Versi terjemahan dari Tetraphyroll in plant.

doc

Coenzymology: biokimia vitamin biogenesis dan kofaktor yang mengandung enzim

Rapat Independen diadakan di King College, Cambridge, Inggris, 4-7 April 2005. Terorganisir dan Diedit oleh AG Smith (Cambridge, Inggris) dan AW Munro (Leicester, Inggris).

Regulasi biosintesis tetrapyrrol pada tanaman tingkat tinggi

M. Moulin dan AG Smith
1

Departemen Ilmu Tanaman, Universitas Cambridge, Cambridge CB2 3EA, Inggris

Abstrak Senyawa Tetrapyrrol merupakan biomolekul yang paling berlimpah di bumi dan kofaktor dari berbagai apoprotein yang penting untuk fungsi tanaman. Keempat produk akhir sirohaem, chlorophyll, haem dan phytochromobilin yang disintesis melalui cabang jalur yang sama, yang mana diatur secara ketat untuk menjamin kelanjutan pasokan dari apoprotein sejenis. Hal ini dapat mendorong kompetisi yang kuat antara berbagai cabang jalur untuk substrat yang sama. Selain itu, senyawa intermediet, yaitu senyawa fototoksik, tidak boleh terakumulasi dalam sel. Kontrol utama selama sintesis dari prekursor awal, yaitu ALA (5-aminolaevulinic acid), dan pada cabang alur tertentu terjadi penyisipan ion logam ke dalam siklus makro senyawa porfirin. Sebuah studi baru-baru ini juga menyarankan bahwa tetrapyrrol terlibat dalam komunikasi antara kloroplas dan nukleus, sehingga dibutuhkan regulasi yang ketat. Namun, intermediet tetap sulit untuk diukur terutama karena kandungan yang rendah dan sifat yang berbeda tiap senyawa intermediet. Dalam makalah ini, kami merangkum pengaturan jalur ini dan kami rincikan mengapa penting untuk mencari metode yang akurat untuk penentuan tetrapyrrol pada tanaman. Pengenalan

Tetrapyrroles adalah molekul penting dalam organisme hidup dan melakukan banyak fungsi seluruh pembangunan. Para tetrapyrrole paling melimpah pada tanaman adalah klorofil, pigmen yang bertanggung jawab untuk panen dan perangkap cahaya selama fotosintesis. Haem adalah kofaktor untuk protein dalam ayat di-proses seluler termasuk respirasi (sitokrom), metabolisme oksigen (misalnya katalase, peroksidase dan oksidase NADPH) dan oksigen yang mengikat (leghaemoglobin), sedangkan Siro-haem, sebagai kofaktor dari nitrit dan sulfit reductases, ulang quired untuk asimilasi nitrogen anorganik dan belerang dari lingkungan. Produk tetrapyrrole keempat syn-thesized pada tanaman adalah phytochromobilin, kromofor dari keluarga fitokrom dari fotoreseptor merah / jauh-merah, yang
Kata kunci: biosintesis, klorofil, haem, tanaman tetrapyrrole, protoporfirin IX, regulasi. Singkatan yang digunakan: ALA, asam 5-aminolaevulinic; GluTR, glutamil-tRNA reduktase; POR, NADPH: protochlorophyllide oxidoreductase.
1

Untuk siapa korespondensi harus ditujukan (email as25@cam.ac.uk).

menyediakan tanaman dengan sarana untuk memperoleh informasi tentang lingkungan sekitar mereka. Langkah-langkah enzimatik dari jalur (Gambar 1) dengan baik ditandai (lihat [1,2] untuk review). Prekursor awal, ALA (5-aminolaevulinic asam), terbuat dari glutamil-tRNA, dengan enzim kunci yang GluTR (glutamil-tRNA pengurangan-Tase). Delapan molekul ALA digunakan untuk membentuk tetrapyr-peran primogenitor uroporphyrinogen III. Ini adalah baik alkohol, teroksidasi dan kemudian Fe 2 + dimasukkan untuk membentuk Sirohaem, atau oksidatif dekarboksilasi untuk membentuk protoporfirin IX. Penyisipan Mg 2 + ke dalam macrocycle porfirin, cata-segaris dengan chelatase magnesium, adalah langkah pertama dari cabang kloro-phyll, sedangkan penyisipan Fe 2 + oleh ferrochelatase pro-duces haem. Hal ini kemudian diubah menjadi phytochromobilin setelah pembukaan cincin dan hilangnya ion logam. Semua tetrapyrroles disintesis di kloroplas, atau dalam plastida nonfotosintetik sel, dengan pengecualian bahwa dua langkah terakhir sintesis heme juga ditemukan dalam mitokondria [2]. Meskipun tetrapyrrole utama, klorofil, terbatas pada

2005 737 Biokimia Masyarakat

Gambar 1 Tetrapyrrole jalur biosintesis pada tanaman tingkat tinggi Keempat produk akhir, heme, klorofil, sirohaem dan phytochromobilin, harus dirakit dengan apoprotein berhubungan (kotak). GSA, glutamat-1-semialdehyde; PBG, porphobilinogen; urogen, uroporphyrinogen III; coprogen, coproporphyrinogen III; protogen, protoporphyrinogen IX; Mg-Proto ME, magnesium metil ester protoporfirin IX.

kloroplas, seperti sirohaem, haem hadir dalam semua kompartemen selular [3], dan fitokrom beroperasi di sitosol dan nukleus.

Alasan untuk peraturan ketat sintesis tetrapyrrole

Ada tiga alasan utama bagi tanaman yang lebih tinggi untuk mengendalikan jalur biosintesis tetrapyrrole. (A) Keempat tetrapyrroles utama diperlukan dalam cukup bda-ferent jumlah di berbagai bagian tanaman. Klorofil hanya ditemukan pada sel fotosintetik, terutama di daun dan batang, sedangkan haem diperlukan dalam setiap sel. Di sisi lain, mungkin ada sampai 100 kali lebih klorofil dalam sel dari semua tetrapyrroles lainnya. Peraturan pada titik cabang, khususnya di tangga logam penyisipan antara heme dan cabang klorofil, dengan demikian penting. (B) Semua intermediet tetrapyrrole yang fototoksik dan menghasilkan radikal oksigen singlet dan spesies ketika mereka senang dengan cahaya, sehingga selama periode pro duction-klorofil cepat, misalnya selama penghijauan bibit etiolated, intermediet tidak harus diizinkan untuk menumpuk. Para fototoksisitas dari tetrapyrroles membuat jalur target agribisnis-budaya yang penting untuk herbisida: penghambatan proto-porphyrinogen oksidase oleh herbisida difenil eter menyebabkan akumulasi protoporfirin IX dan seiring foto-pemutihan jaringan tanaman dalam terang [4]. Lesi serupa telah diamati dalam mutan sintesis tetrapyrrole

enzim, di mana blok di jalur mengarah ke akumulasi porfirin [5,6]. Kontrol utama adalah pada produksi prekursor ALA awal. (C) Selama generasi aparat fotosintesis, berhati-hati koordinasi sintesis protein dan kofaktor mereka diperlukan, diikuti oleh perakitan ke dalam membran tilakoid. Klorofil sendiri adalah berpotensi fototoksik, sehingga kopling sintesis dengan bahwa dari klorofil apoprotein memastikan bahwa tidak ada kolam klorofil gratis. Reaksi polipeptida pusat yang disandikan oleh genom kloroplas, sedangkan cahaya-panen protein klorofil, exemplidibenarkan oleh gen Lhcb, dikodekan oleh nukleus. Koordinasi sintesis klorofil dan klorofil-mengikat protein dicapai melalui umum cahaya sinyal jalur yang mengatur HEMA1 keduanya, pengkodean enzim pertama dari GluTR jalur, dan ekspresi Lhcb [7].

Peran langsung cahaya

Modulator eksternal yang paling penting dari jalur tetrapyrrole pada tanaman adalah cahaya. Dalam angiosperma, memainkan peran langsung dalam cabang klorofil, karena POR (NADPH: proto-chlorophyllide oxidoreductase) membutuhkan cahaya untuk aktivitas. POR mengkatalisis photoreduction dari protochlorophyllide (Pchlide) untuk chlorophyllide, dan hadir dalam etioplasts gelap-tumbuh bibit pada tingkat tinggi sebagai kompleks terner dengan Pchlide dan NADPH, membentuk tubuh prolamellar [8]. Ada isoenzim POR tiga di Arabidopsis yang terkait satu sama lain di tingkat urutan tapi diferensial pengatur-lated Pora dan transkrip PORB terakumulasi dalam bibit muda,. Tapi ekspresi Pora sangat turun-diatur oleh cahaya, dan hanya transkrip PORB terdeteksi pada tahap akhir dari pengembangan [9]. mRNA PORC terakumulasi hanya setelah pencahayaan di bibit etiolated dan terutama hadir dalam jaringan hijau sepenuhnya jatuh tempo [10]. Gymnosperma, tanaman lebih rendah dan ganggang juga memiliki POR cahaya-independen, yang terdiri dari tiga subunit enzim terkait dengan tergantung cahaya, ditunjuk ChlL, ChlN dan ChlB. Mutasi gen chlN dan chlB mengungkapkan bahwa mereka sangat penting untuk cahaya-independen pengurangan Pchlide [11], sedangkan chlL tidak [12].

ALA sintesis: satu situs untuk beberapa regulasi

Titik regulasi utama dalam jalur adalah pada GluTR, salah satu enzim produksi ALA dari glutamil-tRNA. Dalam Arabidopsis, tiga HEMA gen telah ditandai [7,13,14] HEMA1 dan HEMA2 gen memiliki identitas 83% di tingkat asam amino, tetapi berbeda dalam pola ekspresi-Sion.. HEMA3, diidentifikasi melalui pencarian database Arabidopsis yang urutan genom, diperkirakan untuk mengkodekan Tein pro yang 65 dan 68% identik dengan HEMA1 dan HEMA2 masing-masing. Transkrip HEMA1 Arabidopsis tampaknya menjadi bentuk dominan dalam daun dan telah terdeteksi di semua bagian tanaman [13] HEMA2 itu. Ditemukan di akar dan bunga dan daun yang terinfeksi [14,15], sedangkan HEMA3 ditemukan hanya dalam akar [16] HEMA gen. diatur oleh hormon [17], jam sirkadian [18], cahaya, melalui aksi fitokrom dan cryptochrome [7,19], dan gula [15]. Jadi beberapa faktor eksternal dapat mempengaruhi fluks melalui jalur tetrapyrrole, oleh sintesis dari prekursor awal. Ada juga bukti untuk modulasi aktivitas enzim GluTR. Ada bukti bahwa heme, yang sintesis dapat ditingkatkan dalam gelap oleh akumulasi intermediet jalur belakang blok di POR, bertindak untuk menekan sintesis ALA, karena aktifitas GluTR dihambat oleh haem [20]. Hal ini didukung oleh pengamatan bahwa fitokrom chro-mophorekekurangan mutan, seperti hy1 dan hy2, telah kembali diperkenalkan sintesis protochlorophyllide dan ALA dalam gelap [6]. Kemampuan untuk mengurangi omset haem dapat menyebabkan in-lipatan di tingkat nya. Penelitian lebih lanjut memberikan konfirmasi hipotesis ini. Tembakau tanaman berubah dengan antisense RNA ferrochelatase lesi nekrotik dipamerkan disebabkan oleh akumulasi protoporfirin IX [21], sedangkan tanaman tembakau antisense untuk subunit chelatase magnesium mengalami penurunan kandungan klorofil pada daun, tetapi tidak menunjukkan lesi nekrotik, menunjukkan bahwa akumulasi porfirin dicegah oleh umpan balik haem [22,23]. Pengaturan lebih lanjut tampaknya dimediasi oleh cabang kloro-phyll. Arabidopsis mutan flu terakumulasi tingkat yang sangat tinggi Pchlide dalam gelap, dan jika tanaman mantan diajukan kepada cahaya putih, photobleaching diamati karena fototoksisitas dari Pchlide [24,25]. Selanjutnya, FLU ditunjukkan untuk berinteraksi langsung dengan GluTR dalam ragi sistem dua-hibrida [24], dan khusus untuk GluTR dikodekan oleh HEMA1, disajikan dalam jaringan photosynthetically aktif. Sebuah layar bibit flu termutasi dilakukan, untuk mengisolasi penekan. Satu penekan seperti yang diidentifikasi adalah ulf3, yang mengurangi sintesis ALA dan akumulasi Pchlide. Itu ditemukan alelik untuk hy1, mendukung model yang haem antagonizes efek dari mutasi flu dengan menghambat GluTR independen [24].

Persaingan antara cabang-cabang sirohaem, heme dan klorofil

Kloroplas mengandung tiga kegiatan chelatase: (i) ferroche-latase bertanggung jawab untuk sintesis heme, (ii) magnesium Chela-Tase pada cabang klorofil dan (iii) sirohydrochlorin fer-rochelatase untuk membuat sirohaem. Kehadiran enzim-enzim dalam organel tunggal menimbulkan pertanyaan tentang bagaimana jalur ini diatur untuk menghindari persaingan untuk substrat dan ion logam.

Kompetisi untuk protoporfirin IX

Langkah kontrol pada titik penyisipan logam September-cabang yang arates klorofil dan sintesis heme adalah kurang dipahami. Meskipun mereka mengkatalisis reaksi identik, dua enzim chelatase sangat berbeda. Ferrochelatase adalah monomer atau homodimer dan tidak memerlukan kofaktor, sedangkan magnesium chelatase terdiri dari tiga subunit non-identik (ChlH, ChlI dan ChlD) dan membutuhkan ATP untuk kegiatan [2]. Para

sifat kinetik dari dua enzim juga cukup berbeda. Chelatase Magnesium memiliki m K jauh lebih rendah untuk protopor-phyrin IX dari ferrochelatase, menunjukkan bahwa chelatase magnesium akan bersaing secara efektif dengan ferrochelatase untuk substrat ini. Ferrochelatase dihambat oleh ATP [26], sehingga dalam terang, ketika ATP tingkat lebih tinggi, cabang magnesium jalur akan disukai, sebaliknya, di khelasi, magnesium gelap akan berkurang. Kontrol mungkin diberikan tidak hanya melalui perbedaan dalam sifat-sifat fisik dari enzim, tetapi juga melalui ekspresi yang berbeda dari gen untuk chelatases. Di Arabidopsis, para chelatase magnesium ChlH subunit mencapai puncaknya pada awal fase cahaya dan ferrochelatase mencapai puncaknya pada akhir fase cahaya, menunjukkan ritme diurnal [27].

Kompetisi untuk ion besi

Dalam kloroplas, ada persaingan untuk ion besi antara ferrochelatase dan sirohydrochlorin ferrochelatase (SirB), yang bertanggung jawab untuk sintesis Siro-haem, kofaktor dari nitrit dan sulfit reductases. Sebuah homolog SirB Bacillus megaterium diidentifikasi dalam Arabidopsis dengan BLAST mencari [28]. Bentuk dewasa dari protein Arabidopsis tampaknya hanya terdiri dari 150 asam amino, sehingga jauh lebih kecil daripada ferrochelatases sebelumnya ditandai. Selain itu, mengandung Fe-S pusat (2Fe-2S jenis) di terminal C-(Gambar 2A). Hal ini tidak ditemukan dalam homolog SirB bakteri, maupun dalam ferrochelatases tanaman, tetapi sangat ditemukan pada hewan ferro-chelatases [29]. Kehadiran Fe-S pusat pada tanaman SirB bahkan lebih menarik, karena lebih mengintegrasikan co-faktor sintesis ke dalam metabolisme besi dan belerang (Gambar 2B). Peran sirohaem di reductases sulfit dan nitrit berarti bahwa ia bertanggung jawab untuk asimilasi semua sulfur anorganik dan mayoritas nitrogen dalam biosfer. Jadi, tanpa sirohaem, tidak akan ada sulfur dikurangi dalam sel diperlukan untuk penggabungan ke dalam asam amino sistein dan metionin dan untuk sulfur dalam Fe-S pusat. Selain itu, asimilasi nitrogen meningkatkan kompetisi untuk ion besi. Nitrat diubah menjadi nitrit oleh reduktase ni-trate haemoprotein dan kemudian dikurangi dengan nitrit reduktase nitrit, sirohaemoprotein lain (Gambar 2B). Mungkin SirB Fe-S cluster adalah entah bagaimana terlibat dalam menengahi persaingan untuk ion besi antara enzim berbeda. Hal lain yang menarik adalah bahwa sirohydrochlorin fer-rochelatases menunjukkan urutan kesamaan dengan monomer CbiX, enzim yang terlibat dalam jalur anaerob vitamin B 12 bertanggung jawab untuk Co 2 biosintesis + penyisipan ke sirohydrochlorin [30]. Selanjutnya, protoporfirin ferrochelatases berbagi kesamaan struktural dengan bentuk dimer dari cobalto-chelatase CbiK, meskipun tidak ada kesamaan urutan [31]. Enzim ini semua milik chelatases logam kelas II, sedangkan chelatase magnesium kelas saya enzim, sebagai adalah cobaltochelatase pada jalur B aerobik vitamin 12. Seperti chelatase magnesium, itu heterotrimeric, yang terdiri dari subunit CobN, tongkol dan CobT, dan CobN memiliki beberapa kesamaan urutan ke ChlH [31].
Gambar 2 Hubungan antara sirohydrochlorin dan protoporfirin ferrochelatases (A) Skema representasi dari ferrochelatase sirohydrochlorin dari Arabidopsis (AtSiB), menunjukkan posisi 2 pusat 2 Fe S dekat terminal C-, dibandingkan dengan ferrochelatases protoporfirin dari Arabidopsis (Pada FC) dan manusia (Hs FC), yang lebih lama (~ 400 residu dibandingkan dengan 150 residu). Perhatikan bahwa FC Hs memiliki Fe 2 S 2 sama pusat dalam posisi setara. Kotak-kotak di N-Termini merupakan peptida transit untuk menargetkan untuk kloroplas (AtSirB dan At FC) atau mitokondria (Hs FC). (B) Skema representasi dari berbagai kompetisi antara ion dan kofaktor Fe-besi yang mengandung enzim.

Tetrapyrroles sebagai molekul sinyal

Koordinasi antara biosintesis tetrapyrrole dan pro-duction klorofil-mengikat protein tampaknya medi-diciptakan oleh sinyal retrograde dari kloroplas ke inti [32]. Ini jalur sinyal awalnya diidentifikasi berdasarkan temuan bahwa tanaman dengan cacat plastida telah mengurangi ekspresi gen nuklir dikodekan fotosintesis, termasuk gen Lhcb [33]. Norflurazon, herbisida yang menghambat sintesis enzim karotenoid phytoene de-saturase, telah sangat banyak digunakan [34]. Dalam hal ini, padam triplet hasil pembentukan klorofil dalam

foto-oksidatif kerusakan kloroplas dalam cahaya putih dan mengarah pada penurunan dramatis dalam ekspresi Lhcb dan beberapa enzim biosintesis tetrapyrrole. Mungkin tidak mengejutkan, sebuah layar untuk Arabidopsis mutan yang cacat dalam jalur sinyal telah mengungkapkan peran penting dan signifikan untuk tetrapyrroles dalam proses. Pada layar asli, total lima non-alelik gun (genom un digabungkan) mutan diidentifikasi, yang Lhcb gen yang updiatur dalam cahaya di hadapan norflurazon (dan karena itu tanpa adanya plastida fungsional) [35 ]. Salah satu mutan, gun1, tampaknya beroperasi melalui mesin sintesis protein kloroplas, namun empat lainnya secara langsung mempengaruhi jalur tetrapyrrole. Gun5 mengkodekan ChlH magnesium chelatase subunit [36] dan gun4 adalah pengatur chelatase magnesium [37], sedangkan gun2 dan gun3 (alelik untuk hy1 dan hy2) kekurangan heme oxygenase dan sintase phytochromobilin masing-masing [36]. Modifikasi jalur tetrapyrrole baru-baru ini telah ditunjukkan untuk memperpanjang lebih dari sekedar mempengaruhi tingkat tetrapyrrole akhir produk atau apoprotein serumpun mereka. Tanaman Arabidopsis di mana pemecahan klorofil chlorophyllase enzim tunduk pada RNAi membungkam tidak mampu untuk menurunkan klorofil gratis, yang mengarah ke peningkatan tingkat spesies oksigen reaktif, dan tanaman menunjukkan respon diubah untuk patogen [38]. Demikian pula, seorang mutan acd2, yang juga telah mengurangi kapasitas untuk pemecahan klorofil, exhi-bited lesi nekrotik dan aktivasi konstitutif pertahanan dalam ketiadaan infeksi patogen [39].

Mengukur tingkat tetrapyrrole pada tanaman

Dari hasil yang dijelaskan pada bagian sebelumnya, dapat disimpulkan bahwa perubahan intermediet tetrapyrrole dan / atau produk akhir mempengaruhi proses seperti ekspresi gen nuklir dan tanggapan terhadap patogen, dan bahwa tetrapyrroles sendiri adalah molekul sinyal. Untuk mendukung ini, Strand dkk. [32] menunjukkan bahwa 50 M magnesium protoporfirin IX mengurangi ekspresi Lhcb dalam protoplas Arabidopsis. Tetrapyrrole intermediet juga telah ditunjukkan mempengaruhi transkripsi gen nuklir di Chlamydomonas alga reinhardtii [23] dan pada tanaman tingkat tinggi lainnya [40,41]. Namun, kesimpulan perusahaan sulit untuk menarik, karena perubahan yang jelas dan kontra-sistent di tingkat endogen tetrapyrroles belum dibuktikan. Hal ini karena pengukuran dapat diandalkan dan kuantitatif senyawa ini sulit dengan metode saat ini, baik karena tingkat intermediet rendah dalam jaringan tanaman dan karena tingkat tinggi klorofil, yang mengganggu pengukuran. Metode terbaru untuk penentuan tetrapyrroles menggunakan spektrofotometri atau Uranium. Setelah pemisahan ekstraksi aseton, dan fase dengan heksana untuk menghilangkan klorofil, tetrapyrroles dapat dipisahkan dengan HPLC digabungkan dengan spectrofluorimeter, dengan gradien asetonitril / metanol [22,40,42]. Atau, tetrapyrroles dapat dianalisis dengan spectrofluorimetry tanpa pemisahan oleh HPLC. Ukur-dokumen dilakukan dengan menggunakan panjang gelombang tertentu untuk eksitasi dan emisi, konsentrasi yang dihitung berdasarkan

Gambar 3 Tetrapyrrole analisis oleh LC / MS (A) Struktur protoporfirin IX. (B) Kromatogram dari HPLC standar porfirin menunjukkan pemisahan yang jelas dari semua lima senyawa. Inset: pola fragmentasi ion utama (563,4) dalam fraksi IX protoporfirin, menunjukkan puncak 445,3 504,3 dan sesuai dengan hilangnya 1 atau 2 propionat kelompok (59 Amu), dan puncak 489,3 429,3 dan sesuai dengan hilangnya kelompok metil (15 Amu). (C) Kromatogram dari ekstrak aseton dari gelap-tumbuh tanaman Col0 diobati dengan 1 mM ALA. Inset: pola fragmentasi senyawa dengan waktu retensi (24,7 menit) dan massa (563,4 Amu) identik dengan protoporfirin IX. Uro, uroporphyrin; Copro, coproporphyrin; Proto IX, protoporfirin IX; Mg-Proto, magnesium protoporfirin IX.

lated oleh rumus empiris [43,44]. Namun, ada disad-vantages metode ini. Karya-up yang diperlukan (ekstraksi tions, derivatizations dll) dapat menyebabkan kerugian diferensial dan memakan waktu. Sebuah ketidaknyamanan utama adalah bahwa haem tidak dapat terdeteksi oleh metode ini, karena tidak berpendar. Untuk mempelajari regulasi dari jalur tetrapyrrole dan dampaknya pada proses seluler lain, akan sangat bermanfaat untuk memiliki metode yang dapat diandalkan dan sensitif untuk menentukan semua tetrapyrroles secara bersamaan. Munculnya NMR dan MS untuk mengukur metabolit [45] menyediakan cara yang mungkin untuk tujuan ini. Porfirin heme dan lainnya dapat dideteksi dengan 1 H NMR [46], namun sensitivitas dari detektor masih terlalu rendah untuk penentuan tingkat tetrapyrrole endogen pada tanaman. Di sisi lain, MS jauh lebih sensitif dan, pada kenyataannya, umumnya digunakan dalam ilmu kedokteran dalam rangka studi gangguan porfirin pada manusia [47], dan untuk isolasi dan karakterisasi glycoconjugates protoporfirin pada tikus [48]. Menggunakan pendekatan ini, seharusnya mungkin untuk mendeteksi semua tetrapyrroles dengan peran penting dalam regulasi jalur pada tanaman, dan juga untuk mempelajari fluks dari jalur ini pada tanaman dengan perubahan tingkat enzim tetrapyrrole. Untuk mengeksplorasi kemungkinan ini, kami telah bekerja HPLC digabungkan dengan Ion-Perangkap MS, yang memungkinkan tandem MS ion tertentu, sehingga menimbulkan pola fragmentasi diagnostik (Gambar 3B). Misalnya, protoporfirin IX (Gambar 3C),

dengan massa 563,3 Amu (satuan massa atom), kehilangan pertama kelompok propionat, maka kelompok metil, konstituen perifer dari macrocycle porfirin. Senyawa sehingga dapat dicirikan oleh kombinasi dari waktu retensi dan tanda tangan fragmentasi spesifik. Menggunakan metode ini, kita telah mampu mendeteksi intermediet beberapa ekstrak tanaman, ditunjukkan untuk protoporfirin IX di Gambar 3 (C).

Kesimpulan
Singkatnya, dalam dekade terakhir, peran yang dimainkan oleh tetra-pirol intermediet telah diakui menjadi penting besar dalam metabolisme tanaman seluler, namun tetap belum jelas bagaimana jalur ini diatur untuk menghindari penumpukan dan persaingan dan untuk memastikan signall ingbenar antara kloroplas dan sisa sel. Para abi-lity untuk menentukan dengan keakuratan intermediet berbeda menggunakan ekstraksi yang sederhana dan unik akan bermanfaat besar dalam menangani pertanyaan-pertanyaan ini.
Kami mengakui Uni Eropa FPV (HPRN-CT-2002-00244) untuk pendanaan pekerjaan ini. Kami berterima kasih kepada Profesor E. Laue dan Mr J. Phillips (Departemen Biokimia, University of Cambridge) untuk penggunaan spektrometer massa-Ion Trap. Kami juga berterima kasih kepada Dr B. Keely (Departemen Che-Mistry, University of York), Dr L. Hill (John Innes Centre, Norwich, Inggris) dan Profesor J. Sanders dan Dr A. Belenguer (Departemen Che-Mistry, Universitas Cambridge) untuk bantuan

dan saran tentang metodologi LC-MS.

Referensi
1 Beale, SI (1999) Photosynth. Res. 60, 43-73 2 Cornah, JE, Terry, MJ dan Smith, AG (2003) Tren Tanaman Sci. 8, 224-230 3 Smith, AG, Cornah, JE, Roper, JM dan Singh, DP (1999) dalam Metabolisme Karbohidrat Tanaman (Bryant, JA, Burrell, MM dan Kruger, NJ, eds.), Hlm 281-294, BIOS Ilmiah Penerbit, Oxford 4 Matringe, M., Camadro, JM, Labbe, P. dan Scalla, R. (1989) Biochem. J. 260, 231-235 5 Ishikawa, A., Okamoto, H., Iwasaki, Y. dan Asahi, T. (2001) Tanaman J. 27, 89-99 6 Papenbrock, J., Mishra, S., Mock, HP, Kruse, E., Schmidt, EK, Petersmann, A., Braun, HP dan Grimm, B. (2001) Tanaman J. 28, 41-50 7 McCormac, AC dan Terry, MJ (2002) Tanaman J. 32, 549-559 8 von Wettstein, D., Gough, S. dan Kannangara, CG (1995) Tanaman your 7, 1039-1057 9 Armstrong, GA, Runge, S., Frick, G., Sperling, U. dan Apel, K. (1995) Tanaman Physiol 108,. 1505-1517 10 Oosawa, N., Masuda, T., Awai, K., Fusada, N., Shimada, H., Ohta, H. dan Takamiya, KI (2000) FEBS Lett 474,. 133-136 11 Li, J., Goldschmidt-Clermont, M. dan Timko, MP (1993) Tanaman your 5, 1817-1829 12 Dia, T., Brune, D., Nieman, R. dan Vermaas, W. (1998) Eur. J. Biochem. 253, 161-172 13 Ilag, LL, Kumar, AM dan Soll, D. (1994) Tanaman your 6, 265-275 14 Kumar, AM, Csankovszki, G. dan Soll, D. (1996) Mol Tanaman. Biol. 30, 419-426 15 Ujwal, ML, McCormac, AC, Goulding, A., Kumar, PM, Soll, D. dan Terry, MJ (2002) Mol Tanaman. Biol. 50, 81-89 16 Tanaka, R., Yoshida, K., Nakayashiki, T., Tsuji, H., Inokuchi, H., Okada, K. dan Tanaka, A. (1997) Photosynth. Res 53,. 161-171

17 Masuda, T., Ohta, H., Shioi, Y., Tsuji, H. dan Takamiya, KI (1995) Tanaman Physiol your 36,. 1237-1243 18 Kruse, E., Grimm, B., Beator, J. dan Kloppstech, K. (1997) Planta 202, 235-241 19 McCormac, AC, Fischer, A., Kumar, PM, Soll, D. dan Terry, MJ (2001) Tanaman J. 25, 549-561 20 Vothknecht, UC, Kannangara, CG dan Von Wettestein, D. (1988) Fitokimia 47, 513-519 21 Papenbrock, J., Mock, HP, Kruse, E. dan Grimm, B. (1999) Planta 208, 264-273 22 Papenbrock, J., Pfundel, E., Mock, H.-P. dan Grimm, B. (2000) Tanaman J. 22, 155-164 23 Papenbrock, J., Mock, HP, Tanaka, R., Kruse, E. dan Grimm, B. (2000) Tanaman Physiol 122,. 1161-1170 24 Goslings, D., Meskauskiene, R., Kim, C., Lee, KP, Nater, M. dan Apel, K. (2004) Tanaman J. 40, 957-967 25 Danon, A., Miersch, O., Felix, G., Camp, RGL dan Apel, K. (2005) Tanaman J. 41, 68-80 26 Cornah, JE, Roper, JM, Singh, DP dan Smith, AG (2002) Biochem. J. 362, 423-432 27 Harmer, SL, Hogenesch, JB, Straume, M., Chang, H.-S., Han, B., Zhu, T., Wang, X., Kreps, JA dan Kay, SA (2000) Ilmu 290, 2110-2113 28 Singh, DP, Cornah, JE, Hadingham, S. dan Smith, AG (2002) Mol Tanaman. Biol. 50, 773-788 29 Dailey, TA dan Dailey, HA (2002) J. Bacteriol 184,. 2460-2464 30 Raux-Deery, E., Leech, HK, Nakrieko, K.-A., McLean, KJ, Munro, AW, Heathcote, P., Rigby, SEJ, Smith, AG dan Warren, MJ (2005) J. Biol. Chem. 280, 4713-4721 31 Schubert, HL, Raux, E., Wilson, KS dan Warren, MJ (1999) Biochem. J. 38, 10660-10669 32 Strand, A., Asami, T., Alonso, J., Ecker, JR dan Chory, J. (2003) Alam (London) 421, 79-83 33 Gray, JC, Sullivan, JA, Wang, JH, Jerome, CA dan MacLean, D. (2003) philos. Trans. R. Soc. Lond. B 358, 135-145 34 Taylor, WC (1989) Annu. Rev Physiol Tanaman. Tanaman Mol. Biol. 40, 211-233 35 Susek, RE, Ausubel, FM dan Chory, J. (1993) your (Cambridge, Mass) 74, 787-799 36 Mochizuki, N., Brusslan, JA, Larkin, R., Nagatani, A. dan Chory, J. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 2053-2058 37 Larkin, RM, Alonso, JM, Ecker, JR dan Chory, J. (2003) Ilmu 299,

902-906 38 Kariola, T., Brader, G., Li, J. dan Palva, ET (2004) Tanaman your 17, 283-287 39 Mach, JM, Castillo, AR, Hoogstraten, R. dan Greenberg, JT (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 771-776 40 Yaronskaya, E., Ziemann, V., Walter, G., Averina, N., Borner, T. dan Grimm, B. (2003) Tanaman J. 35, 512-522 41 Olsson, U., Sirijovski, N. dan Hansson, M. (2004) Physiol Plant. Biochem. 42, 557-564 42 Alawady, AE dan Grimm, B. (2005) Tanaman J. 41, 282-290 43 Kopetz, KJ, Kolossov, VL dan Rebeiz, CA (2004) Anal. Biochem. 329, 207-219 44 Smith, AG dan Witty, M. (2001) Heme, Klorofil dan Bilins: Metode dan Protokol, 340 hlm, Humana Press, Totowa, NJ 45 Halket, JM, Waterman, D., Przyborowska, PM, Patel, RKP, Fraser, PD dan Bramley, AM (2005) J. Exp. Bot. 56, 219-243 46 Gough, SP, Petersen, BO dan Duus, JO (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 6908-6913 47 Ausio, X., Grimalt, JO, Ozalla, D. dan Herrero, C. (2000) Anal. Chem. 72, 4874-4877 48 Lim, CK, Razzaque, MA, Luo, J. dan Petani, PB (2000) Biochem. J. 347, 757-761 Diterima 28 April 2005