPA. Cromossomos mitticos e meiticos foram obtidos de clulas renais e gonadais de machos e fmeas de S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, seguindo os protocolos descritos por Moreira-Filho & Bertollo (1990) e Gross et al. (2009), respectivamente. O composto farmacutico Munolan (Allergan Frumtost) foi usado para estimular a diviso celular mittica (Molina, 2001). A heterocromatina foi detectada utilizando o protocolo descrito por Sumner (1972). O DNA genmico total foi extrado do msculo de Symphsysodon aequifasciatus (disco verde), Symphysodon discus (disco heckel) e Symphysodon haraldi (discos azul/marrom) seguindo o protocolo de fenol-clorofrmio detalhado em Sambrook & Russell (2001). Para a amplificao por PCR (Polymerase Chain Reaction) do retrotransposon Rex3 foram utilizados os primers RTX3-F3 (5-CGG TGA YAA AGG GCA GCC CTG) e RTX3-R3 (5-TGG CAG ACN GGG GTG GTG GT) (Volff et al. 1999, 2001). Para obter unidades repetitivas do DNAr 5S por PCR foi utilizado o conjunto de primers 5Sa (5-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC) e 5Sb (5-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC) (Komiya & Takemura, 1979). As reaes de PCR foram feitas para volume final de 25 L (1 L de DNA genmico -100 ng); 2,5 L de Tampo 10X com cloreto de magnsio 1,5 mM; 0,25 L de Taq DNA polimerase (5 U/L); 1,5 L de dNTP (1 mM); 1,5 L de cada primer (5 mM); gua milli-Q para completar o volume). Os ciclos de amplificao seguiram as seguintes etapas: a) Rex3: 2 minutos a 95 C (desnaturao); 35 ciclos de um minuto a 95 C, 40 segundos a 55 C (anelamento), 2 minutos a 72 C (extenso); 5 minutos a 72 C (extenso final). b) DNAr 5S: 5 minutos a 94 C (desnaturao); 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 61 C e 45 segundos a 72 C; 2 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30
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segundos a 59 C e 45 segundos a 72 C; 2 ciclos de 1 minuto a 95 C , 30 segundos a 57 C e 45 segundos a 72 C; 25 ciclos de 1 minuto a 95 C, 30 segundos a 61 C e 45 segundos a 72 C (extenso); 7 minutos a 72 C (extenso final). Os produtos da PCR foram clonados no plasmdeo pGEM-T e clulas competentes de Escherichia coli DH5 foram utilizadas para a transformao. Dezesseis clones de Rex3 e oito de DNAr 5S foram sequenciados no sequenciador automtico MegaBace 1000 seguindo as instrues do fabricante. Para as reaes de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (GE HealthCare). As sequncias geradas foram comparadas com sequncias depositadas nos bancos de dados disponveis na Internet atravs do NCBI (National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Depois de conferidas, todas as sequncias foram alinhadas utilizando-se o programa de alinhamento mltiplo Clustal W (Thompson et al., 1994), que est incluso no BioEdit 7.0 (Hall 1999). O alinhamento gerado foi manualmente conferido e editado no mesmo programa. As sondas de Rex3 e do DNAr 5S, obtidas por PCR, foram marcadas com biotina 14-dATP por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) e as hibridizaes fluorescentes in situ homlogas e heterlogas foram realizadas de acordo com o protocolo descrito por Pinkel et al. (1986) e Martins & Galetti Jr. (2001), com modificaes. O DNA cromossmico mittico foi desnaturado por 10 segundos em formamida 70% em 2xSSC a 67 C e o meitico por 15 segundos. A soluo de hibridizao (100 ng de sonda desnaturada, 10 mg/mL de sulfato de dextrano, 2xSSC e formamida 50% em um volume final de 30 l) foi colocada sobre a lmina e a hibridizao ocorreu a 37 C, overnight (cerca de 12 horas), em cmara mida (2xSSC). A lavagem ps-hibridizao ocorreu a 72 C em 2xSSC, pH 7,0 por 5 minutos. Em seguida as lminas foram imersas em tampo PBD (20 mL de 20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em p desnatado; gua destilada, volume final 100 mL, pH 7,0). A deteco das sondas foi feita por meio de FITC-Avidina conjugada (Sigma) em tampo C (0,1M bicarbonato de sdio, 0,15M de cloreto de sdio) por 30 minutos. As lminas foram lavadas 3 vezes em tampo PBD a 45 C, por 2 minutos cada. Em seguida, duas sries de
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amplificao de sinal foram efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em tampo PBD (2 l de antiavidina em 38 l de PBD), sendo as lminas incubadas por 5 minutos em cmara mida a 37 oC. Cada tratamento com antiavidinabiotina conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em Tampo C, com incubao por 8 minutos em cmara mida a 37 C. Depois de cada passo de amplificao, as lminas foram lavadas trs vezes em tampo PBD a 45 oC por 2 minutos. Os cromossomos foram contracorados com iodeto de propdeo 0,2% diludo em antifade (Vector). Adicionalmente, as sondas de Rex3 foram marcadas por nick translation usando digoxigenina (Roche) e usadas em hibridizaes duplas com o DNAr 5S, sendo os cromossomos contra-corados com DAPI. Cromossomos hibridizadors foram analisados usando microscpio Olympus BX61 e as imagens foram capturadas com cmera digital Olympus DP71, com o programa Image-Pro MC 6.0. As metfases mitticas foram processadas no programa Adobe Photoshop CS3, sendo os cromossomos medidos no programa livre Image J. A montagem dos caritipos foi feita de acordo com Thompson (1979) e Mesquita et al. (2008).

III.2.3. Resultados A amplificao com os primers para Rex3 resultou em um fragmento de aproximadamente 460 pb que foi clonado e sequenciado para as trs espcies de Symphysodon (Figura 1a). As sequncias foram comparadas com outras disponveis nos bancos de dados do NCBI e apresentaram alta similaridade com elementos Rex3 identificados em outras espcies de peixes, incluindo algumas espcies de cicldeos como Cichlasoma labridens (95%) e Oreochromis niloticus (87%), e com peixes considerados modelos genticos como Danio rerio (78%). J a amplificao com os primers para DNAr 5S resultou em um fragmento de 700 pb, incluindo NTS, para as trs espcies de Symphysodon (Figura 1b), as quais apresentaram 100% de similaridade a segmentos correspontes regio codificante do RNAr 5S de Leporinus spp.

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A anlise cariotpica das trs espcies de Symphysodon revelou a presena de 2n=60 cromossomos, ausncia de cromossomos sexuais diferenciados e de polimorfismo cromossmico populacional, sendo que S. aequifasciatus apresentou frmula cariotpica igual a 50m-sm+6st-a+4mi, S. discus 50m-sm+10st-a e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi (Figura 2). A heterocromatina foi evidenciada na regio pericentromrica da maioria dos cromossomos mitticos das trs espcies (Figura 2). Porm, em alguns pares, a heterocromatina constitutiva ocupou braos cromossmicos inteiros, tais como, brao curto dos cromossomos dos pares 5, 6, 7, 9, 10, 12, 14, 16, 17, 18 em S. aequifasciatus (Figura 2a); 4, 8, 9, 10, 12 a 15, 18, 20, 22 e 23 de S. discus (Figura 2b); 11, 15 a 20 de S. haraldi (Figura 2c). Ainda, em S. aequifasciatus foi evidenciada, em um dos homlogos do primeiro par cromossmico, uma marcao heterocromtica instersticial no brao longo (Figura 2a) e em S. haraldi os pares 23 e 29 so totalmente heterocromticos (Figura 2c).

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Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe (1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers Rex3 (a) e DNAr 5S (b) para as trs espcies de Symphysodon (1 S. aequifasciatus; 2 S. discus; 3 S. haraldi).

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Figura 2 Caritipos de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b) e S. haraldi (c) submetidos a bandeamento C (barra de escala: 10 m).

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As hibridizaes homlogas (sondas de DNA da mesma espcie) e heterlogas (sonda de uma espcie hibridizada em cromossomo de outra) apresentaram resultados similares, tanto para Rex3 quanto para 5S. Com relao localizao do elemento Rex3, as trs espcies apresentaram um padro de distribuio compartimentalizado em alguns cromossomos, com sinais de hibridizao fracos na regio centromrica da maioria dos cromossomos (Figura 3), tanto em machos como em fmeas, mas que so bem visveis nas metfases espermatogoniais (Figura 3d). Na anlise dos cromossomos mitticos estas marcaes mais conspcuas foram evidenciadas em regies pericentromricas sendo que S. e invadindo braos curtos dos 12 pares marcas cromossmicos, apresentou

aequifasciatus

moderadamente acentuadas (regio pericentromrica invadindo os braos curtos dos cromossomos dos pares 7, 9, 10, 13, 15 e 16) (Figura 3a), 18 sinais bem evidentes em S. discus (regio pericentromrica dos pares 19, 21 e 25, e invadindo braos curtos dos pares 14, 18, 20, 23, 26 e 27) (Figura 3b) e 24 stios tnues em S. haraldi (regio centromrica dos cromossomos 5, 8, 14, 16, 17 e invadindo braos curtos dos cromossomos 6, 9, 10, 18, 19, 22, 29) (Figura 3c). Em clulas diplotnicas e em diacinese das trs espcies, a maioria dos bivalentes apresentou duas marcaes conspcuas, as quais provavelmente esto localizadas em regies pericentromricas (Figura 3f). Entretanto, em S. aequifasciatus (Figura 3e) e S. haraldi (Figura 3g), um nmero varivel de stios fluorescentes foram evidenciados na cadeia cromossmica.

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Figura 3 Localizao fsica cromossmica do retrotransposon Rex3 (stios amarelos) nos caritipos e clulas meiticas testiculares de Symphysodon aequifasciatus (a, d, e), S. discus (b, f) e S. haraldi (c, g). a-c) Caritipos. d) Metfase espermatogonial revelando marcaes pericentromricas de Rex3 em todos os cromossomos (seta); e-g) Diplteno revelando sequncias de Rex3 na cadeia cromossmica (seta) e em bivalentes (cabea de seta) (barra 10 m).

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Com relao localizao fsica cromossmica do DNAr 5S, apenas um par de cromossomos marcados foi evidenciado nas trs espcies. Nos cromossomos mitticos o DNAr 5S foi identificado na regio sub-terminal dos braos curtos dos cromossomos do par 10 em S. aequifasciatus (Figura 4a), enquanto que em S. discus (Figura 4b) e S. haraldi (Figura 4c) este stio foi evidenciado na regio sub-terminal do brao curto dos cromossomos do par 18. Nos cromossomos meiticos das trs espcies os stios de DNAr 5S foram localizados em bivalentes tpicos e no esto envolvidos com a cadeia cromossmica (Figura 4d, e, f). A FISH dupla revelou que os elementos Rex3 esto flanqueando os genes RNAr 5S nas trs espcies (Figura 4g).

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Figura 4 Localizao fsica cromossmica do DNAr 5S (stios amarelos) nos caritipos e clulas testiculares meiticas de Symphysodon aequifasciatus (a, d, g), S. discus (b, e) e S. haraldi (c, f). a-c) Caritipos. d-f) Diplteno revelando stios de DNAr 5S em bivalentes (seta). g) Metfase de Symphysodon aequifasciatus mostrando as sequncias de Rex3 (stios rseos) flanqueando os genes RNAr 5S (stios verdes). O mesmo padro foi encontrado em S. discus e S. haraldi (barra: 10 m).

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III.2.4. Discusso Os elementos Rex3 podem ter desempenhado um papel importante durante a evoluo dos cicldeos neotropicais, incluindo as espcies de Symphysodon. De acordo com rvores filogenticas (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; Smith et al., 2008), Astronotus ocellatus uma das espcies consideradas basais para os cicldeos neotropicais e esta apresenta pequenos blocos de heterocromatina constitutiva restritos s regies pericentromricas de todos os cromossomos, sendo que os elementos repetitivos AoRex3 (retroelemento da famlia Rex3 isolado com enzimas de restrio de Astronotus ocellatus) esto, preferencialmente, localizados nestas regies (Mazzuchelli & Martins, 2009). Symphysodon um gnero considerado derivado dentre os cicldeos e as suas espcies apresentam grande quantidade de heterocromatina constitutiva nas regies pericentromricas de quase todos os cromossomos, sendo que em alguns pares os blocos heterocromticos invadem a regio proximal dos braos curtos e longos (Takai et al., 2002; Mesquita et al. 2008; presente trabalho). Todas as hibridizaes in situ usando sondas especficas de Rex3 resultaram em sinais fluorescentes co-localizados com heterocromatina (Figura 5a, b, c), entretanto S. haraldi apresentou sinais tnues quando comparado com as outras espcies do gnero. Anlises da distribuio do Rex3 em cromossomos meiticos nas espcies de Symphysodon corroboram os dados mitticos com relao localizao preferencial destas sequncias na heterocromatina, porm os sinais so mais evidentes em clulas testiculares. Banda C em clulas diplotnicas de S. aequifasciatus e S. haraldi indicaram que a maioria dos bivalentes apresenta dois blocos heterocromticos, os quais provavelmente esto localizados em regies pericentromricas, e um nmero varivel de blocos heterocromticos na figura meitica multivalente (Gross et al., 2009). Um padro similar foi encontrado na FISH utilizando as sondas de Rex3, o que sugere o envolvimento destas sequncias nos rearranjos cromossmicos que originaram esta figura meitica. Interessantemente, estudos envolvendo localizao fsica cromossmica dos elementos retrotransponveis Rex3 tem revelado diferentes padres de distribuio para as espcies das ordens Perciformes e
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Tetraodontiformes (Tabela 1), sendo que a maioria delas tem apresentado o Rex3 disperso uniformemente pelo genoma e no relacionado heterocromatina. Integrao preferencial em regio heterocromtica foi observada em Notothenia coriiceps, que apresenta o caritipo mais derivado dentre os Perciformes marinhos j analisados, cuja distribuio mais compartimentalizada, com acmulo nas regies pericentromricas, sugerindo uma correlao entre rearranjos cariotpicos e atividade deste retrotransposon (Ozouf-Costaz et al., 2004). Entretanto, em Symphysodon muitas regies heterocromticas no apresentaram sinais de hibridizao da sonda Rex3, como a marcao instersticial heterocromtica presente em apenas um dos homlogos do primeiro par de S. aequifasciatus, os cromossomos heterocromticos (par 23) de S. haraldi e muitos braos curtos das trs espcies, mostrando que as espcies de Symphysodon permanecem com muitas sequncias heterocromticas no conhecidas. A heterocromatina atualmente reconhecida como uma parte importante do genoma dos eucariotos, cujas funes incluem segregao cromossmica, organizao nuclear e regulao da expresso gnica, e tambm pode afetar o processo de recombinao gnica (Grewal & Jia, 2007; Skipper, 2007; Bhler, 2009). Entretanto, evidncias mostram que esta regio pode ter funes adicionais, incluindo a regulao da mitose, progresso do ciclo celular e proliferao das clulas, assim como pode estar associada com respostas a muitas formas de estresses exgenos, como trocas de temperatura, choques trmicos e hipxia (Burt & Trivers, 2006; Varriale et al., 2008). Desta forma, as diferenas encontradas no padro heterocromtico e na quantidade/intensidade de sinais de Rex3 nos caritipos das espcies selvagens de Symphysodon podem estar correlacionadas e/ou refletindo uma adaptao ao ambiente em que vivem? Esta uma questo que merece uma ateno especial, uma vez que os rios amaznicos apresentam grande heterogeneidade quanto aos padres fsico-qumicos desde a origem da bacia amaznica, sendo isto reconhecido facilmente pelas diferentes coloraes de gua (Tabela 2). Os rios amaznicos so classificados em rios de guas
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brancas, com colorao barrenta, que possuem grande quantidade de sedimentos em suspenso; rios de guas claras com pouco material em suspenso; e rios de guas pretas, colorao esta originada da decomposio parcial de material orgnico proveniente da floresta (Sioli, 1990; Santos & Ferreira, 1999). Estas caractersticas geolgicas e os parmetros fsicoqumicos das guas afetam diretamente a distribuio dos acars-disco na bacia amaznica (Bleher, 2006, Ready et al., 2007, Bleher et al., 2007, Farias & Hrbek, 2008). Os discos marrom/azul (S. haraldi) apresentam maior distribuio na bacia amaznica, sendo encontrados em tributrios ao longo do eixo Amazonas-Solimes (Bleher, 2006, Bleher et al., 2007). Os discos verdes e heckel apresentam distribuio mais restrita, sendo os verdes encontrados na poro mais a oeste da bacia amaznica (regio de Tef, Juru e Juta) e os heckel nos rios Negro, Abacaxis e Nhamund (Ready et al., 2006; Bleher et al., 2007). Como cada uma das espcies de disco est relacionada a um ambiente amaznico e diferentes nmeros de sinais conspcuos de Rex3 so encontrados nas espcies de Symphysodon, acreditamos que processos fisiolgicos (incluindo a expresso de genes) podem estar envolvidos com a distribuio dos elementos mveis, uma vez que os transposons e retrotransposons podem controlar genes epigeneticamente, quando inseridos nos genes ou prximos a eles, causando silenciamento gnico pela induo da metilao do DNA (Volff, 2005). Talvez este seja um dos motivos da existncia de diferentes padres de heterocromatina constitutiva e nveis de intensidade de sinais de Rex3, os quais so encontrados atualmente nas trs espcies de Symphysodon.

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Tabela 1 Padro de disperso cromossmica dos elementos Rex3 em diferentes espcies de peixes. Espcie (Ordem) Artedidraco shackletoni (Perciformes) Astronotus ocellatus (Perciformes) Bovichtus angustifrons (Perciformes) Chionodraco hamatus (Perciformes) Dissostichus mawsoni (Perciformes) Gymnodraco acuticeps (Perciformes) Gymnodraco victori (Perciformes) Neopagetopsis ionah (Perciformes) Notothenia coriiceps (Perciformes) Patagonotothen tesselata (Perciformes) Symphysodon discus (Perciformes) Symphysodon haraldi (Perciformes) Tetraodon nigroviridis (Tetraodontiformes) Trematomus hansoni (Perciformes) Trematomus newnesi (Perciformes) Trematomus bernacchii (Perciformes)
*

Padro de disperso Uniforme Uniforme Uniforme Uniforme Uniforme Uniforme Uniforme

Referncia Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al. 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004

Compartimentalizado Mazzuchelli & Martins, 2009 Compartimentalizado Ozouf-Costaz et al., 2004

Compartimentalizado Ozouf-Costaz et al., 2004

Symphysodon aequifascistus (Perciformes) Compartimentalizado Presente trabalho Compartimentalizado Presente trabalho Compartimentalizado Presente trabalho Compartimentalizado Fisher et al., 2004 Uniforme Uniforme Uniforme Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004 Ozouf-Costaz et al., 2004

Trematomus pennellii (Perciformes) Uniforme * sonda utilizada para hibridizao foi AoRex3

Tabela 2: Parmetros fsico-qumicos medidos nos hbitats dos acars-disco, a 1,5m de profundidade (Bleher, 2006). Disco heckel Disco verde Colorao da gua Temperatura mdia da gua pH mdio Condutividade eltrica mdia Preta 28,6 4,78 9,2 S/cm Preta 28,2 5,42 10,5 S/cm Disco marrom/azul Clara ou misturada 28,8 6,14 31,4 S/cm

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Figura 5 Idiograma comparativo de Symphysodon aequifasciatus (a), S. discus (b), S. haraldi (c); em preto a heterocromatina centromrica/pericentromrica com tnues marcaes fluorescentes de Rex3, claramente visualizada na maioria dos cromossomos; em amarelo, marcaes conspcuas mais acentuadas de Rex 3; em vermelho, os genes RNAr 5S co-localizados com heterocromatina e com marcaes adjacentes de Rex 3 (amarelo); em rosa, sequncias desconhecidas de heterocromatina.
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A presena de elementos transponveis tambm pode estar atuando na variabilidade gentica, verificada tanto em nvel molecular (Ready et al., 2006, Bleher et al., 2007, Farias & Hrbek, 2008) quanto citogentico (Mesquita et al., 2008), assim como na variabilidade fenotpica visualizada tanto em ambiente natural quanto em indivduos reproduzidos em cativeiro (Bleher & Gbel, 1992). Alm disso, a presena de grandes sinais de elementos repetitivos tambm explica o aumento do genoma dos Symphysodon quando comparado a outros cicldeos neotropicais, aumento este que havia sido explicado por Thompson (1976) como sendo resultado de uma poliploidizao. Outro fato que refora a evidncia da participao de Rex3 na carioevoluo dos acars-disco a sua presena na cadeia cromossmica meitica de S. aequifasciatus e de S. haraldi. Isto corrobora a hiptese de Gross et al. (2009), que sugere o envolvimento de elementos transponveis na origem da cadeia cromossmica. Com relao localizao fsica cromossmica do gene de RNAr 5S, o mapeamento destas sequncias em diversas espcies de peixes tem evidenciado esses stios comumente localizados nos segmentos intersticiais dos cromossomos (revisado por Martins & Wasko, 2004; Ferreira et al., 2007; Nakayama et al., 2008) e esse mesmo padro tambm foi observado para mamferos (Frederiksen et al., 1997) e anfbios (Schmid et al., 1987; Lucchini et al., 1993). Tal padro de localizao cromossmica parece corresponder a uma condio ancestral, especialmente para peixes, sendo que esta posio resultaria em uma proteo destas sequncias contra transposies e eventos de permuta (Martins & Galetti Jr., 1999). Translocaes e permutas envolvendo regies terminais so mais comuns em espcies que apresentam a configurao Rabl durante a diviso celular, quando os cromossomos permanecem prximos uns dos outros no ncleo durante a intrfase, com os centrmeros direcionados para um plo e os telmeros para o outro (Schweizer & Loidl, 1987; Sumner, 2003). Este o caso das trs espcies de Symphysodon. Embora eles tenham somente um par cromossmico marcado com a sonda DNAr 5S na regio terminal do brao curto, os pares marcados no so os mesmos. Stios de DNAr 5S em S. aequifasciatus so encontrados nos cromossomos do par 10, enquanto em S. discus e S. haraldi esto
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localizados nos cromossomos do par 18, onde o gene RNAr 5S colocalizado com heterocromatina e flanqueado por elementos Rex3 nas trs espcies (Figura 5 a, b, c). Como elementos transponveis podem servir como substrato para recombinao de DNA devido sua natureza repetitiva, especialmente durante a configurao Rabl (Kidwell & Lisch, 1997; Kazazian & Moran, 1998; Rouzic & Capy, 2005), isto pode ter facilitado os rearranjos cromossmicos que causaram diferenas na posio do DNAr 5S entre S. aequifasciatus e S. discus/S. haraldi. Em plantas, a associao de locus de DNAr com regies de heterocromatina tem sido extensivamente documentada (Siljak et al., 2002) e os elementos transponveis detectados na heterocromatina centromrica e nas regies organizadoras nucleolares parecem afetar a mobilidade, evoluo e expresso dos genes ribossomais, como sugerido para arroz e tabaco (Dong et al., 1998; Franz et al., 2000). Apesar da evidncia de translocaes envolvendo os cromossomos portadores dos stios DNAr 5S, os dados obtidos com estas sondas de DNAr sugerem que os cromossomos dos pares 10 e 18 no esto envolvidos na formao da figura meitica multivalente de S. aequifasciatus e S. haraldi, respectivamente. Porm, existe uma possvel correlao entre aumento da heterocromatina, rearranjos cariotpicos e atividade dos retrotransposons Rex3, onde o acmulo e atividade dos elementos mveis estariam facilitando as translocaes mltiplas e seriadas que originaram esta cadeia cromossmica meitica. Embora os elementos repetitivos de DNA tenham sido considerados, por muitas dcadas, DNA lixo por no se saber ao certo a sua funo (Doolittle & Sapienza, 1980; Orgel & Crick, 1980), ao longo dos ltimos anos esta opinio mudou devido aos dados acumulados sobre origem e divergncia taxonmica dos eucariotos (Bonaccorsi & Lohe, 1991; Dong et al., 1998; Feschotte & Prithman, 2007). Dados recentes tem apoiado um papel importante do DNA repetitivo na evoluo estrutural e funcional de genes e genomas em uma variedade de organismos (Bimont & Vieira, 2006). Embora mecanismos evolutivos tenham impedido grandes mudanas cariotpicas nas diferentes espcies e populaes de Symphysodon, seus genomas esto em evoluo
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contnua, demonstrado aqui pelas variaes cromossmicas observadas. A frao repetitiva do genoma (exemplificada pelo DNAr 5S e Rex 3) pode escapar da presso assim seletiva bons que atua no para segmento detectar no-repetitivo, acontecimentos representando marcadores

evolutivos. Alm disso, o acmulo de sequncias repetitivas em reas especficas no genoma pode causar rearranjos cromossmicos por meio de quebra, delees, inverses e duplicaes (Lim & Simmons, 1994; Dimitri et al., 1997). Considerando o acmulo de heterocromatina e sequncias de DNA repetitivo em Symphysodon quando comparado com outros cicldeos, o gnero representa um interessante modelo para investigar o papel do DNA repetitivo na evoluo cromossmica. Desta forma, a anlise de outras famlias de DNA repetitivo e o nmero de cpias destas sequncias no genoma dos acarsdisco, e tambm de outras espcies amaznicas, ir contribuir grandemente para a compreenso dos mecanismos evolutivos envolvidos na gerao da complexa estrutura genmica destes organismos, alm de melhor elucidar a hiptese da correlao entre acmulo diferencial de elementos repetitivos e adaptao dos peixes aos diferentes ambientes aquticos amaznicos.

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III.3.Captulo 3: Variabilidade intra e interespecfica do locus do DNAr 18S entre acars-disco Symphysodon: rearranjos cromossmicos

Variability inter and intraspecific of 18S rDNA locus among Symphysodon fishes: chromosomal rearrangements. Journal of Fish Biology. Enviado 09/06/2009. Aceito para publicao em 10/08/2009. Primeira reviso efetuada em 20/08/2009.

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III.3.1. Introduo O RNA ribossomal (rRNA) o mais abundante na clula e constitui aproximadamente 80% do RNA total de clulas em diviso. As molculas de RNA so componentes estruturais dos ribossomos e esto envolvidas em atividades catalticas, organizacionais e de regulao de sntese protica em todas as clulas (Doudna & Rath, 2002). Estes genes so divididos em duas famlias multignicas repetidas em tandem, as quais esto situadas em arranjos independentes e, em peixes, normalmente localizam-se em ambientes cromossmicos distintos (Galetti Jr. & Martins, 2004; Martins, 2007). A primeira classe formada pelo DNAr 5S, que codifica o RNAr 5S, sintetizado pela RNA Polimerase III (Doudna & Rath, 2002; Hernandez-Verdun et al., 2002). A segunda classe representada pelo DNAr 45S, que codifica os RNAs ribossomais 18S, 5.8S e 28S, sintetizados pela RNA Polimerase I, e um espaador intergnico no transcrito (IGS) (Doudna & Rath, 2002; HernandezVerdun et al., 2002; Boisvert et al., 2007). Mltiplas cpias desta segunda classe (DNAr 45S) correspondem s regies organizadoras de nuclolo (RONs), as quais so positivas para impregnao com on Prata, quando ativas (Howell & Black, 1980; Boisvert et al., 2007). Os cicldeos tem despertado interesse cientfico devido sua rpida radiao adaptativa, a qual tem levado a uma extensa diversidade ecolgica, e tambm graas sua grande importncia na aquicultura tropical e subtropical (Kornfield et al., 1979; 1984; Stiassny, 1991; Feldberg et al., 2003; Kullander, 2003; Martins et al., 2004; Smith et al., 2008, entre outros). Apesar da diversidade ecolgica e morfolgica dos cicldeos, a maior parte das informaes genticas/genmicas baseia-se em informaes cariotpicas, sendo evidente uma distribuio bimodal de nmeros diploides relacionados distribuio geogrfica das espcies, onde espcies africanas apresentam 2n=44 cromossomos, enquanto que nmero diploide modal igual a 48 encontrado nas espces neotropicais (Feldberg et al., 2003). Com relao aos cicldeos neotropicais, os acars-disco, gnero Symphysodon, so o grupo mais intrigante e distinto devido sua morfologia, padres de colorao (Ready
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et al. 2006) e caractersticas cromossmicas (Thompson, 1979; Feldberg et al., 2003; Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009), sendo considerado o gnero mais derivado dentre os cicldeos (Kullander, 1998; Farias et al., 2001; Smith et al., 2008). Dados acumulados nas ltimas dcadas indicam que as espcies de Symphysodon apresentam o maior nmero diploide (2n=60 cromossomos) de todos os cicldeos (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et al., 2002), sugerindo a ocorrncia de rearranjos cromossmicos durante sua histria evolutiva (Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009). Em vrias espcies da famlia Cichlidae, sistemas simples de regies organizadoras de nuclolo e marcaes presentes nos maiores cromossomos do complemento so consideradas caractersticas plesiomrficas (Feldberg et al., 2003). Para o peixe ornamental acar-disco impregnaes do on Prata em cromossomos mitticos das espcies S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi tem mostrado uma grande variabilidade no nmero de marcaes de regies organizadoras de nuclolo, tanto intra quanto interespecificamente (Mesquita et al., 2008). Alm disso, estudos dos cromossomos meiticos de S. haraldi tem evidenciado stios ribossomais na cadeia cromossmica meitica diplotnica, sugerindo o envolvimento destas sequncias em rearranjos cromossmicos que originaram esta figura meitica (Gross et al., 2009). Considerando a variabilidade da Ag-RON nas trs espcies do gnero Symphysodon, o objetivo deste trabalho foi investigar a distribuio das sequncias de DNA ribossomal 18S, verificando se estas coincidem com as marcaes da Ag-RON nos cromossomos mitticos das trs espcies. III.3.2. Material e mtodos III.3.2.2.1. Amostragem e obteno de sondas de DNAr 18S Os indivduos foram coletados no estado do Amazonas, Brasil, sob licena do IBAMA (011/2005) e identificados de acordo com as caractersticas propostas mais recentemente para o gnero (Bleher et al., 2007). Foram analisados oito machos e oito fmeas de disco verde (S. aequifasciatus) provenientes do rio Tef; 15 machos e 14 fmeas de disco heckel (S. discus) do rio Negro (proximidades de Novo Airo) e 15 machos e 15 fmeas de disco azul/marrom (S. haraldi) do rio Manacapuru. Espcimes testemunho foram
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depositados na coleo de peixes do INPA (INPA 28582, INPA 28583, INPA 28584) e outros indivduos esto depositados na coleo de peixes do Laboratrio de Gentica Animal do INPA. O DNA genmico total foi extrado do msculo de Symphysodon aequifasciatus (disco verde), Symphysodon discus (disco heckel) e Symphysodon haraldi (discos azul/marrom) seguindo o protocolo de fenol-clorofrmio detalhado em Sambrook & Russell (2001). Para a amplificao por PCR (Polymerase Chain Reaction) do gene rRNA 18S foram utilizados os primers 18Sf (5CCG CTT TGG TGA CTC TTG AT) e 18Sr (5CCG AGG ACC TCA CTA AAC CA) desenhados a partir da sequncia completa do gene RNAr 18S de Ictalurus punctatus disponvel nos bancos de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (cdigo identificador da sequncia AF021880). As reaes de PCR foram feitas para volume final de 25 L (1 L de DNA genmico -100 ng); 2,5 L de Tampo 10X com cloreto de magnsio 1,5 mM; 0,25 L de Taq DNA polimerase (5 U/L); 1,5 L de dNTP (1 mM); 1,5 L de cada primer (5 mM); gua milli-Q para completar o volume. Os ciclos de amplificao seguiram as seguintes etapas: 2 minutos a 95 oC; 35 ciclos de um minuto a 95 oC (desnaturao), 30 segundos a 55 oC (anelamento), 1 minuto e 40 segundos a 72 oC (extenso); 7 minutos a 72 oC (extenso final).

III.3.2.2.2. Sequenciamento Os produtos da PCR foram sequenciados no sequenciador automtico MegaBace 1000 seguindo as instrues do fabricante. Para as reaes de sequenciamento foi utilizado o kit DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing (GE HealthCare). As sequncias geradas foram comparadas com sequncias depositadas nos bancos de dados do NCBI. Depois de conferidas, todas as sequncias foram alinhadas, utilizando o programa de alinhamento mltiplo Clustal W (Thompson et al. 1994), que est incluso no BioEdit 7.0 (Hall 1999). O alinhamento gerado foi conferido manualmente e editado no mesmo programa.

III.3.2.2.3. Obteno de cromossomos e deteco da regio organizadora de nuclolo

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Cromossomos mitticos foram obtidos a partir de clulas renais de S. aequifasciatus, S. discus e S. haraldi, seguindo protocolos descritos por Moreira-Filho & Bertollo (1990). Para estimular a diviso celular mittica foi utilizado o composto farmacutico Munolan (Allergan Frumtost), conforme tcnica descrita por Molina (2001). As preparaes cromossmicas foram coradas com soluo de Giemsa 5% por 10 minutos. As regies organizadoras de nuclolo foram detectadas pela tcnica de Howell & Black (1980).

III.3.2.2.4. Hibridizao fluorescente in situ em cromossomos mitticos Os produtos da PCR foram marcados por biotina 14-dATP por nick translation (Bionick labeling system-Invitrogen) e as hibridizaes fluorescente in situ homlogas e heterlogas foram realizadas de acordo com o protocolo descrito por Pinkel et al. (1986) e Martins & Galetti Jr. (2001), com modificaes. O DNA cromossmico mittico foi desnaturado por 10 segundos em formamida 70% em 2xSSC (17,53 g de cloreto de sdio 0,29M, 8,82 g de citrato de sdio, gua destilada para volume final de 1000 mL, pH 7,0) a 67 oC. A soluo de hibridizao (100 ng de sonda desnaturada, 10 mg/mL de sulfato de dextrano, 2xSSC e formamida 50% em um volume final de 30 l) foi colocada sobre a lmina e a hibridizao ocorreu a 37 oC, overnight (12 horas), em cmara mida (2xSSC). A lavagem ps-hibridizao ocorreu a 72 oC em 2xSSC, pH 7,0 por 5 minutos. Em seguida as lminas foram imersas em tampo PBD (20 mL de 20xSSC; 1mL Triton 100, 1g de leite em p desnatado; gua destilada, volume final 100 mL, pH 7,0). A deteco das sondas foi feita por meio de FITC-Avidina conjugada (Sigma) em tampo C (Coupling Buffer: 0,1M bicarbonato de sdio, 0,15M de cloreto de sdio) por 30 minutos. As lminas foram lavadas trs vezes em tampo PBD a 45 oC , por 2 minutos cada. Em seguida, duas sries de amplificao de sinal foram efetuadas usando antiavidina-biotina conjugada em tampo PBD (2 l de antiavidina em 38 l PBD), sendo as lminas incubadas por 5 minutos em cmara mida a 37 oC. Cada tratamento com antiavidina-biotina conjugada foi seguido por um tratamento com FITC-Avidina 0,07% em Tampo C, com incubao por 8 minutos em cmara mida a 37 oC. Depois de cada passo de amplificao, as lminas foram lavadas trs vezes em tampo PBD a
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45 oC por 2 minutos. Os cromossomos foram contracorados com iodeto de propdeo 0,2% diludo em antifade (VectaShield-Vector). Cromossomos hibridados foram analisados usando o microscpio Olympus BX 61 e as imagens capturadas com cmera digital Olympus DP71, com o programa Image-Pro MC 6.0. As metfases mitticas foram processadas no programa Adobe Photoshop CS3, sendo os cromossomos medidos no programa livre Image J. A montagem dos caritipos foi feita de acordo com Thompson (1979) e Mesquita et al. (2008).

III.3.3. Resultados A amplificao da unidade ribossomal 18S (famlia 45S) resultou em um fragmento de aproximadamente 1400 pb para as trs espcies de Symphysodon (Figura 1), cuja sequncia apresentou alta similaridade com DNAr 18S de outras espcies de peixes, incluindo o cicldeo Oreochromis esculentus (99%) e o peixe considerado modelo gentico Oryzias latipes (97%), as quais esto depositadas nos bancos de dados do NCBI.

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Figura 1 Eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com Sybr Safe (1:10.000), evidenciando produtos de PCR amplificados com os primers DNAr 18S para as trs espcies de Symphysodon (1 S. aequifasciatus; 2 S. discus; 3 S. haraldi).

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As trs espcies de Symphysodon apresentaram 2n=60 cromossomos e ausncia de cromossomos sexuais diferenciados, sendo que S. aequifasciatus mostrou 50m-sm+6st-a+4mi (Figura 2a), S. discus 50msm+10st-a (Figura 2b) e S. haraldi 52m-sm+4st-a+4mi (Figura 2c). A anlise de clulas mitticas submetidas impregnao pelo on Prata evidenciou um sistema de RONs mltiplas nas trs espcies de Symphysodon e variao intraindividual, bem como intra e interespecfica. Em S. aequifasciatus as RONs estiveram localizadas na regio terminal dos braos longos dos cromossomos do par 1 e ocupando todo o brao curto dos cromossomos dos pares 3 e 8 (Figura 2d); em S. discus as RONs foram detectadas sobre a regio terminal do brao curto dos pares 17 e 23 (Figura 2e) e em S. haraldi sobre o brao curto dos cromossomos 4, 6, 11 e 21 (Figura 2f). Todas as combinaes possveis, envolvendo estes pares cromossmicos, foram encontradas, estando as RONs ativas em cromossomos homlogos ou no, porm nunca mais que duas marcaes por clula metafsica foram evidenciadas.

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Figura 2 Caritipos em colorao convencional (a, b, c) e regies organizadoras de nuclolo reveladas por impregnao com nitrato de Prata, indicando todos os pares envolvidos (d, e, f) nas espcies Symphysodon aequifasciatus (a, d), Symphysodon discus (b, e) e Symphysodon haraldi (c, f). Somente um dos homlogos est representado porque todas as combinaes de Ag-RONs envolvendo estes pares cromossmicos foram encontradas (barra = 10 m).

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Com relao aos stios ribossomais DNAr 18S, as trs espcies de Symphysodon apresentaram variabilidade intra e interespecfica quanto distribuio destas sequncias nos cromossomos mitticos, porm variao intraindividual no foi observada. Em S. aequifasciatus foram evidenciados dois a trs stios do gene RNAr 18S, os quais apresentaram trs padres de distribuio cariotpica, envolvendo regies terminais dos braos curtos de: (1) ambos os homlogos do par 8 (2 stios Figura 3a), com heteromorfismo de tamanho; (2) um dos homlogos dos pares 3 e 19 (2 stios Figura 3b); (3) um dos homlogos dos pares 3, 8 e 19 (3 stios Figura 3c). Em S. discus foram evidenciados de dois a cinco stios do gene RNAr 18S, os quais apresentaram quatro padres de distribuio cariotpica, sempre envolvendo regies terminais dos braos curtos de: (1) um dos homlogos do par 6 e ambos os homlogos dos pares 17 e 23 (5 stios Figura 3d); (2) ambos os homlogos dos pares 17 e 23 (4 stios Figura 3e); (3) um homlogo do par 17 e ambos os homlogos do par 23 (3 stios Figura 3f); (4) um dos homlogos do par 6 e 17 (2 stios Figura 3g). Em S. haraldi foram evidenciados de dois a trs stios do gene RNAr 18S, os quais apresentaram quatro padres de distribuio cariotpica, envolvendo tanto marcas na regio terminal dos pares cromossmicos 4 e 6 quanto intersticiais dos pares 1 e 28: (1) ambos os homlogos do par 4 (2 stios Figura 3h); (2) um homlogo dos pares 4 e 6 (2 stios Figura 3i); (3) um homlogo dos pares 4, 6 e 28 (3 stios Figura 3j); (4) um dos homlogo dos pares 1, 4 e 6 (3 stios Figura 3k). A frequncia dos diferentes padres de distribuio do stio DNAr 18S foi similar dentro de cada espcie, mas em S. aequifasciatus e S. haraldi um padro preferencial foi encontrado (Tabela 1).

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Figura 3 Padres de distribuio dos stios de DNAr 18S (sinais amarelos) em cromossomos mitticos de Symphysodon aequifasciatus (a-c); S. discus (dg); S. haraldi (h-k). Caritipos (a, d, h) e em destaque (b, c, e, f, g, i, j, k) os padres variantes dos stios ribossomais DNAr 18S para cada espcie (barra = 10 m).

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Tabela 1 Pares cromossmicos de Symphysodon aequifasciatus, S. discus e S. haraldi mostrando os diferentes padres (coluna) de distribuio do DNAr 18S (A, B homlogos) e a frequncia de cada padro por espcie. S. aequifasciatus Padro Pares cromossmicos 1A 3A 4A 4B 6A 8A 8B 17A 17B 19A 23A 23B 28A Frequncia do padro 1 2 3 1 S. discus Padro 2 3 4 1 S. haraldi Padro 2 3 4 -

50,0% 33,0% 17,0% 20,0% 30,0% 30,0% 20,0% 40,0% 20,0% 20,0% 20,0%

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III.3.4. Discusso Em peixes, a anlise do nmero e localizao das RONs amplamente efetuada por meio da impregao destas regies com nitrato de Prata (Galetti Jr. & Martins, 2004). Porm, como a Prata se associa a protenas nucleolares envolvidas com a atividade transcricional dos genes ribossomais da famlia 45S (Miller et al., 1976; Howell & Black, 1980; Boisvert et al., 2007) e tambm pode impregnar regies heterocromticas ricas em resduos cidos (Sumner, 1990), grande parte da variao que tem sido detectada em peixes pode estar associada atividade desses cstrons ou presena de blocos heterocromticos cidos. As trs espcies de Symphysodon submetidas impregnao com on Prata no presente trabalho revelaram variabilidade intraindividual, bem como inter e intraespecfica. Os dados de RONs obtidos para S. discus corroboram os dados prvios, porm em S. aequifasciatus e S. haraldi o nmero de cromossomos envolvidos com as RONs foi menor quando comparado ao padro descrito por Mesquita et al (2008), que mostraram o envolvimento de seis pares cromossmicos na primeira espcie e cinco pares cromossmicos na segunda, sendo at cinco marcaes evidenciadas por clula. Parte da variabilidade encontrada por Mesquita et al. (2008) em relao aos pares cromossmicos envolvidos com as RONs pode ser devido impregnao de heterocromatina constitutiva com on Prata, uma vez que em alguns indivduos do presente trabalho a Prata impregnou tanto as RONs como regies heterocromticas no portadoras de stios ribossomais, como o caso dos cromossomos do par 1 em S. aequifasciatus (Figura 2d e 3 a-c) e pares 11 e 21 em S. haraldi (Figuras 2f e 3 h-k). Alm disso, a presena de constries secundrias que se estendem ao longo de um brao cromossmico inteiro em S. aequifasciatus e S. haraldi (Figura 2d, 2f) tambm poderiam explicar os diferentes cittipos descritos para a mesma espcie por Mesquita et al. (2008). Quando ativo, o DNA ribossomal presente nestes braos cromossmicos pode no estar suficientemente compactado para ser visvel em colorao convencional, o que ocasionaria a
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anfiplastia, que a habilidade dos cromossomos nucleolares metafsicos apresentarem-se sob diferentes formas relacionadas atividade das RONs, sendo este um fenmeno epigentico (revisado por Pikaard, 2000). Assim, a variao intraindividual das RONs, evidenciada por nitrato de Prata nas trs espcies de Symphysodon, pode ser considerada como resultado da atividade dos cistrons ribossomais. J, a variao intra e interespecfica no pode ser creditada a efeitos epigenticos, pois a deteco dos stios DNAr 18S evidenciou diferenas no nmero de loci (duas a cinco marcaes, envolvendo homlogos e no homlogos) e de tamanho, revelando um complexo padro de distribuio destas sequncias nos cromossomos mitticos de indivduos de uma mesma espcie (Figura 3; Tabela 1). Esta variabilidade detectada pela sonda DNAr 18S tambm no pode ser explicada por falhas no processos de hibridizao, uma vez que as sondas foram hibridizadas em condies de alta estringncia, alm de terem sido efetuadas hibridizaes homlogas (sondas de DNA da mesma espcie) e heterlogas (sonda de uma espcie hibridizada em cromossomo de outra), as quais apresentaram os mesmos resultados. Em Symphysodon os stios de DNAr 18S, assim como as marcaes com nitrato de Prata, esto principalmente localizados nos braos curtos, em regies terminais e intersticiais proximais (Figura 3), o que poderia ter facilitado a sua transposio para outros pares de cromossomos por eventos de translocaes. Estes rearranjos tambm parecem ter provocado a mudana de posio do DNAr 5S, o qual no sintnico aos DNAr 18S nas trs espcies de Symphysodon, estando presente nos cromossomos dos pares 10 de S. aequifasciatus e 18 em S. discus e S. haraldi (Gross et al., 2009; no prelo a). A localizao separada dos stios DNAr 45S e DNAr 5S a situao mais comum entre os peixes, provavelmente porque a transcrio dos genes do RNAr 45S efetuada pela RNA polimerase I e o RNAr 5S pela polimerase III (revisado em Martins & Galetti Jr., 2001; Martins, 2007). Alm da variao de nmero e posio dos stios de DNAr 18S, tambm pode ser observado heteromorfismo de tamanho desses stios em cromossomos homlogos nos acars-disco, o que sugere duplicao destas sequncias e/ou crossing-over desigual, como j foi proposto para outros
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peixes e mamferos (Ashley & Ward, 1993; Salvadori et al., 1995; Boron et al., 2006). Esta suposio reforada pelo fato de que as trs espcies de Symphysodon apresentam tanto os cstrons de DNAr 5S como os DNAr 45S em regies de heterocromatina constitutiva, o que tem sido extensivamente documentado em peixes (Pends et al., 1993a, b; Fujiwara et al., 1998; Artoni et al., 2008; Nakayama et al., 2008; entre outros). A heterocromatina atualmente reconhecida como uma importante parte do genoma dos eucariotos (Grewal & Jia, 2007; Skipper, 2007; Bhler, 2009). Devido natureza repetitiva dos DNAs ribossomais e de outras sequncias encontradas na heterocromatina constitutiva, erros da DNA polimerase na adio de nucleotdeos durante a duplicao do material gentico e crossing-over desigual, podem ocasionar acmulo de DNAr (Pends et al., 1993a). Alm disso, a tendncia da associao na organizao nucleolar tambm poderia facilitar translocaes no-recprocas entre RONs (revisado em Wasko & Galetti Jr, 2000). Todos estes fatores, aliados presena de elementos transponveis nas regies heterocromticas nas trs espcies de Symphysodon (Gross et al., no prelo) podem ter ocasionado os polimorfismos estruturais dos stios ribossomais DNAr 45S encontrados nas mesmas. Recentemente uma nova abordagem acerca da variabilidade do DNAr tem surgido, a qual considera esta regio genmica como instvel e sendo um dos stios mais frgeis, que funcionaria como um sensor primrio de danos ocasionados por diversos fatores, inclusive ambientais (Kobayashi, 2006; 2008). Alm disso, alguns elementos transponveis apresentam insero preferencial em posies nucleotdicas particulares do genoma, como o caso do elemento LINE (long interspersed nuclear element) que se insere especificamente nos genes de RNAr 28S em Drosophila melanogaster tornando esta sequncia no funcional (Eickbush, 2002). A manuteno do nmero de cpias viveis dos genes de RNAr sendo expressas de extrema importncia para a clula e, portanto, duplicaes das sequncias ou silenciamento destes genes podem ocorrer, o que explicaria a sua associao com heterocromatina constitutiva, que promove um controle epigentico do genoma por meio de metilao de histonas (Sullivan et al., 2001; Kobayashi,
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2006; 2008; Grewal & Jia, 2007). Assim, o nmero de cpias de DNAr sempre flutuaria e por isso um grande nmero destas sequncias seria encontrado no genoma, garantindo assim a manuteno de cpias viveis (Kobayashi, 2006; 2008). Esta hiptese reforada pelo fato de que os nuclolos parecem coordenar as respostas dos organismos quando submetidos a estresses (Olson, 2004). Os nuclolos so estruturas nucleares organizadas em torno das RONs ativas, que so as regies cromossmicas portadoras das sequncias ribossomais DNAr 45S repetidas em tandem, que tem como funo primria a biognese dos ribossomos (Hernandez-Verdun et al., 2002; HernandezVerdun, 2004). Porm, evidncias mostram que eles apresentam funes adicionais, dentre elas a regulao da mitose, progresso do ciclo celular e proliferao das clulas, estando tambm associados com respostas a muitas formas de estresses exgenos, como alteraes de temperatura, choque trmico, hipxia e outros (Visintin & Amon, 2000; Boisvert et al., 2007; Varriale et al., 2008). Segundo Burt & Trivers (2006) isto ocorre porque os elementos repetitivos, dentre eles o DNAr, esto associados com uma sofisticada maquinaria enzimtica, como o caso do envolvimento destes elementos na evoluo do sistema imune dos vertebrados. A bacia amaznica, rea de endemismo das espcies de Symphysodon, alm de apresentar rios com diferentes caractersticas fsico-qumicas (pH, condutividade eltrica, temperatura) tambm apresenta pulsos de inundao que provocam o alagamento de regies de floresta durante a poca da cheia (Junk & Furch, 1993). Estas flutuaes no nvel da gua expem os peixes a extremas diferenas na disponibilidade de alimentos e abrigos, densidade de predadores e parasitas, e propriedades fsico-qumicas da gua, como oxignio dissolvido, sendo que em reas alagveis h uma tendncia para o estabelecimento de condies hipxicas permanentes ou transitrias (Junk, 1997). Estas presses ambientais levaram os peixes desta regio a desenvolver uma grande plasticidade genotpica durante o processo evolutivo, podendo ser observado uma srie de ajustes etolgicos, morfolgicos, fisiolgicos, metablicos e moleculares que lhes ajuda a manter a homeostase
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orgnica e lhes permite a sobrevivncia durante estas mudanas sazonais (Almeida-Val et al., 1993; Almeida-Val & Farias, 1996). Os acars-disco apresentam uma alta variabilidade gentica molecular e cromossmica (Farias & Hrbek, 2008; Mesquita et al., 2008) e tambm adaptaes que lhes permite sobreviver em condies de hipxia moderada (Chippari-Gomes et al., 2003). Como as trs espcies habitam locais suceptveis a estas variaes ambientais, possvel que ao longo da evoluo das mesmas, estas condies tenham favorecido a movimentao de elementos transponveis, ocasionando eventos de translocao que promoveram a variabilidade do DNAr 18S e da RON, sugerindo que o genoma destas espcies pode ter sido continuamente modificado pelas variaes dos DNAs repetitivos. atuando Assim, rearranjos na cromossmicos estruturais parecem estar efetivamente

carioevoluo dos acars-disco e o padro de organizao e compactao cromossmica podem ter favorecido sua adaptabilidade a diferentes condies ambientais.

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III.4.Captulo 4: Complexo sinaptonmico em acars-disco: cadeia cromossmica meitica

Complex synaptonemical analysis in Discus fish: the meiotic chromosomomal chain. Revista a ser enviado para publicao: Micron

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III.4.1 Introduo Desde meados da dcada de 1960, estudos citogenticos das espcies selvagens de acar-disco (Symphysodon, Cichlidae, Perciformes) tem revelado diferentes frmulas cromossmicas, apesar do nmero diploide sempre ter sido igual a 60 cromossomos (Ohno & Atkin, 1966; Thompson, 1979; Takai et al., 2002; Mesquita et al., 2008). Bandeamentos cromossmicos e mapeamento fsico de sequncias de DNA repetitivo em cromossomos das trs espcies de Symphysodon revelaram grandes blocos de heterocromatina constitutiva (que abriga elementos transponveis como o retrotransposon Rex3), polimorfismo inter e intraespecfico das regies organizadoras de nuclolo (RON) e dos genes RNAr 18S, alm de diferenas na localizao fsica cromossmica do stio de DNAr 5S, o que indica a presena de grandes rearranjos cromossmicos neste txon (Gross et al., 2009; no prelo a; b). Anlises meiticas conduzidas nas trs espcies revelaram que todos os indivduos de S. discus apresentam 30 bivalentes tpicos durante a prfase I, porm em S. aequifasciatus e S. haraldi um intrigante comportamento cromossmico meitico foi evidenciado, onde em ovcitos e espermatcitos uma cadeia cromossmica de at 20 elementos foi encontrada em clulas em diplteno, diacinese e metfase I (Gross et al., 2009). Esta cadeia cromossmica provavelmente originou-se a partir de uma srie de translocaes cromossmicas mltiplas, decorrentes de movimentao de elementos transponveis aps hibridizao de espcies/populaes ancestrais (Gross et al., 2009; no prelo a). Mtodos citogenticos clssicos e moleculares, abordando cromossomos j compactados de Symphysodon, sejam eles mitticos ou meiticos, ainda no foram suficientes para elucidar a evoluo cariotpica deste gnero. A observao do emparelhamento dos cromossomos em prfases meiticas, onde os cromossomos esto parcialmente condensados, pode auxiliar na estimativa do grau de homologia entre os cromossomos de espcies relacionadas e na deteco de rearranjos cromossmicos por meio da anlise do complexo sinaptonmico, que uma estrutura proteica tripartida que
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se forma durante o zigteno entre cromossomos homlogos ou entre regies de homologia de cromossomos no-homlogos (Smithies & Powers, 1986; Carpenter, 1987; John, 1990; Jinks-Robertson et al.,1997; Traut & Clarke, 1997). Deste modo, a proposta deste trabalho foi a anlise do complexo sinaptonmico, em paquteno e diplteno, das espcies S. aequifasciatus e S. haraldi, portadoras da cadeia cromossmica multivalente, visando compreender a carioevoluo dos acars-disco.

III.4.2. Material e Mtodos A anlise de clulas meiticas profsicas de acars-disco machos foram efetuadas em seis exemplares de Symphysodon aequifasciatus e seis exemplares de Symphysodon haraldi. Os peixes foram anestesiados em gua gelada, sendo posteriormente sacrificados por meio da seco da medula espinhal. A tcnica para anlise do complexo sinaptonmico seguiu os protocolos descritos por Moses (1977) e Dresser & Moses (1980) e a impregnao com nitrato de Prata foi efetuada de acordo com protocolo descrito por Howell & Black (1980). Aproximadamente 100 espermatcitos por indivduo foram analisados em S. aequifasciatus e S. haraldi. Para a anlise do complexo sinaptonmico as clulas paquitnicas e diplotnicas que apresentaram boas condies de extenso dos segmentos emparelhados, tiveram sua imagem capturada em fotomicroscpio Olympus Bx-51 do Laboratrio de Gentica Animal-CPBA (INPA) e as clulas profsicas, colocadas sobre membrana plstica e telas metlicas, foram fotografadas em microscpio eletrnico de transmisso Philips, no Centro de MicroscopiaUNESP-Botucatu, em filme 35mm, com exposio de 2,04 segundos, a 80Kv.

III.4.3. Resultados Uma proporo muito baixa de clulas paquitnicas foi observada em Symphysodon aequifasciatus e Symphysodon haraldi, quando comparadas s outras fases meiticas profsicas (1:45). Em todos os paqutenos, de ambas as espcies, um pareamento atpico dos cromossomos foi observado (Figuras 1,
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2). Um nmero varivel de bivalentes por clula (10-20) apresentou pareamento sinptico na totalidade da sua extenso. Assinapse temporria (falta de emparelhamento) de segmentos terminais foi evidenciada em alguns bivalentes (Figura 1a). Elementos laterais descontnuos foram observados em clulas de S. aequifasciatus e S. haraldi, os quais apareceram ligados a outros elementos, formando a cadeia cromossmica que assumiu diversas conformaes, desde lineares (com as extremidades separadas) at em anel (com as extremidades unidas) (Figura 1a, 1b). O estabelecimento do nmero de cromossomos formadores da cadeia multivalente e dos bivalentes tpicos no foi alcanado, uma vez que devido s diferentes conformaes da cadeia multivalente, o emparelhamento dos segmentos homlogos parece ser varivel entre os indivduos e, alm disso, sempre ocorreu sobreposio dos cromossomos, fato que tambm inviabilizou a reconstruo dos pareamentos, tanto na microscopia ptica como na microscopia eletrnica de transmisso. Em associao com os elementos de cada complexo sinaptonmico uma estrutura proeminente eletrodensa, identificada como cinetocoro, foi observada (Figura 2a). Ambas as regies terminais dos elementos laterais tambm apareceram mais escuras que a maior parte do comprimento cromossmico, as quais provavelmente referem-se s placas de ancoragem na membrana nuclear (Figura 2b). Em clulas meiticas paquitnicas de ambas as espcies de Symphysodon alguns centrmeros foram observados em associao, formando aglomerados escuros (Figura 1a). Ndulos de recombinao, em nmero varivel, foram evidenciados em associao com o complexo sinaptonmico de bivalentes e da cadeia cromossmica, os quais provavelmente finalizam em quiasmas (Figura 2b). Durante o diplteno, apesar do complexo sinaptonmico iniciar sua desestruturao, quiasmas foram visualizados tanto em bivalentes tpicos quanto em elementos formadores da cadeia cromossmica, porm o nmero de quiasmas tambm foi varivel em cada elemento e no pode ser estabelecido (Figura 1c).

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Figura 1: Prfase I obtida por processo de microespalhamento de S. aequifasciatus impregnada com nitrato de Prata, em microscopia ptica. a) Clula paquitnica tardia; b) seu esquema evidenciando a cadeia cromossmica multivalente (seta e esquema em vermelho), 16 bivalentes em emparelhamento completo (esquema em azul), 1 bivalente com assinapse na regio terminal (cabea de seta e esquema em roxo) e bivalentes em associao centromrica temporria (estrela e esquema em verde); c) Diplteno incompleto, evidenciando quiasmas na cadeia cromossmica em anel (seta). Note que apesar do complexo sinaptonmico estar se desintegrando, os elementos laterais tambm podem ser evidenciados em algumas pores (cabea de seta). Para S. haraldi as mesmas configuraes meiticas foram encontradas (barra: 10 m).

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Figura 2: Prfase I obtida por processo de microespalhamento de S. haraldi impregnada com nitrato de Prata, em microscopia eletrnica de transmisso. a) Paquteno (1000x de aumento) com nmero de bivalentes e elementos formadores da cadeia cromossmica no determinado. Os cinetocoros (cabea de seta) e regies eletrodensas, provavelmente regies de ancoragem na membrana nuclear (seta), preservados em bivalentes tpicos, com complexo sinaptonmico distribudo ao longo de todo o comprimento. A regio nucleolar est evidenciada (nu). Note que ao longo de alguns elementos cromossmicos o complexo sinaptonmico apresenta colorao mais conspcua e podem estar indicando regies de heterocromatina diferenciada; b) Detalhe dos elementos laterais do complexo sinaptonmico e ndulos de recombinao (seta) ao longo da cadeia cromossmica (5750 x de aumento). Para S. aequifasciatus as mesmas configuraes meiticas foram encontradas.

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III.4.4. Discusso As prfases meiticas em espermatcitos de Symphysodon

aequifasciatus e S. haraldi no apresentaram caractersticas similares s descritas para outras espcies de peixes tropicais, onde ncleos paquitnicos apresentam os cromossomos autossmicos homlogos totalmente emparelhados, sendo possvel verificar a metade do nmero diploide em bivalentes tpicos (Dias, 1995; Rodionova et al., 1996; Bertollo & Mestriner, 1998; Portela-Castro et al.; 2001). Os paqutenos de Symphysodon aequifasciatus e S. haraldi apresentaram nmero varivel de bivalentes tpicos e uma cadeia cromossmica multivalente. Alm disso, alguns centrmeros foram vistos em associao e geralmente esta interao de centrmeros est relacionada com a quantidade de heterocromatina constitutiva que flanqueia esta regio, ou seja, quando a regio heterocromtica centromrica pequena, esta somente suporta uma nica interao de emparelhamento e quando esta regio grande, a associao multivalente pode ocorrer (Stewart & Dawson, 2008). Apesar de S. aequifasciatus e S. haraldi apresentarem grandes blocos de heterocromatina na regio pericentromrica (Mesquita et al., 2008; Gross et al., 2009), a associao de blocos heterocromticos no a causa da formao da cadeia cromossmica meitica, uma vez que nas duas espcies a figura meitica multivalente foi encontrada ao longo de toda a prfase I e metfase I. Segundo De Jong & Stam (1983) e Disney & Wright (1987) associaes centromricas por heterocromatina desaparecem completamente durante a diacinese/metfase I em organismos que apresentam configuraes meiticas multivalentes em paqutenos, sendo visveis, nesta fase, apenas bivalentes tpicos. Assim, a hiptese de associao centromrica pode ser descartada para as espcies de Symphysodon. Por outro lado, o padro de emparelhamento dos cromossomos paquitnicos em ambas as espcies de Symphysodon corroboram os dados obtidos para indivduos hbridos ou de origem poliplide. Em hbridos, como aqueles obtidos dos cruzamentos de Salvelinus alpinus x Salvelinus fontinalis e Poecilia velifera x Poecilia reticulatus (Lee & Wright, 1981; Disney & Wright,
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1987; Rodionova et al., 1996), a configurao multivalente ocorre devido ao emparelhamento de cromossomos homlogos e homelogos das espcies com diploidizao incompleta. O nmero diploide encontrado para as espcies de Symphysodon (2n=60 cromossomos) o maior nmero diploide j encontrado para famlia Cichlidae (para reviso Feldberg et al., 2003) e em 1976 Thompson sugeriu que Symphysodon haraldi (originalmente descrito na publicao como S. aequifasciatus) poderia ser uma espcie poliplide. Em 2008, Mesquita et al. analisando as trs espcies do gnero sugeriram uma outra hiptese para a carioevoluo do gnero, a qual estaria baseada em rearranjos cromossmicos. Mais recentemente, Gross et al. (2009; no prelo a) sugeriram que o aumento do nmero diploide e os rearranjos cromossmicos encontrados nas espcies de Symphysodon teriam sido mediados pelo acmulo de elementos transponveis, como o Rex 3, uma vez que a origem da figura meitica multivalente encontrada em S. aequifasciatus e S. haraldi parece estar baseada em uma srie de translocaes cromossmicas mltiplas, que teriam ocorrido aps a hibridizao de espcies/populaes ancestrais deste gnero. Esta ltima hiptese implica que grande parte da variabilidade cromossmica do gnero Symphysodon seria encontrada apenas em espcies portadoras da cadeia cromossmica, mas variabilidade intra e interespecfica de RONs e stios ribossomais 18S e 5S foi verificada para as trs espcies do gnero, inclusive em S. discus que no portadora de cadeia cromossmica meitica (Gross et al., no prelo a,b). Estes fatos nos levaram a sugerir uma outra hiptese, onde as espcies/populaes ancestrais teriam sofrido rearranjos cromossmicos independentes, j favorecendo a variabilidade cromossmica e, aps a hibridizao, a cadeia cromossmica teria se originado nos hbridos como uma forma de ajustamento sinptico (para que houvesse o emparelhamento de segmentos homlogos devido homologia monobranquial dos cromossomos parentais) e promovesse a viabilidade dos hbridos, que atualmente so reconhecidos como duas espcies distintas e viveis. Esta conformao meitica pode ser preferencial, em detrimento da formao de bivalentes tpicos, como j sugerido para outras espcies de
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peixes hbridos (Lee & Wright, 1981; Disney & Wright, 1987) e por este motivo ainda est sendo evidenciada nestas duas espcies de Symphysodon. Em muitas espcies, a habilidade dos cromossomos homlogos ou de segmentos homlogos em se reconhecerem na prfase meitica I complicada quando ocorre a presena de sequncias repetitivas similares nos cromossomos (Moore, 2002). Como os elementos repetitivos parecem estar envolvidos com estes eventos de transposio que originaram a cadeia cromossmica, vrias formas de emparelhamento de segmentos homlogos podem ser possveis, o que explicaria as diversas conformaes da figura meitica multivalente de S. aequifasciatus e S. haraldi. Apesar da heterocromatina promover a associao de cromossomos no homlogos em alguns organismos (John & King, 1982), este fato certamente no pode ser considerado determinante na formao da cadeia cromossmica meitica de S. aequifasciatus e S. haraldi, uma vez que quiasmas so visualizados dentro da cadeia cromossmica, o que sugere que os seus segmentos formadores so homlogos para que haja a recombinao. Esta conformao meitica pode ser um fator determinante na reproduo destas espcies e na garantia de sua viabilidade, uma vez que as mesmas tem um complexo comportamento reprodutivo (Cmara, 2004; Chellappa et al.,2005; Cardoso, 2008). Em um estudo efetuado em condies naturais, Cardoso (2008) analisou ovcitos de fmeas selvagens de Symphysodon aequifasciatus em estdio de maturao avanada e verificou que a espcie apresenta dois grupos modais pronunciadamente definidos, sendo um de ovcitos de reserva (dimetro de 0,4mm) e outro de ovcitos prontos para serem liberados (dimetro de 0,9mm). Porm, entre os dois extremos, dois grupos modais pouco definidos foram encontrados. Acreditamos que estes ovcitos intermedirios devem estar relacionados a clulas gamticas que no conseguiram completar o seu processo de diviso celular devido no disjuno correta da cadeia cromossmica meitica, sendo portanto clulas inviveis e que podem ser reabsorvidas pelo organismo. J, em Symphysodon discus ovcitos pertencentes a grupos modais pouco definidos no foram encontrados (Cmara, 2004) e como esta espcie no
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portadora de figura meitica multivalente, a maioria dos gametas apresenta o contedo gentico esperado, no havendo a necessidade da reabsoro de ovcitos mal formados. Contudo, estudos reprodutivos abordando a terceira espcie, que tambm apresenta cadeia cromossmica meitica, ainda no foram efetuados para confirmar esta hiptese. Esses dados reforam a complexa evoluo cromossmica de Symphysodon e confirmam o emparelhamento de regies homlogas na cadeia cromossmica de Symphysodon aequifasciatus e Symphysodon haraldi, indicando a origem hbrida dessas espcies. Embora as tcnicas clssicas e moleculares j aplicadas no tenham permitido definir quais so os cromossomos formadores desta figura multivalente, as conformaes da cadeia e o nmero varivel de elementos na prfase meitica indicam que o emparelhamento no nico, nem mesmo no prprio indivduo

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IV. Concluses Gerais As caractersticas citogenticas das populaes amostradas corroboram a existncia de trs espcies, sendo elas S. aequifasciatus (disco verde), S. discus (disco heckel) e S. haraldi (disco azul e marrom). - Apesar das trs espcies de Symphysodon apresentarem 2n=60 cromossomos, caractersticas cromossmicas distintas foram evidenciadas para cada espcie. - As espcies S. aequifasciatus e S. haraldi provavelmente tiveram uma origem hbrida, cujos parentais ainda no foram encontrados e estas apresentaram uma cadeia cromossmica meitica durante o diplteno e que no est relacionada a cromossomos sexuais - A figura meitica multivalente deve ter se originado a partir de uma srie de translocaes que envolveram regies ricas em elementos mveis. Estas translocaes teriam ocorrido dentro de cada populao/espcie ancestral antes de acontecer a hibridizao das espcies ou ento os elementos repetitivos teriam se movimentado ativamente aps a hibridizao entre os ancestrais dos discos que no possuiam cadeia cromossmica - A cadeia cromossmica de S. aequifasciatus e S. haraldi no formada apenas por microcromossomos, uma vez que ambas as espcies apresentam apenas quatro destes cromossomos, e tambm no ocorre devido a associaes heterocromticas, pois esta figura meitica multivalente se mantm durante toda a prfase e metfase I, sendo evidente a presena de quiasmas em regies homlogas. Entretanto, os blocos de heterocromatina podem estar afetando o nmero de quiasmas. - Os stios de 5S no esto envolvidos com as translocaes formadoras da cadeia cromossmica meitica, apesar de estarem adjacentes com heterocromatina constitutiva. Variabilidade inter e intraespecfcia da regio organizadora de nuclolo foi evidenciada pela impregnao por nitrato de Prata e confirmada pela localizao fsica do gene RNAr 18S em cromossomos mitticos, reforando a hiptese do envolvimento do DNA repetitivo nos rearranjos cromossmicos que ocorreram nos acars-disco.
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- A carioevoluo dos Symphysodon est baseada em uma possvel correlao entre acmulo e movimentao de elementos repetitivos, ganho de heterocromatina, heterocromatinizao e rearranjos cromossmicos.

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V. Perspectivas futuras Avanos significativos foram alcanados no entendimento da evoluo cariotpica de Symphysodon, mas muitas contribuies a respeito da organizao genmica dos acars-disco ainda necessitam ser obtidas. Para tanto, alguns aspectos importantes necessitam ser investigados, como: - O mapeamento cromossmico de outras sequncias repetitivas como histonas, elementos transponveis (Rex1, Rex6, mariner, entre outros), assim como outros repetitivos repetitivos do genoma isolados por restrio enzimtica ou Cot-DNA. - Microdisseco da cadeia cromossmica meitica das espcies S. aequifasciatus e S. haraldi e a marcao destas com fluorescncia para serem utilizadas como sondas homlogas e heterlogas em cromossomos mitticos. Esta anlise poder esclarecer quais so os cromossomos formadores desta figura multivalente, alm de indicar se estes so homelogos entre as diferentes espcies. - Anlises de GISH para a confirmao da proposta de origem hbrida das espcies portadoras da cadeia cromossmica.

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VI. Referncia bibliogrfica Almeida-Val, V.M.F.; Val, A.L.; Hochachka, P.W. 1993. Hypoxia Tolerance. In: Hochachka, P.W.; Lutz, P.L.; Sick, T.; Rosenthal, M.; van den Thillart, G. (Org.). Surviving Hypoxia: Mechanisms for Control and Adaptation. CRC Press, Boca Raton. p. 435-445. Almeida-Val, V.M.F.; Farias, I.P. 1996. Metabolic adjustments to chronic hypoxia. In: Val, A.L.; Almeida-Val, V.M.F.; Randall, D.J. (Org.). Physiology and Biochemistry of the Fishes of the Amazon. Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia, Manaus, Amazonas. p. 257-271. Amado, M.V.; Hrbek, T.; Gravena, W.; Fantin, C.; Assuno, E.N.; Astolfi-Filho, S.; Farias, I.P. 2008. Isolation and characterization of microsatellite markers for the ornamental discus fish Symphysodon discus and cross-species amplification in other Heroini cichlid species. Molecular Ecology Research, 8(6): 14511453. Artoni, R.F.; Vicari, M.R.; Bertollo, L.A.C. 2000. Citogentica de peixes neotropicais: mtodos, resultados e perspectivas. Publicatio UEPG Biological and Health Sciences 6(1): 43-60. Artoni, R.F.; Gross, M.C.; Schneider, C.H.; Vicari, M.R.; Almeida, M.C.; Matoso, D.A. 2008. Epifluorescence and light microscopy evidencing structural and functional polymorphism of ribosomal DNA in fish (Teleostei: Astyanax fasciatus). Micron, 39: 11561159. Asahida, T.; Kobayashi, T.; Saitoh, K.; Nakayama, I. 1996. Tissue preservation and total DNA extraction from fish stored at ambient temperature using buffers containing high concentration of urea. Fisheries Science, 62(5): 727730. Ashley, T.; Ward, D.C. 1993. A hot spot of recombination coincides with interstitial telomeric sequence in the Armenian Amster. Cytogenetic and Cell Genetics, 62: 169171. Axelrod, H.R. 1978. All about Discus. T.F.H. Publications, Neptune City, USA. 128 pp.

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